JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:17 min. • August 29th, 2025
Inizia con una provetta contenente un gradiente di densità discontinuo preimpostato, preparato utilizzando particelle di silice colloidale non tossiche rivestite con polivinilpirrolidone.
Il gradiente comprende tre strati non sovrapposti disposti in ordine crescente di densità dall'alto verso il basso.
Prendiamo una libreria di mutanti di trasposoni batterici, una sospensione aggregata di ceppi batterici con mutazioni casuali indotte da trasposoni.
Un sottoinsieme di queste mutazioni distrugge i geni che regolano la capsula, uno strato di polisaccaridi che circonda la parete cellulare batterica, dando luogo a ceppi con quantità variabili di capsule.
Aggiungi la libreria batterica all'inizio del gradiente molto lentamente, senza mescolare l'interfaccia.
Centrifugare la provetta a velocità moderata.
Il gradiente facilita la migrazione differenziale dei batteri in base alla loro quantità di capsule.
I ceppi iper-capsulati, essendo meno densi a causa del loro strato polisaccaridico idratato, si localizzano vicino alla parte superiore.
I ceppi debolmente incapsulati si depositano nel mezzo e i ceppi non incapsulati e più densi migrano verso il fondo.
I ceppi batterici separati sono pronti per l'analisi a valle.
Aggiungere con cautela 600 microlitri delle cellule preparate alla sommità del gradiente nel tubo. Quindi posizionare il tubo in un adattatore per tubi e pesare il tubo con l'adattatore per garantire l'equilibrio. Successivamente, posizionare l'adattatore della provetta in un rotore ad angolo fisso all'interno di una centrifuga da banco e centrifugare la provetta per 30 minuti a 3.000 g.
Infine, dopo la centrifugazione, rimuovere con cura la provetta, posizionarla in una griglia e fotografare i risultati.