Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare le interazioni del biofilm con l'ambiente circostante utilizzando metodi integrati per fare ciò. Viene costruito un sistema di celle a flusso microfluidico a doppio ingresso in cui i mezzi contenenti glucosio e privi di glucosio vengono pompati attraverso una cella a flusso generando un gradiente di glucosio. I batteri vengono aggiunti al sistema e i biofilm possono svilupparsi nel corso di diversi giorni.

I biofilm vengono quindi ripresi mediante microscopia confocale 3D per caratterizzare il trasporto solubile. All'interno dei biofilm, i traccianti fluorescenti vengono iniettati nel sistema di flusso e viene eseguito l'imaging time-lapse per caratterizzare il campo di flusso attorno alle colonie di biofilm, vengono iniettate microsfere fluorescenti e viene eseguito l'imaging time-lapse. L'analisi del trasporto dei soluti e del tracciamento delle particelle dei dati risultanti dimostra l'utilità di questo metodo nella valutazione dei processi di biofilm in vari ambienti chimici all'interno di un singolo dispositivo e in una serie di esperimenti.

Il vantaggio principale di questi metodi è che consentono la valutazione simultanea di molteplici aspetti delle interazioni con l'ambiente del biofilm. I metodi qui riportati possono aiutare a rispondere a domande chiave sulla formazione di biofilm in ambienti naturali o nelle infezioni correlate al biofilm. Lavorando in una cappa a flusso laminare, trasferire una colonia di posa PAO una GFP e una colonia di e coli DH cinque alfa da una piastra LB a provette separate contenenti tre millilitri di brodo lb.

Incubare le colture durante la notte a 37 gradi Celsius agitando a 225 giri/min. Questo sistema di flusso si basa su una cella microfluidica a doppio ingresso che facilita l'osservazione della crescita del biofilm sotto un gradiente chimico ben definito formato dalla miscelazione di due soluzioni all'interno della camera di flusso. Durante il flusso, si forma un gradiente di concentrazione uniforme in direzione trasversale.

Come risultato della diffusione, il profilo di concentrazione è ripido vicino all'insenatura e più rilassato a valle. Il giorno dell'esperimento, assemblare con cura il sistema di flusso. Innanzitutto, fissare il tubo nella pompa peristaltica, quindi collegare un'estremità del tubo a un flacone medio contenente 900 millilitri di terreno FAB con glucosio e l'altra estremità a una trappola per bolle.

Ripeti questo processo per collegare un secondo flacone medio contenente 900 millilitri di fab senza glucosio a una seconda trappola per bolle. Quindi, inserire le valvole a tre vie appena prima degli ingressi della cella di flusso e collegare ciascuna delle trappole a bolle alla cella di flusso. Infine, collegare l'uscita della cella di flusso a una bottiglia di scarico.

Assicurarsi che la cella di flusso sia posizionata con il vetrino coprioggetto rivolto verso il basso per consentire alle celle sospese di depositarsi sul vetrino coprioggetti. Dopo aver assemblato il sistema di flusso, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 millilitri all'ora per ogni ingresso per riempire il sistema Con il mezzo fab viene introdotto il mezzo ai due ingressi con un glucosio fornito solo in un ingresso. Successivamente, lavorando nella cappa, diluire le due colture batteriche in un rapporto di uno a uno in un millilitro di acqua sterile con un OD 600 equivalente di 0,01 per ciascun batterio per inoculare la cella di flusso, utilizzare una siringa di plastica sterile per iniettare 500 microlitri di inoculo in ciascuno degli ingressi della cella di flusso tramite la valvola a tre vie.

Dopo l'iniezione, arrestare la pompa e lasciare che le cellule batteriche si attacchino al vetro di copertura per un'ora dopo che le cellule si sono attaccate, impostare la pompa a 0,03 millilitri al minuto per ogni ingresso e lasciare che il sistema fluisca per tre giorni a temperatura ambiente durante i quali si sviluppa un biofilm sotto un gradiente di esposizione al glucosio. Dopo che sono trascorsi tre giorni. Utilizzare un pennarello e un righello per disegnare una griglia sul lato del vetro di copertura della cella di flusso in preparazione per l'imaging.

Ciò aiuterà a localizzare le regioni di imaging per contrastare la colorazione per la visualizzazione di e coli. Innanzitutto, spegni le luci per oscurare l'area di lavoro poiché la macchia del bancone è sensibile alla luce. Utilizzare una siringa per iniettare lentamente un millilitro di colorante di acido nucleico fluorescente rosso diluito nella valvola a tre vie a monte della camera di flusso.

