Crescita di un biofilm polimicrobico rilevante per la fibrosi cistica per sondare i fenotipi della comunità

Stiamo cercando di capire come si comportano i microbi quando vengono cresciuti in condizioni che imitano le condizioni della vita reale, con l'obiettivo di determinare i meccanismi che guidano i cambiamenti fenotipici nelle comunità multi-specie rispetto alla crescita delle monocolture. Attraverso l'utilizzo di questo sistema in vitro, abbiamo caratterizzato una via molecolare che guida i recalcitranti di Pseudomonas aeruginosa, un noto patogeno nel contesto delle infezioni delle vie aeree da fibrosi cistica. Grazie al formato della piastra a 96 pozzetti e alle condizioni di crescita che riflettono quelle osservate nel polmone della fibrosi cistica, possiamo esplorare facilmente un'ampia gamma di interazioni del microbioma.

Abbiamo acquisito informazioni sui meccanismi alla base della suscettibilità dei microbi agli antimicrobici in un contesto completamente microbioma. Il nostro modello funge da ponte tra le osservazioni cliniche e il lavoro di laboratorio individuale nella ricerca sulla fibrosi cistica, offrendo uno strumento prezioso per lo studio di varie interazioni del microbioma. Per iniziare, prepara tutti i reagenti e i terreni necessari.

Per l'esperimento di co-coltura, centrifugare le colture batteriche durante la notte e lavare le cellule con PBS sterile. Dopo la centrifugazione, scartare con cura il surnatante e risospendere ogni pellet in un millilitro di terreno di espettorato artificiale diluito in acqua 1X o base ASM. Misura la densità ottica da 1 a 10 campioni diluiti a 600 nanometri in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre.

Diluire ogni campione batterico fino a una densità ottica finale a 600 nanometri di 0,01 e agitare accuratamente per cinque secondi. Aggiungere 100 microlitri di sospensioni di monocoltura e co-coltura a tre pozzetti separati di una piastra sterile di plastica a fondo piatto da 96 pozzetti e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in condizioni anossiche. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere le cellule planctoniche non attaccate e reintegrare i biofilm preformati con 100 microlitri di ASM fresco o il reagente di trattamento desiderato.

Dopo aver aspirato le cellule planctoniche, lavare delicatamente i biofilm due volte con 125 microlitri di PBS sterile e scartare la soluzione di lavaggio. Aggiungere 50 microlitri di PBS sterile. E usando un replicatore a 96 pin, ho raschiato delicatamente le cellule dalla piastra.

Trasferire le cellule del biofilm risospese nella fila A di una nuova piastra sterile a 96 pozzetti ed eseguire una diluizione seriale 10X. Piastra da tre a cinque microlitri di ciascun campione di diluizione sulle piastre di agar. Dopo che le macchie di inoculazione si sono asciugate, incubare le piastre in modo appropriato.

Sono stati osservati diversi fenotipi, tra cui una riduzione del numero di cellule vitali di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus quando cresciuti in una comunità planctonica mista rispetto alla monocoltura. È stato osservato un aumento della crescita polimicrobica di Streptococcus sanguinis e una crescita in comunità mista di Prevotella melaninogenica.