Espressione proteica libera da cellule utilizzando un estratto di cellule grezze batteriche

Un sistema di espressione proteica cell-free utilizza un lisato cellulare grezzo batterico, che contiene il macchinario molecolare essenziale per la trascrizione e la traduzione in vitro.

Questo lisato include fattori di trascrizione, ribosomi e RNA di trasferimento (tRNA).

Aggiungere al lisato una miscela contenente un modello di DNA, l'RNA polimerasi, i nucleotidi e gli amminoacidi.

Trasferirlo in una piastra PCR e centrifugare per raccogliere il liquido che si attacca alle pareti. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.

Incubare in un termociclatore a una temperatura ottimale per supportare l'espressione proteica libera da cellule.

Il fattore di trascrizione si associa all'RNA polimerasi per formare un complesso che si lega al DNA stampo.

Questo complesso catalizza la sintesi dell'RNA, incorporando nucleotidi per generare un RNA messaggero (mRNA).

L'mRNA recluta i ribosomi, che avviano la traduzione, durante la quale i tRNA rilasciano gli amminoacidi corrispondenti per formare una catena polipeptidica.

Il polipeptide si ripiega in una proteina funzionale, pronta per le applicazioni a valle.

Per eseguire l'espressione proteica libera da cellule utilizzando il modello di DNA, scongelare la master mix di soluzione energetica 10X, le aliquote della master mix di aminoacidi 4X e il modello di DNA a temperatura ambiente. Quindi rimuovere le scorte di RNA polimerasi T7 e inibitore dell'RNAsi dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e metterle sul ghiaccio. Una volta scongelati il modello di DNA, la master mix di soluzioni energetiche 10X e la master mix di aminoacidi 4X, metterli sul ghiaccio.

Preparare una miscela master di reazione priva di cellule aggiungendo ogni componente nell'ordine preciso a una provetta da due millilitri su ghiaccio e muovere delicatamente la provetta dopo ogni aggiunta alla miscela master. Rimuovere il lisato cellulare grezzo di Vibrio natriegens dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e metterlo in ghiaccio per 10-20 minuti fino a quando non si scongela. Aggiungere il volume appropriato di estratto di cellule grezze scongelate alla miscela master di reazione priva di cellule e mescolare delicatamente con una pipetta.

Per eseguire l'espressione proteica libera da cellule endpoint utilizzando il termociclatore, aggiungere prima 10 microlitri della miscela master di reazione libera da cellule per pozzetto del fondo di una piastra PCR a 96 pozzetti, assicurandosi di miscelare la miscela master muovendo delicatamente la provetta tra ogni trasferimento alla piastra PCR. Centrifugare la piastra a 1.000 volte g per 10 secondi per raccogliere l'eventuale miscela master che potrebbe essere rimasta attaccata ai lati dei pozzetti. E poi sigillare i pozzetti con un adesivo per piastre per evitare l'evaporazione.

Posizionare la piastra in un termociclatore impostato a 26 gradi Celsius con un coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius. Dopo aver incubato le reazioni nella piastra PCR per un minimo di tre ore, le proteine espresse possono essere purificate, quantificate e utilizzate per i processi a valle.