Name: Luso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri come coltivare biofilm batterici con reattori a flusso gocciolamento e a disco rotante per Staphylococcus aureus. Questi metodi permettono di studiare la morfologia e la biomassa dei biofilm in condizioni controllate.

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1. La goccia di flusso reattore Biofilm <ol><li> Il flusso del reattore a goccia biofilm (disponibile da Technologies Biosurface o versioni progettate su misura di solito può essere fatta da officine meccaniche università, vedi figura 1) è assemblato e autoclave. Assemblea coinvolge coupon apposizione in camere e coperchi della camera di fissaggio. La camera, insieme con il mezzo biofilm (brodo di soia trittico 2 grammi / L di glucosio e 2 grammi / L) e influente tubi nutrienti sono sterilizzati in autoclave. </li><li> Inoculazione del reattore flusso goccia è preformato posizionando il reattore su una superficie piana, le linee di serraggio tubi effluenti, riempiendo ogni camera con 10 ml di brodo di soia trittico e l'aggiunta di 10 L di una S. cultura aureus cresciute overnight in brodo di soia trittico. Il reattore viene inoculato svolge in un incubatore a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Dopo 18 ore di incubazione, il tubo emissario è unclamped e il reattore è posto su un blocco di legno tagliato ad un angolo di 10 °. </li><li> Asetticamente collegare il tubo influente nutriente per la bottiglia contenente il brodo di coltura in continuo flusso. Alimentare la linea di tubazione attraverso la pompa e il primo dei tubi eseguendo la pompa ad una velocità massima (varia a seconda del modello della pompa). </li><li> Una volta che il tubo influente è innescato fermare la pompa e collegare collegare aghi (22 gauge e da 1 pollice) alla fine di ogni provetta. Pulire il tappo di ingresso camera con etanolo pulire in modo asettico e inserire gli aghi attraverso il tappo di aspirazione. </li><li> Accendere la pompa e lasciare i media a sgocciolare lentamente (portata ~ 125 microlitri / minuto) sui coupon. I media dovrebbero flusso verso il basso lungo la cedola dal porto tappo di ingresso al porto effluenti. Far funzionare il reattore in flusso continuo per 2-5 giorni (a seconda dell'applicazione), controllando di tanto in tanto il reattore per il drenaggio adeguato. </li><li> Per raccogliere il flusso di biofilm reattore a goccia, fermare la pompa e rimuovere con attenzione gli aghi dal reattore. Il reattore può essere collocato su una superficie piana ed i tagliandi possono essere rimosse in modo asettico con pinza sterile. Se microscopia è desiderato, i tagliandi possono essere trattati di conseguenza (Figura 2B è un microscopio elettronico a scansione di un biofilm S. aureus cresciuto in un reattore a biofilm goccia a goccia). Se la quantificazione della biomassa biofilm o studi fisiologia sono l'obiettivo dello studio, il biofilm può essere rimosso dalla cedola con un raschietto cellulare. Tenendo il coupon con una pinza, raschiare delicatamente il biofilm fuori il buono in una provetta conica contenente tampone fosfato con un raschietto cellulare. Nota: per quantificare l'unità formanti colonia nel biofilm, è necessario omogeneizzare il biofilm raccolte con un tessuto omogeneizzatore di disaggregare grumi e formare una sospensione omogenea. Diversi modelli di omogeneizzatori tessuto sono adatti per questa applicazione. Utilizziamo un Fisher Scientific Tissuemiser Omogeneizzatore (prodotto # 15-338-420) alla massima velocità per 1 minuto per omogeneizzare campioni di biofilm. Il mancato omogeneizzare il biofilm si tradurrà in una sottostima delle unità formanti colonie presenti nel campione. </li></ol> 2. La rotazione del disco reattore Biofilm <ol><li> La rotazione del reattore biofilm disco (disponibile da disponibile da Technologies Biosurface o possono essere realizzati su misura, vedi figura 3) è assemblato e autoclave. Montare il reattore dal primo posto il disco rotante tagliandi nelle fessure del disco filatura e inserirlo in una da 1 litro bicchiere di vetro di una porta di overflow. Un numero 15-tappo di gomma con fori in esso per consentire il flusso dei media e aerazione è usato come il tappo del reattore. Il reattore, biofilm media (brodo di soia trittico 2 