Name: Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri metodi per caratterizzare le interazioni dei biofilm con l'ambiente utilizzando un sistema microfluidico a doppio ingresso. Questa tecnica permette di analizzare il trasporto di soluti e i campi di flusso attorno alle colonie batteriche.

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Ringraziamo Matt Parsek presso l&#39;Università di Washington (Seattle, WA) per la fornitura di P. aeruginosa e E. ceppi coli e Roger Nokes presso l&#39;Università di Canterbury (Nuova Zelanda) per fornire l&#39;accesso a software Streams. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01AI081983 dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive. Confocale è stata eseguita presso l&#39;impianto di Northwestern Imaging biologica (BIF).

Setup Cella 1. Flusso e inoculazione NOTA:. Utilizzare una cella di flusso microfluidica doppio ingresso descritto nel Canto et al, 2014 14 a crescere biofilm. Questa cella di flusso è in grado di creare gradienti chimici lisce ben definiti. Il disegno cella di flusso è mostrata in Figura 1 e flusso fabbricazione cella precedentemente descritto canzone et al. 2014 14. Qui dettaglio i nostri metodi utilizzando P. aeruginosa e E. coli per formare biofilm, ma altre specie può essere adatto anche. Abbiamo usato P. aeruginosa PAO1- GFP, che esprime costitutivamente una proteina verde fluorescente (GFP), come organismo modello per lo sviluppo di biofilm. Inoltre, abbiamo utilizzato E. coli DH5α per formare biofilm mixed-specie con P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. ceppi coli sono state coltivate su piastre di agar LB. <ol><li> Preparare la cella di flusso utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) legato ad unacoprioggetto di vetro con trattamento al plasma di ossigeno, come descritto in 14. Le dimensioni della camera di cella di flusso sono di 23 mm x 13 millimetri × 0,24 millimetri (lunghezza x larghezza × profondità). </li><li> Preparare modificato FAB mezzo di crescita 15. Per osservare la crescita di biofilm sotto un gradiente nutrizionale all&#39;interno della cella di flusso, introducono modifiche FAB media 15 con 0,6 micron di glucosio in un ingresso e di introdurre FAB media senza alcuna fonte di carbonio attraverso l&#39;altro ingresso. Filtro-sterilizzare (dimensione dei pori = 0,2 micron) la soluzione di glucosio magazzino (60 mm) prima di aggiungerlo al mezzo FAB. Autoclave Anche il mezzo FAB con ciclo 1 (liquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) prima dell&#39;uso. </li><li> Sterilizzare il sistema di flusso. Prima dell&#39;inoculo, autoclave l&#39;intero percorso di flusso (bottiglie medie, tubi, trappole bolla, celle di flusso) utilizzando ciclo 1, eccetto per le valvole a tre vie (plastica monouso e pre-sterilizzati) a monte della cella di flusso. (Valvole a tre vie sono utilizzati per l&#39;iniezione delle cellule culture, tracciante fluorescente e microsfere.) Per evitare la contaminazione in fase di montaggio, coprire tutte le aperture e tubi di collegamento con un foglio di alluminio o sacchetti di autoclave prima autoclave. </li><li> Collegare il sistema di flusso. Assemblare i componenti del sistema di cella di flusso accuratamente (vedi video per il montaggio del sistema di flusso) e fornire terreno di coltura alla cella di flusso tramite una pompa peristaltica che controlla con precisione la portata. </li><li> Preparare coltura cellulare per l&#39;inoculazione trasferendo una colonia di P. aeruginosa o E. coli dalle piastre LB a 3 ml di brodo LB e scuotere la cultura O / N a 225 giri al minuto e 37 ° C. Diluire gli O / colture cellulari N in 1 ml di acqua sterile ad una OD finale 600 = 0,01 come inoculo. (Cultura e diluire i batteri in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione.) </li><li> Per gli esperimenti con biofilm mista specie, diluire le due colture batteriche ad un rapporto di 1: 1 in 1 ml con un equivalente OD 600 = 0,01 per ogni batterio. </li><li> Seminare la cella di flusso. Iniettare 1 ml di inoculo all&#39;ingresso cella di flusso dalla valvola a tre vie. Dopo l&#39;iniezione, mettere in pausa il flusso per 1 ora per consentire cellule batteriche di allegare al vetro di copertura. (Assicurarsi che la cella di flusso è posizionato con il lato coprioggetto basso per consentire alle cellule in sospensione di depositarsi sul vetrino.) </li><li> Dopo 1 ora, riprendere il flusso e pompare il mezzo di crescita