Name: Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine per cristallizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri un protocollo rapido per l'espressione di proteine glicosilate in cellule 293F di mammifero. Questo metodo garantisce elevate rese di proteine nativamente piegate adatte a studi strutturali e cristallografici.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH R01-HL119813 (a T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (a T.J.B.), una sovvenzione pilota e di fattibilità CIMED (a T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (a Z.Y.) e 15PRE22110004 (a D.L.K.).

1. Produzione di milligrammo quantità di DNA plasmidi per larga scala trasfezione transiente <ol><li> Clonare la proteina di interesse in un alto numero di copie di mammifero vettore di espressione mediante clonazione sito di restrizione, o altra tecnica appropriata. <ol><li> Per ottenere risultati ottimali, utilizzare pHLsec 7 vettore, che ha un built-in C-terminale 6His-tag, un promotore forte sequenza di Kozak e un segnale di secrezione ottimizzato. </li></ol></li><li> Trasforma il plasmide sulle cellule competenti. <ol><li> Aggiungere 20 ml di cellule competenti di E. coli su 1 pg di DNA plasmidico e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Cellule shock termico a 42 ° C per 35 secondi, poi incubare in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 300 ml di mezzo di crescita microbica (SOC) e incubare a 37 ° C per 45 minuti, agitando a 220 rpm. </li><li> Cellule piastra sulla piastra di agar con un&#39;appropriata selezione antibiotica. <ol><li> Utilizzare 100 mg / ml carbenicillina se il plasmide è nel vettore pHLsec. </li></ol></li></ol></li><li> Colonie culturali in 250 ml di Luria Broth (LB) Supporto integrato con 100 mg / ml antibiotico (carbenicillina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 giri al minuto. </li><li> Purificare il DNA dalla cultura con Hi-Speed ​​plasmidi Maxi Kit secondo il protocollo del produttore. <ol><li> Eluire DNA in tampone EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), invece di tampone TE. </li><li> Aliquota il plasmide purificato in quantità necessaria per la trasfezione e conservare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Su larga scala, Cultura e transitoria Transfection di 293F Cells <ol><li> Supplemento 1 L 293F media con 10 ml di glutammina e 5 ml Pen / Strep (entrambi 100x). Conservare a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep è una forza sufficiente in condizioni di libero-siero e la concentrazione di antibiotico ridotto migliora la vitalità delle cellule durante la trasfezione, che migliora le rese di proteine. </li><li> Cultura cellule 293F in 300 ml media in 1 L policarbonato sconcertato beute con tappo ventilatos a 37 ° C con 8% di CO 2, agitando in uno standard di coltura tissutale incubatore. </li><li> Diluire le cellule per 5 x 10 5 / ml densità un giorno prima trasfezione. </li><li> Il giorno della trasfezione, supplemento mezzo di coltura aggiungendo 10% del volume di 2% w / v Boost cellulare in 293F media. <ol><li> Misurare la concentrazione di glucosio usando un monitor di glucosio in base alle istruzioni del produttore e utilizzare integratori come necessario per ottenere una concentrazione di glucosio di 500 mg / dL. </li></ol></li><li> Aggiungere kifunensine (1 mg / ml concentrazione finale) in questa fase per controllare glicosilazione delle proteine. </li><li> Calcolare il volume di DNA richiesto per 1 ug plasmide per 1 x 10 6 cellule. In condizioni sterili, diluire DNA in mezzo privo di siero 5 ml. </li><li> Calcolare il volume di reagente trasfezione richiesto per 1 mg plasmide per 2 ml reagente di trasfezione. In condizioni sterili, diluire il reagente trasfezione (PEI-TMC-25) in mezzo privo di siero 5 ml. </li><li> Aggiungerereagente di trasfezione in soluzione di DNA con incrementi di 1 ml, mescolando delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT per complessi DNA-reagente per formare. Quindi aggiungere la soluzione sulle celle in maniera goccia a goccia. </li><li> Consentono alle cellule trasfettate di esprimere proteine ​​per 72-96 ore. Supplemento con ~ media il 10% del volume Boost cellulare al giorno o, se necessario, per mantenere il glucosio lettura 400-600 mg / dl. </li></ol> 3. Purificazione <ol><li> Decantare cultura in un pallone centrifuga, centrifugare per 20 minuti a 1300 xg per pellet cellule e quindi raccogliere il surnatante. Se necessario, girare una seconda volta e / o l&#39;uso del filtro 0,22 micron per chiarire surnatante. </li><li> Aggiungere 10% del volume 10x Ni-NTA tampone di legame (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazolo). </li><li> Preparare una colonna gravità aggiungendo 2 ml di Ni-NTA slurry in una colonna e equilibrante con 10 volumi di colonna (CV) di 1x tampone di legame. Se possibile, fare tutti i passi di colonna in una camera a 4 ° C. Alternatively, proteine ​​freddo e tutti i buffer sul ghiaccio prima del passaggio della colonna, e mantenere proteine ​​e raccolti a flusso continuo su ghiaccio. Nota: Ni-NTA slurry è del 50% in volume di resina e indicato capacità legante della produzione è di 50 mg / ml. Ni-NTA sfere possono essere ricaricate per molteplici usi </li><li> Flusso surnatante sulla resina e raccogliere flow-through. Ripetere questo passaggio. </li><li> Lavare con 10 CV di tampone di lavaggio (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazolo pH 8). </li><li> Eluire la proteina in 5 CV di tampone di eluizione (NaCl 300 mM, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazolo pH 8). </li><li> Se è richiesta deglycosylation: <ol><li> Per un volume finale di 0,5 ml, concentrato eluato a 0,43 ml utilizzando un concentratore centrifugazione. Se precipita modulo, sedimentare i detriti per centrifugazione a 16.000 xg e 4 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml di 500 mM Na-citrato pH 5,5. </li><li> Aggiungere 20 ml di EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubare a temperatura ambiente per 2 ore. None: L&#39;enzima funziona in modo ottimale a 37 ° C, che può causare la proteina concentrata per aggregare. Estendere l&#39;incubazione RT, se deglicosilazione, valutata mediante SDS-PAGE o immunoblotting, è incompleta. L&#39;enzima non ha attività a 4 ° C. </li><li> Per rimuovere EndoHf: Lavare amilosio resina 3x in tampone fosfato (PBS) o tampone di stoccaggio definitivo. Incubare proteine ​​con resina per 1 ora a 4 ° C. Spin 5 min a 1000 xg per far sedimentare perline e raccogliere il surnatante. </li><li> Concentrato di proteine ​​utilizzando appropriato filtro centrifugazione peso molecolare cutoff e buffer di scambio nel buffer di memoria (150 mM NaCl e 20 mM HEPES pH 7.5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
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<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Cellule HEK 293F offrono produzione robusta di proteine ​​che richiedono modificazioni post-traslazionali. Questo sistema permette l&#39;espressione rapida e scalabile di proteine ​​ripiegate in modo nativo contenenti disolfuri, glicosilazione e fosforilazione che altrimenti assente utilizzando più strumenti di espressione di routine. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per l&#39;espressione e la purificazione di complessi multi-proteici semplicemente co-trasfezione di plasmidi multipli. Oltre TREM2, questo si...