g / L di glucosio e 2 g / L) e quello in ingresso sono poi sterilizzati in autoclave. </li><li> La rotazione del reattore biofilm disco viene inoculato mettendo 250 ml di medium sterile all'interno del reattore, e l'aggiunta di 0,5 ml di una notte di S. cultura aureus coltivato in brodo di soia trittico. Il reattore è quindi posto su un piatto mescolate insieme a 250 giri al minuto e incubato per una notte alla temperatura desiderata. </li><li> Dopo 16 ore di incubazione collegare il tubo di ingresso alla porta sul serbatoio medio e collegarlo alla pompa peristaltica. La pompa è quindi accendere e il flusso impostato ~ 0,25 ml / min (flusso può essere modificato a seconda del tasso di crescita desiderato). </li><li> Dopo 24 ore fermare il reattore e asetticamente rimuovere il disco senza toccare i tagliandi biofilm. Rimuovere i tagliandi con pinza sterile e immergere ognuno in tampone fosfato di rimuovere i batteri debolmente collegato. </li><li> Per il test composto antimicrobico, i chip possono essere inseriti in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti composti di interesse. Dopo l'incubazione, i chip vengono trasferiti in tubi da 1,5 ml microcentrifuga contenente 1 ml di soluzione salina tampone fosfato e omogeneizzati con un fazzoletto omogeneizzatore per disperdere il biofilm intatto. </li><li> Le cellule sono poi diluiti seriale e placcato su terreno di agar nutriente per determinare microbismo Formiunità ng. </li><li> Nota: molte varianti possono essere effettuate sul protocollo di cui sopra. Per esempio, buoni disco rotante può essere rivestito con o fatti di potenziale anti-biofilm composti per testare l'efficacia. Disperdenti biofilm possono essere valutati anche in incubazione tagliandi in composti disperdente e quantificazione dei batteri attaccati contro distaccato. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Un esempio di un set up reattore a goccia flusso viene visualizzato se Figura 1. Dopo tre giorni di flusso abbondante biofilm si accumulano sulla superficie della cedola, figura 2A. La biomassa totale varia a seconda ceppi batterici e condizioni di crescita precisa. Un microscopio elettronico a scansione di un S. biofilm aureus cresciuto nel reattore flusso goccia è mostrato nella Figura 2B. Un reattore disco rotante è mostrato in figura 3A. Il protocollo descritto può essere adattato alle specifiche esigenze di generale qualsiasi microrganismo in grado di formare un biofilm. Figura 3B mostra il disco rotante con 18 dischi di plastica apposta. Questi disco-grown biofilm sono particolarmente adatti per i test antimicrobici e portare a risultati altamente riproducibili 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Il flusso di setup a goccia reattore. Componenti importanti sono etichettati. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esempio di un flusso goccia S. aureus biofilm. A) Il biofilm è stato coltivato per tre giorni, seguendo il protocollo descritto. Coperchi dai primi due camere del reattore vengono rimossi per mostrare il giallo S. aureus biofilm biomassa. B) Sacnning microscopio elettronico di una S. biofilm aureus cresciuto nel reattore flusso gocciolamento. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Il reattore disco rotante. A) Esempio di funzionamento di un reattore disco rotante. Componente chiave sono etichettati. B) Primo piano vista di un disco rotante.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Biofilm cresciuto nei reattori differenti spesso hanno caratteristiche diverse e ogni reattore ha applicazioni diverse. In questo lavoro, si descrive l&#39;uso di due reattori biofilm: un flusso reattore a goccia biofilm e un reattore disco rotante. Drip reattori di flusso sono utili per la coltivazione a basso biofilm taglio in un aria-liquido e sono adattabili ad una varietà di condizioni. Li troviamo estremamente conveniente per gli studi in cui una grande quantità di biomassa biofilm è auspicabile. Questa configuraz...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Reattori a Flusso per Gocciolamento</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Reattori a Disco Rotante</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso del flusso gocciolamento e reattori disco rotante per staphylococcus aureus analisi biofilm

