Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

L'obiettivo generale di questa tecnica di espressione proteica nei mammiferi è quello di produrre quantità di milligrammi di proteine ripiegate in modo nativo adatte a studi strutturali, biofisici e funzionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un protocollo rapido e semplice per ottenere proteine di mammifero secrete e una concentrazione di purezza richiesta per gli studi strutturali. In generale, scopriamo che la maggior parte dei problemi con la resa proteica sono dovuti alla salute e alla vitalità delle cellule.

Monitorando attentamente la vitalità cellulare e monitorando anche i livelli di zucchero dei terreni, si migliora notevolmente sia la resa proteica che si prolunga l'utilità delle cellule. È anche molto importante monitorare la densità cellulare. Scopriamo che se in qualsiasi momento prima della trasfezione le cellule superano i 2 milioni di cellule per millilitro, la resa proteica è notevolmente ridotta Per eseguire una coltura su larga scala di 2 cellule 93 F integrare un litro di 2 terreni 93 F con 10 millilitri di 100 x glutammina e cinque millilitri di 100 x streptococco in penna.

L'antibiotico ha una forza sufficiente in condizioni di assenza di siero e la ridotta concentrazione di antibiotico migliora la vitalità cellulare durante la trasfezione, migliorando la resa proteica in coltura. Le 2 93 cellule F in 300 millilitri di terreno in fiasche di erlenmeyer da un litro, in policarbonato con tappi ventilati a 37 gradi Celsius con l'8% di anidride carbonica, agitate in un incubatore standard per colture tissutali un giorno prima della trasfezione, diluiscono le cellule a 0,5 milioni di cellule per millilitro di densità il giorno della trasfezione. Integrare il terreno di coltura aggiungendo il 10% di volume del 2% in peso per volume di aumento delle cellule in 2 terreni da 93 F.

Aggiungi il kafu in questa fase per controllare la glicosilazione delle proteine. Preparare le soluzioni di DNA e reagenti di trasfezione in terreni privi di siero e incubare per cinque minuti. Quindi, aggiungere il reagente di trasfezione nella soluzione di DNA con incrementi di un millilitro, mescolando.

Incubare delicatamente per 30 minuti a temperatura ambiente per formare complessi di DNA reagenti. Quindi aggiungere la soluzione sulle cellule In modo gocciolante, lasciare che le cellule trasfettate esprimano le proteine per 72-96 ore per purificare la glicoproteina. Per prima cosa decantare la coltura in un pallone da centrifuga per 20 minuti a 1300 Gs.To pellettare le cellule, raccogliere il supernat e, se necessario, centrifugare una seconda volta e/o utilizzare un filtro da 0,22 micron per chiarificare il surnatante.

Quindi, aggiungere il 10% in volume di 10 x carico di nichel nitro, acido triacetico o tampone legante NTA di nichel. Quindi preparare una colonna a gravità a quattro gradi Celsius aggiungendo due millilitri di impasto NTA di nichel a una colonna ed equilibrando con 10 volumi di colonna di un tampone legante x che lavora a quattro gradi Celsius. Far scorrere il surnatante sulla resina e raccogliere il flusso.

Dopo aver versato il surnatante, far fluire sulla colonna, lavare con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Quindi eluire la proteina in cinque volumi di colonna di tampone di eluizione. Se è necessaria la deglicosilazione per un volume finale di 0,5 millilitri, concentrare l'EIT a 0,43 millilitri utilizzando un pellet concentratore per centrifugazione eventuali detriti mediante centrifugazione a 16.000 GS e quattro gradi Celsius.

Quindi aggiungere 50 microlitri di citrato di sodio 500 millimolare, pH 5,5 e 20 microlitri di endo hf. Incubare la miscela a temperatura ambiente per due ore per rimuovere la resina di amilosio endo HF prima lavare tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato. Incubare la proteina con la resina lavata per un'ora a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, centrifugare per cinque minuti a 1000 Gs per pellettare la resina e raccogliere il surnatante. Concentrare la proteina utilizzando un appropriato cutoff del peso molecolare, un filtro di centrifugazione e lo scambio del tampone nel tampone di conservazione mostrato. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi della pagina SDS per una proteina secreta espressa in cellule trattate con cine dopo cromatografia di affinità al nichel.

La prima corsia è la proteina prima della deglicosilazione e la seconda corsia è la proteina che segue la deglicosilazione da parte di endo hf. La proteina glicosilata corre circa 10 kilodalton più in alto e poi collassa in una singola banda coerente con il peso molecolare previsto dopo la deglicosilazione, dopo la singola fase di purificazione. Gli schermi di cristallo sono stati allestiti utilizzando il metodo della goccia sospesa.

L'immagine in alto mostra il colpo iniziale del cristallo e l'immagine in basso mostra le condizioni di cristallizzazione ottimizzate. Ciò dimostra che l'omogeneità biochimica della proteina di interesse può essere un fattore determinante per il successo della cristallizzazione e che un sistema di espressione ottimizzato nei mammiferi produce proteine suscettibili di questa cristallizzazione. Un'ulteriore purificazione delle proteine purificate con nichel viene prontamente eseguita mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.

Questo è anche un passo utile verso la valutazione della produzione proteica e l'ottimizzazione delle condizioni per produrre proteine correttamente ripiegate. La proteina di interesse dovrebbe essere la specie principale nell'eluizione cromatografica e il volume di eluizione dovrebbe corrispondere al peso molecolare della proteina. Precedentemente. I tempi di EEU possono suggerire l'aggregazione o il ripiegamento errato della proteina Una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere le condizioni sterili per la coltura cellulare Seguendo questa procedura. Altri metodi come la dimensionalizzazione, la cromatografia di esclusione, la diffusione della luce multi-angolo e la scansione differenziale, la fluorometria possono essere eseguiti per valutare lo stato di olizzazione e la stabilità termica della proteina.