La comprensione della struttura delle proteine ​​a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine ​​è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l&#39;ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine ​​secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali. Proteine ​​batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine ​​cristallizzate depositate nel Protein Data Bank 1. Sistemi di espressione batterici sono largamente preferibili perché sono veloci, poco costosi e producono tipicamente alte rese di proteine. Tuttavia, i domini extracellulari di proteine ​​di mammifero espresse in batteri sono spesso non correttamente ripiegate, in cui sono richiesti caso refolding ed estesa purificazione passi per ottenere omogeneamente foproteine ​​lded. Inoltre, molte proteine ​​di mammiferi necessitano di glicosilazione post-traslazionale per ottenere una corretta piegatura 2. Anche se l&#39;espressione e glicosilazione in cellule di lievito o di insetto in grado di superare il problema ripiegamento, modificazioni post-traslazionali, tra cui glicosilazione, differiscono significativamente da quelle delle cellule di mammifero 3, producendo proteine ​​con modifiche non corrette o non omogenei. Le cellule di mammiferi esprimono tutta la macchinario molecolare necessario per garantire un&#39;adeguata modificazioni post-traslazionale e pieghevoli; Tuttavia, questi sistemi di espressione non sono tipicamente preferiti dalla maggior parte laboratori, a causa di rendimenti limitati e costi elevati di reagenti e materiali di consumo. Polietilenimmina (PEI), un reagente di trasfezione standard è relativamente a buon mercato, ma impone una notevole citotossicità e la bassa efficienza di trasfezione, con conseguente aumento dei costi a supporto delle cellule, il DNA, e attrezzature coltura. Molte alternative al PEI sono proibitivi. Ci rivolgiamoquesti problemi descrivendo una combinazione di migliori strumenti di coltura cellulare e chimicamente modificati PEI per il metodo rapido e relativamente poco costoso per l&#39;espressione di proteine ​​secrete mammifero, seguita da purificazione passo singolo. Questo metodo robusto fornisce rendimenti sufficienti per studi funzionali e biochimici 4, e in alcuni casi, si traduce in proteine ​​suscettibili di cristallizzazione senza ulteriore purificazione. Questo protocollo descrive diverse tecniche per massimizzare l&#39;espressione e la resa per le proteine ​​di mammiferi secrete nel rene embrionali umane (HEK) 293F cellule coltivate in sospensione. Efficienza di trasfezione (e costo), la produzione di proteine ​​e purificazione sono tutti sempre maggiore seguendo questo protocollo. PEI modificato con l&#39;aggiunta di carbammati per reazione apertura d&#39;anello singolo step (PEI-TMC-25, sintesi e proprietà descritte in dettaglio ref 5) migliora notevolmente l&#39;efficienza di trasfezione, riduce la citotossicità da cationicorottura della membrana e di conseguenza riduce i costi di sperimentazione. Inoltre, la vitalità cellulare e l&#39;espressione della proteina sono notevolmente migliorate con l&#39;aggiunta di supplementi di coltura per la fornitura di glucosio e vitamine. È importante sottolineare che per la produzione di proteine ​​glicosilate, il trattamento con kifunensine, un inibitore chimico non tossico di Mannosidase I, produce proteine ​​con definite, glycans immaturi, che possono essere rimossi dal EndoHf endoglicosidasi per produrre proteine ​​con un singolo N-acetilglucosamina al posto di un full-length glicano 6 N-linked. Infine, la secrezione di proteine ​​in un mezzo chimicamente definito privo di siero consente purificazione rapida e facile per studi strutturali e biochimici. Single-step acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) purificazione resina rimuove la maggior parte dei contaminanti specie nel surnatante e, in alcuni casi, può produrre proteine ​​di purezza sufficiente per cristallizzazione.

