L'uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere biofilm batterici con una forza bassa o moderata utilizzando un reattore a biofilm a goccia o un reattore a disco rotante. I coupon nel biofilm reagiscono quando vengono prima inoculati con batteri e incubati a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule batteriche di aderire alle superfici di crescita. Una volta che le cellule si sono attaccate ai coupon, viene avviato un flusso di mezzi di crescita che produce una forza pura che opera durante lo sviluppo del biofilm.

I biofilm maturi possono quindi essere raccolti per l'analisi e l'osservazione dei biofilm. L'uso della microscopia elettronica a scansione può essere eseguito per determinare l'ultrastruttura dei biofilm prodotti. Sono Blaze Balls.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le celle a flusso è che si ottiene facilmente un'elevata produzione di biomassa e più biofilm identici. A dimostrare questa procedura saranno Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, un tecnico e studente laureato del mio laboratorio. Il reattore a biofilm a flusso gocciolante è costituito da quattro camere con porte di ingresso per l'ingresso dei fluidi e porte di deflusso per l'uscita dei rifiuti.

All'interno di ogni camera c'è un coupon rimovibile su cui cresce il biofilm. Per assemblare il reattore di biofilm a flusso di gocciolamento, posizionare i tagliandi in ciascuna camera parallela e fissare i coperchi della camera. Autoclavare il reattore assemblato e il tubo dei nutrienti in corrente per sterilizzare il sistema prima dell'uso.

Inoltre, sterilizzare in autoclave il terreno di coltura del biofilm per inoculare il reattore a flusso di goccia sterilizzato. Posizionare l'apparecchio su una superficie piana e clamp le linee di scarico. Quindi, riempi ogni camera con 10 millilitri di terreno di coltura sterile a base di brodo di soia trittico e aggiungi 100 microlitri di stafilococco aureo.

Coltura notturna coltivata nello stesso terreno in ciascuna camera separatamente. Posizionare il reattore inoculato in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 18 ore per consentire alle cellule di aderire alla superficie del coupon. Dopo l'incubazione, UNC blocca il tubo dell'effluente e posiziona il reattore su un tagliablocchi di legno inclinato con un angolo di 10 gradi. Asetticamente.

Collegare il tubo nutriente fluente a una bottiglia contenente brodo nutritivo a flusso continuo. Far passare la linea del tubo attraverso la pompa e adescare il tubo facendo funzionare la pompa alla massima velocità. Una volta innescato il tubo di fluidità, arrestare la pompa e collegare aghi da 22 pollici all'estremità di ciascun tubo.

Pulire il tappo di ingresso della camera con un panno a etanolo e in modo asettico. Inserire gli aghi attraverso il tappo di ingresso. Accendere la pompa e lasciare che il fluido goccioli sui coupon.

A una portata di circa 125 microlitri al minuto, il fluido dovrebbe fluire verso il basso dalla porta di arresto di ingresso alla porta di scarico. Far funzionare il reattore in flusso continuo per tre giorni. Controllare di tanto in tanto il reattore per un corretto drenaggio.

Il drenaggio viene controllato mediante ispezione visiva delle camere per garantire che i fluidi non si accumulino nelle camere. Se il fluido si accumula, pizzica, il tubo di deflusso di solito favorisce un corretto drenaggio per raccogliere i biofilm, arrestare la pompa e rimuovere gli aghi dal reattore. Quindi posizionare il reattore su una superficie piana.

Dopo tre giorni di flusso continuo, i biofilm di staphylococcus aureus appaiono come biomassa gialla diffusa lungo la lunghezza dei tagliandi inoculati. Una micrografia elettronica a scansione del biofilm rivela lo stafilococco aureo che copre il coupon in una comunità di biofilm associata alla superficie. Per quantificare la biomassa ottenuta, utilizzare una pinza sterile per rimuovere i tagliandi, raccogliere i batteri utilizzando un raschietto cellulare, quindi trasferirli in una provetta conica contenente cinque millilitri di PBS sterile.

Utilizzando un fazzoletto, l'omogeneizzatore disaggrega i grumi batterici fino ad ottenere una sospensione uniforme. Le unità formanti colonie vengono quantificate mediante diluizioni seriali su piastre di sogar trittico, incubando per 24 ore a 37 gradi Celsius e contando le colonie. Il reattore a biofilm a disco rotante è costituito da una chemioterapia attraverso la quale viene pompato il terreno di crescita.

Un disco rotante con una barra a stella e 18 coupon progettati per adattarsi al disco rotante. Per assemblare prima il reattore, caricare i tagliandi del disco rotante nelle fessure del disco rotante. Quindi posizionare il disco caricato all'interno di un becher di vetro da un litro con una porta di troppo pieno e tappare il reattore con un tappo di gomma numero 15 con un foro per il flusso del fluido e un foro per l'aerazione.

Autoclave, il reattore assemblato e il tubo di ingresso per sterilizzare il sistema. Per inoculare il reattore, riempire il becher con 250 millilitri di terreno di coltura sterile e aggiungere 500 microlitri di una coltura notturna di staphylococcus aureus coltivato in brodo di soia trittico. Posizionare il reattore su una piastra di agitazione impostata a 250 rotazioni al minuto e incubarlo per una notte a 37 gradi Celsius per consentire alle celle di aderire ai coupon.

Dopo l'incubazione notturna, collegare il tubo di ingresso alla porta del serbatoio del fluido e alla pompa peristaltica. Accendere la pompa e impostare il flusso a 0,25 millilitri al minuto. Lasciare che il reattore funzioni per 24 ore a 37 gradi Celsius per raccogliere i biofilm risultanti.

Arrestare il reattore e in modo asettico. Rimuovere il disco senza toccare i coupon. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere i tagliandi e immergerli con cura in PBS sterile per rimuovere i batteri attaccati in modo lasco per i test dei composti antimicrobici.

In modo asettico, posizionare i coupon nei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti contenente composti di interesse. Incubare la piastra per quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire i coupon in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti una volta il PBS e disperdere i biofilm utilizzando un omogeneizzatore.

Infine, diluizioni seriali su piastra delle cellule su terreno di agar nutriente per determinare il numero di unità formanti colonie vitali per campione, come descritto in precedenza. Questo grafico mostra il numero di unità formanti colonie in biofilm preparati utilizzando il reattore a disco rotante ed esposti al perossido di idrogeno, la capacità di produrre fino a 18 biofilm identici. L'utilizzo del reattore a disco rotante rende questa tecnica ideale per l'analisi dei composti antimicrobici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il flusso a goccia e i biofilm del reattore a disco rotante. Questi reattori a biofilm offrono alternative ai biofilm a celle a flusso e a piastre per microtitolazione e sono ideali quando è necessaria un'elevata quantità di biomassa di biofilm o si desidera eseguire test antimicrobici su biofilm consolidati.