alla cella di flusso ad una velocità costante di 0,03 ml / min per ciascun ingresso per 3 giorni. </li></ol> 2. Characterizing biofilm sviluppo in risposta a nutrienti sfumature Utilizzo Microscopia confocale NOTA: P. aeruginosa può essere ripreso con costitutivamente-espressa GFP, ma E. coli in biofilm misti specie deve essere ripreso dalla controcolorazione. <ol><li> Osservare le biofilm 3 giorni usando la microscopia confocale. Per i risultati rappresentativi, osservare biofilm utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 63X. Prima di imaging, markla cella doppio ingresso a flusso con una griglia sul lato vetro di copertura. (Lo scopo di questa griglia è di consentire lo sperimentatore per individuare le regioni di imaging nella camera cella di flusso.) </li><li> Per colorazione di contrasto, diluire 10 ml di rosso fluorescente macchia cellule permeante acidi nucleici, come l&#39;acido macchia verde fluorescente nucleico come STYO 62, soluzione madre (1 mm) in 990 ml di acqua sterilizzata e poi lentamente iniettare la macchia diluito con una siringa in la camera di cella di flusso dalla valvola a tre vie monte. Mantenere la cella di flusso stagnante e al buio per 30 minuti, quindi riprendere il flusso di lavare la macchia non legato per 15 min. </li><li> Eseguire confocale. Attivare la 488 nm Argon laser per l&#39;eccitazione e l&#39;emissione di raccolta canali per GFP (500-535 nm) e macchia acidi nucleici (per lampade fluorescenti colorazione verde acido nucleico, 650-750 nm). Regolare guadagni e offset per entrambi i canali per avere immagini brillanti e pulite. Selezionare xyz e modalità di imaging simultaneo. Utilizzare la manopola di z-controllo per idenduare parte inferiore e superiore del biofilm nel campo. Impostare la z-passo a 0,5 micron per l&#39;acquisizione di una serie di immagini 3-D. (Per garantire immagini di alta qualità, utilizzare una media linea di quattro per l&#39;acquisizione di immagini.) </li><li> Per mappare i modelli spaziali di sviluppo biofilm all&#39;interno della cella di flusso, biofilm immagine a tre o più longitudinale (x) distanze lungo l&#39;ingresso della cella di flusso, e alle tre trasversale (y) posizioni relative al gradiente nutrizionale imposto, come mostrato in Figura 1 . </li></ol> 3. Characterizing Soluto interno Trasporto Iniezioni di conservatore fluorescente Tracer NOTA: Un tracciante fluorescente conservatore, come Cy5, può essere utilizzato per caratterizzare modelli di trasporto dei soluti all&#39;interno del biofilm. <ol><li> Sciogliere Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in acqua ad una concentrazione finale di 10 mg / ml come soluzione madre. Conservare la soluzione di riserva Cy5 in un -20 ° C freezer. NOTA: Come Cy5 è chiaro Sensitive, magazzini, diluite e iniettare soluzioni Cy5 nel buio. </li><li> Prima delle iniezioni del tracciante fluorescente, prendere una serie di immagini 3-D del biofilm di 3 giorni con la microscopia confocale (con un obiettivo 63X). (Regioni larghe delle colonie biofilm sono ideali per serie temporali osservazioni di trasporto colorante.) Anche scegliere un piano z con colonie ben separati per l&#39;imaging (come mostrato in Figura 5A). </li><li> Per ogni esperimento iniezione Cy5, diluire 2 ml di soluzione madre Cy5 in 998 microlitri di acqua sterilizzata per fornire una soluzione di iniezione avente una concentrazione Cy5 di 20 ug / ml. </li><li> Arrestare la pompa per interrompere il flusso e iniettare la soluzione Cy5 nel monte della cella di flusso utilizzando una siringa attraverso la valvola a 3 vie. (E &#39;importante per evitare bolle d&#39;aria di entrare nel percorso di flusso durante l&#39;iniezione. Bubble trappole devono essere tenuti aperti durante l&#39;iniezione posteriore.) </li><li> Dopo aver iniettato il soluzione Cy5, chiudere le trappole bolla, regolare la valvola a 3 vie, e riavviare ilpompa per fornire la soluzione Cy5 iniettato nella cella di flusso. </li><li> Passa alla modalità di imaging confocale a XYT. Attivare Cy5 e GFP canali sotto la modalità di imaging simultaneo. Regolare le impostazioni confocale su intensità Cy5 (intensità del laser, di guadagno e offset) per evitare segnali, che è fondamentale per la quantificazione saturazione. (Alta risoluzione temporale è preferito per la visualizzazione penetrazione del colorante. Tuttavia, la scansione veloce diminuisce la qualità dell&#39;immagine.) Scegliere la corretta velocità di scansione e