<table><tbody><tr><td>Fiasche di coltura</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Utilizzo al posto del</td></tr><tr><td>reagente di trasfezione Glutammine Hype 5</td><td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>reagente di trasfezione 293fectin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>reagente di trasfezione PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Resina di amilosio</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Integratore per colture cellulari</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>Sistema di monitoraggio del glucosio</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Terreno privo di siero per trasfezione di DNA</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Competent Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente espressione cellulari di mammifero e passo singolo purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

La produzione di proteine secrete nei mammiferi per studi strutturali e biofisici può essere impegnativa, dispendiosa in termini di tempo e costosa. Qui descritto è un protocollo efficiente in termini di tempo e costi per l'espressione di proteine secrete in cellule di mammifero e la purificazione in un'unica fase utilizzando la cromatografia di affinità con nichel. Il sistema si basa sulla trasfezione transitoria su larga scala di cellule di mammifero in sospensione, che riduce notevolmente il tempo di produzione delle proteine, in quanto elimina passaggi come lo sviluppo di virus di espressione o la generazione di linee cellulari ad espressione stabile. Questo protocollo utilizza agenti di trasfezione economici, che possono essere facilmente prodotti con una semplice modifica chimica, o agenti di trasfezione a prezzo moderato, che aumentano la resa grazie a una maggiore efficienza di trasfezione e a una minore citotossicità. Un attento monitoraggio e mantenimento dei livelli di glucosio nei terreni aumenta la resa proteica. Il controllo della maturazione dei glicani nativi nella fase di espressione aumenta la resa finale di proteine di mammifero correttamente ripiegate e funzionali, che sono proprietà ideali per perseguire la cristallografia a raggi X. In alcuni casi, la purificazione in un singolo passaggio produce proteine di purezza sufficiente per la cristallizzazione, che è dimostrato qui come caso di esempio.