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

La maggior parte dei microbi in natura si pensa di esistere come superficie associata comunità in biofilm 1. Biofilm batterici sono racchiusi all&#39;interno di una matrice e collegato a una superficie di 2. Formazione di biofilm e lo sviluppo sono comunemente studiate in laboratorio utilizzando sistemi batch come micropiastre o di flusso sistemi, come il flusso delle cellule. Queste metodologie sono utili per lo screening di librerie di mutanti e chimiche (micropiastre) 3 o crescente biofilm per la visualizzazione (celle di flusso) 4. Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per Staphylococcus aureus in crescita in due ulteriori tipi di biofilm sistema di flusso: il flusso del reattore a goccia biofilm e la rotazione del reattore biofilm disco. Drip reattori biofilm flusso sono progettati per lo studio dei biofilm cresciuto in condizioni di taglio basso. 5 Il reattore di flusso a goccia si compone di quattro canali di test in parallelo, ciascuno in grado di tenere uno standard microscopio cedola di vetro di dimensioni diapositiva o una lunghezza del catetere o stint. Il reattore di flusso a goccia è ideale per il monitoraggio microsensor, generale studi biofilm, i campioni di biofilm criosezionamento, la produzione di biomassa ad alta, valutazioni materiale medico, e dimora test del dispositivo medico. 6,7,8,9 Il reattore disco rotante è costituito da un disco di teflon che contiene recessi per cedole rimovibile. 10 Il coupon staccabile può in fatto di qualsiasi materiale lavorabile. La parte inferiore del disco rotante contiene una barra magnetica per consentire la rotazione del disco di creare taglio liquido sulla superficie-superficie a filo coupon. L&#39;intero disco contenente 18 tagliandi è posto in un recipiente di vetro 1000 ml reattore braccio laterale. Un supporto crescita liquido viene fatto circolare attraverso la nave mentre il disco viene ruotato da un agitatore magnetico. Le cedole vengono rimossi dal contenitore del reattore e poi raschiato per raccogliere il campione biofilm per ulteriori studi o immagini di microscopia. Reattori disco rotante sono progettate per le valutazioni di laboratorio di efficacia biocida, rimozione biofilm, e le prestazioni di anti-fouling dei materiali. 9,11,12,13

Protocolli per l&#39;utilizzo aperto biofilm flusso sistema con reattori a goccia e flusso di rotazione del disco reattori sono presentati in dettaglio.