media linea per bilanciare la risoluzione temporale dell&#39;imaging e la qualità dell&#39;immagine. Per questo protocollo utilizzare una media linea di quattro e un frame rate di 0,15 Hz. </li><li> Riprendere il flusso di consegnare Cy5 nella cella di flusso (ancora ad una portata di 0,03 ml / min). Contemporaneamente avviare serie temporali confocale. </li><li> Quantificare penetrazione Cy5 da radialmente media intensità Cy5 all&#39;interno di un 2-D biofilm colonia circolare. Per media, prima identificare il bordo di un cluster biofilm, quindi generare una mappa di distanza per una sezione 2-D del cluster, E infine modelli medi radiali di intensità Cy5 per generare una curva di penetrazione (vedere Figura 6). <ol><li> Per computazionalmente realizzare passo 3.8, utilizzare BioSPA (biofilm Spatial Pattern Analysis) pacchetto software (inedito, software e manuale disponibile su richiesta) o di altri programmi di analisi delle immagini. </li><li> Per utilizzare BioSPA, prima importare un&#39;immagine impostata in BioSPA. Quindi selezionare soglia adeguata per i canali GFP e Cy5 per rendere le immagini binarie. Nel menu di analisi / calcolo, selezionare Advanced Analysis e quindi Analysis diffusione. Utilizzare il canale GFP per definire il bordo di un cluster e utilizzare lo strumento poligono per selezionare un cluster come la regione di interesse (ROI). </li><li> Fare doppio clic sul gruppo biofilm selezionato per eseguire l&#39;analisi di diffusione. Salvare i risultati delle analisi di diffusione e calibrare l&#39;intensità Cy5 alla concentrazione Cy5 utilizzando una curva di calibrazione. <ol><li> Per generare Cy5 curva di calibrazione concentrazione, misurare intensità Cy5 su una conce Cy5gradiente ntration al microscopio confocale. (Intensità Cy5 e concentrazione hanno una relazione lineare.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Caratterizzare il campo di moto circostante tracciando particelle fluorescenti NOTA: particelle fluorescenti, quali microsfere fluorescenti, può essere usato per caratterizzare il campo di flusso intorno biofilm. Campo di moto intorno biofilm può essere calcolata dalle osservazioni di serie temporali di posizioni delle particelle che utilizzano software di monitoraggio di particelle velocimetria. I risultati qui riportati sono stati ottenuti con il software Streams 2.02 pacchetto 16 (download del software e la guida a disposizione dell&#39;utente in <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Diluire le microsfere fluorescenti (diametro ~ 1 micron) in acqua sterile ad una concentrazione solida finale di 0,2% e un volume finale di 0,5 ml. Vortex per assicurarsi che le microsferesono ben dispersi. </li><li> Iniettare e fornire i microsfere fluorescenti diluito nella cella di flusso in base a procedure da passaggi 3,3-3,5. Per consentire un monitoraggio accurato del percorso particella, utilizzare un tasso relativamente basso flusso (0,01 ml / h per i risultati di monitoraggio di particelle in questo documento). </li><li> Passare impostazioni confocale modalità di XYT per tracciare il movimento delle particelle in un z-slice e prendere le immagini serie temporali. (Una frequenza di 1 Hz è stato utilizzato per i risultati rappresentativi riportati in questo articolo.) Iniezione di ripetizione di particelle e di immagini in diverse posizioni z di generare flusso di campo 3-D. </li><li> Pre-processo time-series immagini confocale sottraendo il segnale di fluorescenza di fondo (il segnale nella prima immagine acquisita del set di immagini) utilizzando ImageJ (download del software e manuale disponibile su <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) o altri programmi. </li><li> In ImageJ, aprire la prima immagine di un set di immagini e quindi importare il set di immagini. Sotto processo / Immagine Calculator, sottrarre la prima immagine dal set di immagini. Salvare il set di immagini pre-trattati. </li><li> Per calcolare i vettori di flusso, import time-series immagini confocale in Streams 2.02. In &quot;vista del processo Apri&quot;, selezionare ed eseguire &quot;Identificare le particelle&quot;. Utilizzare soglia adeguata di identificare particelle. Utilizzare 0,5 e 5 micron come soglie di diametro minimo e massimo per 1 micron particelle. </li><li> Poi sotto &quot;view processo Open&quot;, selezionare ed eseguire &quot;PTV analisi condotta&quot; per generare percorsi di particelle. Controllare i percorsi di particelle per vedere