Quantificazione del carico batterico tissutale in un modello murino di infezione intestinale cronica

Si inizia con un topo soppresso infettato da un ceppo batterico resistente agli antibiotici che modella un'infezione intestinale cronica.

Esponi la cavità addominale per accedere al ceco e alla milza.

Prelevare i tessuti cecali e splenici, che rappresentano i siti intestinali e sistemici di colonizzazione batterica.

Inserire ogni fazzoletto in un tubo separato contenente un tampone e una perla d'acciaio.

Omogeneizzare il tessuto agitando rapidamente i tubi, facendo sì che le perline d'acciaio colpiscano il tessuto, lo degradino e rilasciano batteri nella sospensione.

Eseguire diluizioni seriali degli omogeneati nel tampone per ridurre la concentrazione batterica.

Aliquote a piastra da ogni diluizione su agar nutritivo integrato con un antibiotico per recuperare selettivamente i batteri resistenti agli antibiotici.

Incubare le placche per permettere ai batteri vitali di crescere in colonie.

Contare le colonie per stimare il numero di batteri vitali per grammo di tessuto e confrontare i carichi batterici nel ceco e nella milza.

Per prima cosa, posiziona microtubi a fondo tondo da 2 millilitri con chiusura di sicurezza, aggiungi 1 millilitro di PBS sterile e una perla in acciaio inox autoclavato a ciascun tubo. Prepesa i tubi prima della raccolta del tessuto.

Dopo l'eutanasia dei topi, resezionare i loro tessuti cecali e splenici, assicurandosi di raccogliere i tessuti dei singoli animali in tubi separati. Pesa ogni tubo per determinare il peso dei tessuti.

Usa un impianto miscelatore per omogeneizzare i tessuti a 30 hertz per 15 minuti. Poi, trasferire 900 microlitri di PBS in ciascun pozzo di un megablocco da 2 millilitri da 96 pozzi. Pipetta 100 microlitri di tessuto che si omogeneano nel primo pozzo e mescola bene.

Eseguire diluizioni seriali aggiungendo 100 microlitri ai pozzi successivi, fino a ottenere una diluizione da 10 alla sesta negativa. La lastra di 10 microlitri di ogni diluizione triplica su agar LB che contiene Streptomicina. Poi, contare le unità medie di formazione di colonie e determinare le unità di formazione di colonie per grammo di tessuto come indicato nel protocollo testuale.