L&#39;uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

Si ritiene che la maggior parte dei microbi in natura esista come comunità associate alla superficie in biofilm.1 I biofilm batterici sono racchiusi all'interno di una matrice e aderiscono...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare biofilm batterici sotto forze di taglio basse o moderate, utilizzando un reattore a flusso per gocciolamento o un reattore a disco rotante. I campioni nel reattore per biofilm vengono inizialmente inoculati con batteri e incubati a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule batteriche di aderire alle superfici di crescita. Una volta che le cellule si sono attaccate ai campioni, viene avviato un flusso di mezzo di crescita che genera una forza di taglio operante durante lo sviluppo del biofilm.I biofilm maturi possono quindi essere raccolti per l'analisi e l'osservazione. Può essere eseguita una microscopia elettronica a scansione per determinare l'ultrastruttura dei biofilm prodotti. I'm Blaze Balls.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le celle a flusso, è che consente facilmente un'elevata produzione di biomassa e la formazione di numerosi biofilm identici. A dimostrare questa procedura saranno Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, rispettivamente un'assistente tecnico e una studentessa laureanda del mio laboratorio. Il reattore a flusso per biofilm a gocciolamento è composto da quattro camere, ciascuna dotata di porti di ingresso per il mezzo nutritivo e di porti di uscita per lo scarico dei rifiuti.All'interno di ogni camera è presente un coupon rimovibile sul quale cresce il biofilm. Per assemblare il reattore a flusso per biofilm, posizionare i coupon in ciascuna camera parallela e fissare i coperchi delle camere. Autoclavare il reattore assemblato e i tubi per il nutriente in ingresso per sterilizzare il sistema prima dell'uso.Inoltre, sterilizzare in autoclave il mezzo di crescita per biofilm per inoculare il reattore a flusso per perlinaggio sterilizzato. Posizionare l'apparato su una superficie piana e fissare le linee di effluente. Successivamente, riempire ogni camera con 10 millilitri di mezzo di crescita sterile a base di triptico soia, e aggiungere 100 microlitri di staphylococcus aureus.Cultura notturna coltivata nello stesso mezzo in ciascuna camera separatamente. Posizionare il reattore inoculato in un incubatore a 37 gradi Celsius per 18 ore per consentire alle cellule di aderire alla superficie del campione. Dopo l'incubazione, chiudere con morsetto UNC il tubo di effluente e posizionare il reattore su un blocco di legno inclinato a un angolo di 10 gradi in modo asettico.Collegare il tubo per il nutriente fluente a una bottiglia contenente brodo nutriente a flusso continuo. Far passare il tubo attraverso la pompa ed eseguire la messa a punto del tubo azionando la pompa alla massima velocità. Una volta messo a punto il tubo fluente, arrestare la pompa e collegare a ciascuna estremità del tubo un ago da 22 gauge lungo un pollice.Pulire il tappo dell'ingresso della camera con una salvietta imbevuta di etanolo in modo asettico. Inserire gli aghi attraverso il tappo dell'ingresso. Accendere la pompa e lasciare gocciolare il mezzo sulle provette.Con una portata di circa 125 microlitri al minuto, il mezzo dovrebbe scorrere verso il basso dal porto del tappo di ingresso al porto dell'effluente. Far funzionare il reattore in flusso continuo per tre giorni. Controllare occasionalmente il reattore per verificare un corretto drenaggio.Il drenaggio viene verificato mediante ispezione visiva delle camere per assicurarsi che il mezzo non si accumuli nelle camere. Se il mezzo si sta accumulando, pizzicare il tubo di efflusso di solito favorisce un drenaggio corretto; per raccogliere i biofilm, fermare la pompa e rimuovere gli aghi dal reattore. Quindi posizionare il reattore su una superficie piana.Dopo tre giorni di flusso continuo, i biofilm di Staphylococcus aureus appaiono come biomassa gialla distribuita lungo tutta la lunghezza dei campioni inoculati. Un micrografo al microscopio elettronico a scansione del biofilm rivela Staphylococcus aureus che ricopre il campione in una comunità di biofilm associata alla superficie. Per quantificare la biomassa ottenuta, utilizzare pinze sterili per rimuovere in modo asettico i campioni, raccogliere i batteri mediante un raschietto cellulare, quindi trasferirli in un tubo conico contenente cinque millilitri di PBS sterile.Utilizzando un tessuto, disgregare con un omogeneizzatore gli aggregati batterici fino a ottenere una sospensione uniforme. Le unità formanti colonie vengono quantificate piantando diluizioni in serie su piastre di agar triptico, incubate per 24 ore a 37 gradi Celsius, e contando le colonie. Il reattore a biofilm a disco rotante è costituito da un chemostato attraverso cui viene pompato il mezzo di crescita.Un disco rotante con una barra a stella e 18 campioni progettati per essere inseriti nel disco rotante. Per assemblare il reattore, prima di tutto inserire i campioni del disco rotante nelle fessure del disco. Successivamente, posizionare il disco caricato all'interno di un becher di vetro da un litro dotato di un'apertura di troppopieno e chiudere il reattore con un tappo di gomma numero 15 provvisto di un foro per il flusso del mezzo e di un foro per l'aerazione.Autoclavare il reattore assemblato e i tubi di ingresso per sterilizzare il sistema. Per inoculare il reattore, riempire il becher con 250 millilitri di mezzo di coltura sterile e aggiungere 500 microlitri di una coltura notturna di Staphylococcus aureus coltivata in brodo di soia triptica. Posizionare il reattore su un agitatore magnetico impostato a 250 rotazioni al minuto e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire ai dischetti.Dopo l'incubazione notturna, collegare il tubo di ingresso al portello del serbatoio del mezzo e alla pompa peristaltica. Accendere la pompa e impostare il flusso a 0,25 millilitri al minuto. Far funzionare il reattore per 24 ore a 37 gradi Celsius per raccogliere i biofilm risultanti.Fermare il reattore in modo asettico. Rimuovere il disco senza toccare i campioni. Utilizzando pinze sterili, rimuovere i campioni e immergere con attenzione ciascuno in PBS sterile per rimuovere i batteri debolmente aderenti, da sottoporre poi a test con il composto antimicrobico.In modo asettico, posizionare i dischetti in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente i composti di interesse. Incubare la piastra per quattro ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire i dischetti in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti PBS 1X e disperdere i biofilm utilizzando un omogeneizzatore.Infine, piastrare diluizioni seriali delle cellule su mezzo agar nutriente per determinare il numero di unit&agrave; formanti colonie vitali per campione, come descritto in precedenza. Questo grafico mostra il numero di unit&agrave; formanti colonie in biofilm preparati utilizzando il reattore a disco rotante ed esposti al perossido di idrogeno, dimostrando la capacit&agrave; di produrre fino a 18 biofilm identici. L'utilizzo del reattore a disco rotante rende questa tecnica ideale per la valutazione di composti antimicrobici.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire biofilm in reattori a flusso per gravità e a disco rotante. Questi reattori per biofilm offrono alternative ai biofilm in cella a flusso e in piastre microtitolazione, ed sono ideali quando è necessaria una grande quantità di biomassa di biofilm o si desidera effettuare test antimicrobici su biofilm consolidati.

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