se essi rappresentano il movimento delle particelle. Infine, selezionare ed eseguire &quot;Crea campo di velocità&quot; per generare una mappa di flusso vettoriale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato una serie di metodi per la caratterizzazione di tre importanti interazioni biofilm-ambiente: risposta biofilm a gradienti chimici, gli effetti della crescita biofilm sul flusso microambiente circostante, e eterogeneità biofilm derivanti da limitazioni di trasporto interno. Per prima mostrato l&#39;uso di una cella di flusso microfluidica romanzo imporre un gradiente chimica ben definita per lo sviluppo biofilm. Per generare un gradiente chimica ben definita all&#39;interno...

Microrganismi attribuiscono alle superfici e formare biofilm - aggregati di cellule racchiuse in una matrice extracellulare-polimero 1. I biofilm si comportano in modo molto diverso dalle cellule microbiche individuali, perché biofilm hanno drammatico eterogeneità spaziale risultante da una combinazione di limitazioni del trasporto dei soluti interni e variazioni spaziali nel metabolismo cellulare 2,3. Le concentrazioni di ossigeno e nutrienti drasticamente diminuire all&#39;interfaccia tra biofilm e dintorni fluido e ottenere ulteriori impoverito all&#39;interno del biofilm 2. Variazioni spaziali in biofilm la respirazione e la sintesi proteica può verificarsi anche come una risposta all&#39;ossigeno localizzato e la disponibilità di nutrienti 2. In ambienti acquatici e del terreno, la maggior parte dei batteri abitano in biofilm. Biofilm naturali svolgono importanti processi biogeochimici compresa ciclo del carbonio e azoto e ridurre i metalli 4,5. Clinicamente, la formazione di biofilm è responsbile per polmonare prolungato e infezioni urinarie 6. Infezioni biofilm associate sono molto problematico perché le cellule in biofilm sono estremamente elevata resistenza agli antimicrobici rispetto ai loro omologhi planctonici 6. Perché biofilm sono importanti in contesti diversi, una notevole quantità di ricerca si è focalizzata sulla comprensione dei fattori ambientali che controllano le attività biofilm e l&#39;eterogeneità spaziale biofilm e microambiente circostante. Studi precedenti hanno dimostrato che lo sviluppo del biofilm è fortemente regolato da una serie di fattori ambientali: biofilm sviluppano differenti morfologie sotto varie condizioni di flusso; ossigeno e nutrienti disponibilità influenza biofilm morfologia; e sforzo di taglio idrodinamico colpisce l&#39;attaccamento di cellule planctoniche alle superfici e il distacco delle cellule dal biofilm 7-9. Inoltre, condizione di flusso esterno influenza la consegna dei substrati into ed entro 10 biofilm. La crescita di biofilm altera anche circostante condizioni fisiche e chimiche. Ad esempio, la crescita di biofilm porta alla deplezione locale di ossigeno e nutrienti 2; biofilm accumulano composti inorganici e organici dall&#39;ambiente circostante 11; e cluster biofilm deviano il flusso e l&#39;aumento della superficie di attrito 12,13. Perché biofilm interagiscono con il loro ambiente circostante in modi molto complessi, è fondamentale per ottenere contemporaneamente informazioni sulle proprietà biofilm e delle condizioni ambientali, e gli approcci multi-disciplinari devono essere utilizzati per caratterizzare completo interazioni biofilm-ambiente. Qui vi presentiamo una serie di metodologie integrate per caratterizzare i modelli spaziali in crescita microbica all&#39;interno mono-specie e biofilm dual-specie sotto una pendenza nutrizionale imposto, e di osservare la modifica conseguente della sostanza chimica locale e microambiente fluido. Noi FIRv descrivono l&#39;uso di una cella di flusso microfluidica doppia aspirazione recentemente sviluppato per osservare la crescita di biofilm sotto gradienti chimici ben definiti. Abbiamo poi dimostrare l&#39;uso di questa cella di flusso microfluidica per osservare la crescita di due specie di batteri, Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli, in biofilm sotto una varietà di condizioni nutrizionali. Mostriamo come in visualizzazione situ fluorescente di propagazione tracciante in colonie biofilm può essere utilizzato per valutare quantitativamente i modelli di trasporto dei soluti in biofilm. Infine, si mostra come microscala velocimetria tracciamento di particelle, eseguita al microscopio confocale, può essere utilizzato per ottenere campo di moto locale intorno alle biofilm crescita.

