L'uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare biofilm batterici sotto forze di taglio basse o moderate, utilizzando un reattore a flusso per gocciolamento o un reattore a disco rotante. I campioni nel reattore per biofilm vengono inizialmente inoculati con batteri e incubati a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule batteriche di aderire alle superfici di crescita. Una volta che le cellule si sono attaccate ai campioni, viene avviato un flusso di mezzo di crescita che genera una forza di taglio operante durante lo sviluppo del biofilm.

I biofilm maturi possono quindi essere raccolti per l'analisi e l'osservazione. Può essere eseguita una microscopia elettronica a scansione per determinare l'ultrastruttura dei biofilm prodotti. I'm Blaze Balls.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le celle a flusso, è che consente facilmente un'elevata produzione di biomassa e la formazione di numerosi biofilm identici. A dimostrare questa procedura saranno Rachel Stevenson e Kelly Schwartz, rispettivamente un'assistente tecnico e una studentessa laureanda del mio laboratorio. Il reattore a flusso per biofilm a gocciolamento è composto da quattro camere, ciascuna dotata di porti di ingresso per il mezzo nutritivo e di porti di uscita per lo scarico dei rifiuti.

All'interno di ogni camera è presente un coupon rimovibile sul quale cresce il biofilm. Per assemblare il reattore a flusso per biofilm, posizionare i coupon in ciascuna camera parallela e fissare i coperchi delle camere. Autoclavare il reattore assemblato e i tubi per il nutriente in ingresso per sterilizzare il sistema prima dell'uso.

Inoltre, sterilizzare in autoclave il mezzo di crescita per biofilm per inoculare il reattore a flusso per perlinaggio sterilizzato. Posizionare l'apparato su una superficie piana e fissare le linee di effluente. Successivamente, riempire ogni camera con 10 millilitri di mezzo di crescita sterile a base di triptico soia, e aggiungere 100 microlitri di staphylococcus aureus.

Cultura notturna coltivata nello stesso mezzo in ciascuna camera separatamente. Posizionare il reattore inoculato in un incubatore a 37 gradi Celsius per 18 ore per consentire alle cellule di aderire alla superficie del campione. Dopo l'incubazione, chiudere con morsetto UNC il tubo di effluente e posizionare il reattore su un blocco di legno inclinato a un angolo di 10 gradi in modo asettico.

Collegare il tubo per il nutriente fluente a una bottiglia contenente brodo nutriente a flusso continuo. Far passare il tubo attraverso la pompa ed eseguire la messa a punto del tubo azionando la pompa alla massima velocità. Una volta messo a punto il tubo fluente, arrestare la pompa e collegare a ciascuna estremità del tubo un ago da 22 gauge lungo un pollice.

Pulire il tappo dell'ingresso della camera con una salvietta imbevuta di etanolo in modo asettico. Inserire gli aghi attraverso il tappo dell'ingresso. Accendere la pompa e lasciare gocciolare il mezzo sulle provette.

Con una portata di circa 125 microlitri al minuto, il mezzo dovrebbe scorrere verso il basso dal porto del tappo di ingresso al porto dell'effluente. Far funzionare il reattore in flusso continuo per tre giorni. Controllare occasionalmente il reattore per verificare un corretto drenaggio.

Il drenaggio viene verificato mediante ispezione visiva delle camere per assicurarsi che il mezzo non si accumuli nelle camere. Se il mezzo si sta accumulando, pizzicare il tubo di efflusso di solito favorisce un drenaggio corretto; per raccogliere i biofilm, fermare la pompa e rimuovere gli aghi dal reattore. Quindi posizionare il reattore su una superficie piana.

Dopo tre giorni di flusso continuo, i biofilm di Staphylococcus aureus appaiono come biomassa gialla distribuita lungo tutta la lunghezza dei campioni inoculati. Un micrografo al microscopio elettronico a scansione del biofilm rivela Staphylococcus aureus che ricopre il campione in una comunità di biofilm associata alla superficie. Per quantificare la biomassa ottenuta, utilizzare pinze sterili per rimuovere in modo asettico i campioni, raccogliere i batteri mediante un raschietto cellulare, quindi trasferirli in un tubo conico contenente cinque millilitri di PBS sterile.

Utilizzando un tessuto, disgregare con un omogeneizzatore gli aggregati batterici fino a ottenere una sospensione uniforme. Le unità formanti colonie vengono quantificate piantando diluizioni in serie su piastre di agar triptico, incubate per 24 ore a 37 gradi Celsius, e contando le colonie. Il reattore a biofilm a disco rotante è costituito da un chemostato attraverso cui viene pompato il mezzo di crescita.

Un disco rotante con una barra a stella e 18 campioni progettati per essere inseriti nel disco rotante. Per assemblare il reattore, prima di tutto inserire i campioni del disco rotante nelle fessure del disco. Successivamente, posizionare il disco caricato all'interno di un becher di vetro da un litro dotato di un'apertura di troppopieno e chiudere il reattore con un tappo di gomma numero 15 provvisto di un foro per il flusso del mezzo e di un foro per l'aerazione.

Autoclavare il reattore assemblato e i tubi di ingresso per sterilizzare il sistema. Per inoculare il reattore, riempire il becher con 250 millilitri di mezzo di coltura sterile e aggiungere 500 microlitri di una coltura notturna di Staphylococcus aureus coltivata in brodo di soia triptica. Posizionare il reattore su un agitatore magnetico impostato a 250 rotazioni al minuto e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire ai dischetti.

Dopo l'incubazione notturna, collegare il tubo di ingresso al portello del serbatoio del mezzo e alla pompa peristaltica. Accendere la pompa e impostare il flusso a 0,25 millilitri al minuto. Far funzionare il reattore per 24 ore a 37 gradi Celsius per raccogliere i biofilm risultanti.

Fermare il reattore in modo asettico. Rimuovere il disco senza toccare i campioni. Utilizzando pinze sterili, rimuovere i campioni e immergere con attenzione ciascuno in PBS sterile per rimuovere i batteri debolmente aderenti, da sottoporre poi a test con il composto antimicrobico.

In modo asettico, posizionare i dischetti in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente i composti di interesse. Incubare la piastra per quattro ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire i dischetti in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti PBS 1X e disperdere i biofilm utilizzando un omogeneizzatore.

Infine, piastrare diluizioni seriali delle cellule su mezzo agar nutriente per determinare il numero di unità formanti colonie vitali per campione, come descritto in precedenza. Questo grafico mostra il numero di unità formanti colonie in biofilm preparati utilizzando il reattore a disco rotante ed esposti al perossido di idrogeno, dimostrando la capacità di produrre fino a 18 biofilm identici. L'utilizzo del reattore a disco rotante rende questa tecnica ideale per la valutazione di composti antimicrobici.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire biofilm in reattori a flusso per gravità e a disco rotante. Questi reattori per biofilm offrono alternative ai biofilm in cella a flusso e in piastre microtitolazione, ed sono ideali quando è necessaria una grande quantità di biomassa di biofilm o si desidera effettuare test antimicrobici su biofilm consolidati.