Espressione proteica libera da cellule utilizzando un estratto di cellule grezze batteriche
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:32 min. • October 30th, 2025
Un sistema di espressione proteica cell-free utilizza un lisato cellulare grezzo batterico, che contiene il macchinario molecolare essenziale per la trascrizione e la traduzione in vitro.
Questo lisato include fattori di trascrizione, ribosomi e RNA di trasferimento (tRNA).
Aggiungere al lisato una miscela contenente un modello di DNA, l'RNA polimerasi, i nucleotidi e gli amminoacidi.
Trasferirlo in una piastra PCR e centrifugare per raccogliere il liquido che si attacca alle pareti. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.
Incubare in un termociclatore a una temperatura ottimale per supportare l'espressione proteica libera da cellule.
Il fattore di trascrizione si associa all'RNA polimerasi per formare un complesso che si lega al DNA stampo.
Questo complesso catalizza la sintesi dell'RNA, incorporando nucleotidi per generare un RNA messaggero (mRNA).
L'mRNA recluta i ribosomi, che avviano la traduzione, durante la quale i tRNA rilasciano gli amminoacidi corrispondenti per formare una catena polipeptidica.
Il polipeptide si ripiega in una proteina funzionale, pronta per le applicazioni a valle.
Per eseguire l'espressione proteica libera da cellule utilizzando il modello di DNA, scon
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