Qui di seguito i risultati di questo sistema di espressione applicata ad un dominio secreto 13 kDa immunoglobuline (Ig) dalla proteina di attivazione del recettore umano espresso sulle cellule mieloidi (2 hTREM2, residui 19-132). TREM2 è una proteina transmembrana di tipo I che contiene un singolo dominio extracellulare Ig che ha due ponti disolfuro e due siti di glicosilazione N-linked. A differenza di molte altre proteine ​​dominio Ig 8, TREM2 non era suscettibile di ripiegamento da corpi di inclusione batt...

Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di espressione proteica nei mammiferi è produrre quantità nell'ordine del milligrammo di proteine correttamente ripiegate, adatte a studi strutturali, biofisici e funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un protocollo rapido e semplice per ottenere proteine secretorie di mammiferi in concentrazioni e purezza adeguate per studi strutturali. In generale, osserviamo che la maggior parte dei problemi legati al rendimento proteico è dovuta alla salute e vitalità delle cellule.Monitorando attentamente la vitalità cellulare e anche i livelli di zucchero nel mezzo, si migliora notevolmente la resa proteica e si prolunga l'utilizzabilità delle cellule. È inoltre molto importante monitorare la densità cellulare. Abbiamo osservato che, se in qualsiasi momento precedente alla trasfezione le cellule superano i 2 milioni di cellule per millilitro, la resa proteica risulta fortemente ridotta. Per eseguire una coltura su larga scala di cellule 293F, aggiungere a un litro di mezzo 293F 10 millilitri di glutammina 100x e 5 millilitri di penicillina-streptomicina 100x.L'antibiotico è a una concentrazione sufficiente in condizioni senza siero e la concentrazione ridotta di antibiotico migliora la vitalità cellulare durante la trasfezione, il che incrementa i rendimenti proteici della coltura. Coltivare le cellule 293F in 300 millilitri di mezzo in un matraccio Erlenmeyer in policarbonato da un litro con alette e tappo aerato a 37 gradi Celsius con il 8% di anidride carbonica, sotto agitazione, in un incubatore standard per colture cellulari un giorno prima della trasfezione; diluire le cellule a una densità di 0,5 milioni di cellule per millilitro nel giorno della trasfezione. Introdurre nel mezzo di coltura il 10% in volume di un integratore al 2% peso/volume (Cell Boost) nel mezzo per cellule 293F.Aggiungere kafu osservato in questo passaggio per controllare la glicosilazione delle proteine. Preparare le soluzioni di DNA e del reagente di trasfezione in mezzo privo di siero e incubare per cinque minuti. Successivamente, aggiungere il reagente di trasfezione alla soluzione di DNA in incrementi di un millilitro, mescolando.Incubare delicatamente per 30 minuti a temperatura ambiente per permettere la formazione dei complessi di DNA del reagente. Quindi aggiungere la soluzione sulle cellule in modo goccia a goccia, lasciando esprimere la proteina alle cellule transfezionate per 72-96 ore al fine di purificare la glicoproteina. Prima di tutto, versare con cura il terreno di coltura in un matraccio da centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 1300 G. Per formare il pellet cellulare, raccogliere il soprannatante e, se necessario, centrifugare una seconda volta e/o utilizzare un filtro da 0,22 micron per chiarificare il soprannatante.Successivamente, aggiungere un volume pari al 10% di 10 x nickel nitro load, tri acetic acid o buffer di legame nickel NTA. Quindi preparare una colonna a gravità a quattro gradi Celsius aggiungendo due millilitri della sospensione di nickel NTA in una colonna ed equilibrando con 10 volumi di colonna di buffer di legame 1 x, operando a quattro gradi Celsius. Far passare il soprannatante sulla resina e raccogliere il flusso in uscita.Dopo aver versato il flusso del soprannatante, lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Quindi eluire la proteina con cinque volumi di colonna di tampone di eluizione. Se è richiesta una deglicosilazione per un volume finale di 0,5 millilitri, concentrare l'EIT fino a 0,43 millilitri utilizzando un concentratore a centrifuga, quindi rimuovere qualsiasi detrito mediante centrifugazione a 16.000 ×g e a 4 gradi Celsius.Quindi aggiungere 50 microlitri di citrato di sodio 500 millimolari, pH 5,5 e 20 microlitri di endo hf. Incubare la miscela a temperatura ambiente per due ore per rimuovere l'endo HF; quindi lavare la resina amylosa tre volte in soluzione salina fosfato tamponata. Incubare la proteina con la resina lavata per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione, centrifugare per cinque minuti a 1000 G per formare il pellet della resina e raccogliere il surnatante. Concentrare la proteina utilizzando un filtro a centrifugazione con cutoff di peso molecolare appropriato ed effettuare lo scambio del tampone nel tampone di conservazione indicato. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di un gel SDS-PAGE per una proteina secreta espressa in cellule trattate con cine dopo cromatografia per affinità al nichel.La prima corsia corrisponde alla proteina prima della deglicosilazione, e la seconda corsia alla proteina dopo la deglicosilazione mediante endo hf. La proteina glicosilata migra circa 10 chilodalton più in alto e poi si riduce a una singola banda compatibile con il peso molecolare previsto dopo la deglicosilazione, a seguito del singolo passaggio di purificazione. I cristalli sono stati ottenuti utilizzando il metodo della goccia sospesa.L'immagine superiore mostra il primo risultato di cristallizzazione, mentre l'immagine inferiore mostra le condizioni di cristallizzazione ottimizzate. Questo dimostra che l'omogeneità biochimica della proteina di interesse può rappresentare un fattore determinante per il successo della cristallizzazione, e che un sistema di espressione mammifero ottimizzato produce proteine adatte a tale cristallizzazione. Un'ulteriore purificazione della proteina purificata con nichel può essere facilmente eseguita mediante cromatografia di esclusione molecolare.Questo è anche un passaggio utile per valutare la produzione proteica e ottimizzare le condizioni al fine di ottenere proteine correttamente ripiegate. La proteina di interesse dovrebbe essere la specie principale nell'eluito cromatografico, e il volume di eluizione dovrebbe corrispondere al peso molecolare della proteina. Tempi di eluizione anticipati potrebbero suggerire aggregazione o ripiegamento anomalo della proteina, una volta acquisita padronanza della tecnica.Questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere condizioni sterili per la coltura cellulare. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come esclusione dimensionale, cromatografia, spettroscopia a diffusione multiangolare della luce e fluorometria a scansione differenziale, al fine di valutare lo stato di oligomerizzazione e la stabilità termica della proteina.