Arresta il flusso. Tenere la cella di flusso stagnante al buio per 30 minuti. Dopo che sono trascorsi 30 minuti.

Riprendere il flusso a 0,03 millilitri al minuto e lavare via la macchia non legata per 15 minuti. Quindi arrestare il flusso e osservare i biofilm utilizzando la microscopia confocale con un obiettivo 63x. Trova un campo visivo contenente una buona quantità di biomassa con colonie di biofilm ben separate come mostrato qui.

Quindi acquisisci pile di immagini 3D nei canali appropriati per mappare i modelli spaziali di sviluppo del biofilm all'interno dell'immagine della cella di flusso, i biofilm a tre o più distanze longitudinali o X lungo l'ingresso della cella di flusso e a tre posizioni trasversali o Y rispetto al gradiente nutrizionale imposto. Per caratterizzare i modelli di trasporto solubile all'interno del biofilm, iniziare con la cella a flusso. Dopo tre giorni di sviluppo del biofilm, ancora una volta, lavorando al buio.

Arrestare la pompa per mettere in pausa il flusso, aprire gli scaricatori di bolle per rilasciare la pressione di iniezione. Quindi utilizzare una siringa per iniettare un millilitro di soluzione tracciante sci-fi diluita in una delle valvole a tre vie a monte della cella di flusso. Dopo aver iniettato la soluzione fantascientifica, chiudere le trappole a bolle.

Regolare la valvola a tre vie e riavviare la pompa a 0,03 millilitri al minuto per erogare la soluzione fantascientifica nella cella di flusso. Quindi, passa la modalità di imaging confocale a XYT con un frame rate di 0,15 hertz. Un'alta risoluzione temporale è preferibile per verbalizzare la penetrazione del colorante, tuttavia, la scansione veloce diminuisce la qualità dell'immagine.

Quindi imposta la velocità di scansione e la media delle linee per bilanciare la risoluzione temporale dell'imaging e la qualità dell'immagine. Una volta impostati i parametri di imaging, riavviare la pompa per riprendere il flusso. A una velocità di 0,03 millilitri al minuto, cinque vengono erogati contemporaneamente nella cella di flusso.

Avvia l'imaging confocale time-lapse. Una volta completata l'imaging time-lapse. Esecuzione dell'analisi di diffusione secondo le istruzioni riportate nel documento di accompagnamento.

Per caratterizzare il campo di flusso attorno ai biofilm, diluire le microsfere fluorescenti da un micrometro in acqua sterilizzata fino a una concentrazione finale di solidi dello 0,2% e un volume finale di 0,5 millilitri. Quindi vorticare per assicurarsi che le microsfere siano ben disperse, mettere in pausa il flusso e quindi iniettare e rilasciare le microsfere fluorescenti diluite nella cella di flusso. Come prima, modificare la portata a 0,01 millilitri all'ora.

La bassa portata consente un tracciamento accurato del percorso delle particelle. Passa le impostazioni confocali alla modalità XYT e istruisci il software a tracciare il movimento delle particelle in una fetta Z. Acquisisci immagini di serie temporali come prima utilizzando una frequenza di fotogrammi di un hertz.

Ripetere la procedura di iniezione delle particelle e l'immagine in diverse posizioni Z. Dopo aver completato l'imaging, seguire le istruzioni nel documento di accompagnamento per calcolare i vettori di flusso per studiare le interazioni batteriche in un biofilm sotto un gradiente di glucosio. Posa GFP ed E coli sono stati differenziati in biofilm di specie duali attraverso la controcolorazione.

Con cyto sono state acquisite 62 immagini in ciascuna delle nove regioni di imaging sulla camera di flusso. Nelle sovrapposizioni mostrate qui, la posa GFP appare verde o gialla e l'e coli appare rosso. Posa ha dominato la biomassa del biofilm nelle regioni con alte concentrazioni di glucosio e l'e coli ha dominato nelle regioni con basse concentrazioni di glucosio.

Così le due specie occupavano nicchie ecologiche distinte. Questi risultati dimostrano l'utilità della cella a flusso microfluidico a doppio ingresso nello studio dell'attività di sviluppo del biofilm e delle interazioni in ambienti complessi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una cella a flusso microfluidico a doppio ingresso per far crescere biofilm sotto gradienti chimici e come ottenere parametri ambientali per lo sviluppo di biofilm utilizzando le iniezioni di particelle fluorescenti o chaser Dopo lo sviluppo.

Questi metodi hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia ambientale e clinica per esplorare le complesse interazioni tra le comunità microbiche e l'ambiente circostante.