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L'espressione di proteine ricombinanti da parte dei sistemi dei mammiferi sta diventando un metodo attraente per la produzione di complessi proteici per la biologia strutturale. Qui presentiamo un sistema di espressione semplice ma altamente efficiente che utilizza cellule di mammifero cresciute in sospensione per purificare complessi proteici per studi strutturali.

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Descriviamo qui un sistema di espressione granzima efficiente in termini di costi utilizzando cellule HEK293T che produce alte rese di proteasi pura, completamente glicosilata ed enzimaticamente attiva.

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Vi presentiamo gli approcci per la caratterizzazione biofisica e strutturale delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina biolayer interferometria, calorimetria isotermica di titolazione e cristallografia a raggi x.

Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

La purificazione dei canali ionici è spesso provocatorio, ma una volta raggiunto, potenzialmente può permettere le indagini in vitro delle funzioni e delle strutture dei canali. Qui, descriviamo le procedure graduale per l'espressione e purificazione delle proteine di mammiferi bestrophin, una famiglia di Ca2 +-attivato canali Cl– .

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Questo protocollo descrive una configurazione per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 viene ricostituito in bicelle per la cristallizzazione a goccia sospesa. Il protocollo non richiede materiali o substrati specializzati, il che lo rende accessibile e facile da adattare in qualsiasi laboratorio per determinare la struttura della proteina attraverso la cristallografia a raggi X.

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Scopri un protocollo rapido per l'espressione di proteine glicosilate in cellule 293F di mammifero. Questo metodo garantisce elevate rese di proteine nativamente piegate adatte a studi strutturali e cristallografici.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione (Video) | JoVE Journal

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

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