<table><tbody><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Installazione della cella di flusso e inoculazione</td></tr><tr><td>Tubo della pompa 0,50&nbsp; mm OVC, arancione/giallo</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Impostazione e inoculazione della cella di flusso</td></tr><tr><td>Rubinetto di arresto a tre vie con blocco Luer maschio girevole</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Configurazione e inoculazione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Incapsulamento delle celle solari per la realizzazione di pannelli solari</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Configurazione e inoculazione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&nbsp; L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Configurazione e inoculazione della cella a flusso</td></tr><tr><td>Tubi C-FLEX</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Installazione e inoculazione della cella</td></tr><tr><td>a flusso Siringa TB da 1 ml BD</td><td>309659</td><td>Configurazione e inoculazione della cella a flusso</td><td></td></tr><tr><td>Tubi polimerici</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Configurazione e inoculazione della cella a flusso</td></tr><tr><td>Adattatore sterile Intramedic Luer Stub Clay</td><td>Adams</td><td>427564</td><td>Impostazione e inoculazione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Impostazione e inoculazione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>HACH</td><td></td><td>Installazione e inoculazione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe - sterili (0,2 &; m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Installazione e inoculazione della cella a flusso</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td>Installazione e inoculazione</td></tr><tr><td>della cella a flusso Solfato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Cloruro di magnisio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di manganese(II) monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di rame(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di zinco eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Terreni di crescita</td></tr><tr><td>Solfato di cobalto(II) eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Terreni</td></tr> <tr><td>di crescitaMolibdato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Luria Bertani Brodo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Terreno</td></tr><tr><td>di crescita TCS SP2 Microscopia confocale</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging fluorescente</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Imaging fluorescente</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>fluorescente Rosso fluorescente (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Imaging fluorescente</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image</td></tr><tr><td>Processing Volocity</td><td>Flussi</td> di <td>elaborazione delle immagini</td>PerkinElmer <td></td></tr><tr><td>2.02</td><td>Elaborazione delle immagini dell'Università di Cantebury</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e habitat eterogeneità

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

I biofilm sono comunità microbiche-superficie collegata che hanno strutture complesse e producono significativi eterogeneità spaziali. Sviluppo di biofilm è fortemente regolata dal flusso circostante e l&#39;ambiente nutrizionale. Crescita biofilm aumenta anche l&#39;eterogeneità del microambiente locale generando campi di flusso complessi e modelli di trasporto dei soluti. Per studiare lo sviluppo di eterogeneità in biofilm e le interazioni tra biofilm e il loro locale micro-habitat, siamo cresciuti biofilm mono-specie di Pseudomonas aeruginosa e biofilm dual-specie di P. aeruginosa e Escherichia coli sotto gradienti nutrizionali in una cella di flusso microfluidica. Forniamo protocolli dettagliati per creare gradienti nutrienti all&#39;interno della cella di flusso e per la crescita e la visualizzazione sviluppo biofilm in queste condizioni. Abbiamo anche protocolli presenti per una serie di metodi ottici di quantificare modelli spaziali nella struttura biofilm, flusso Distributi su biofilm, e trasporto di massa intorno e all&#39;interno di colonie biofilm. Questi metodi supportano le indagini a tutto campo del co-sviluppo di biofilm e di habitat eterogeneità.

La cella doppia presa flusso microfluidica consente l&#39;osservazione della crescita biofilm sotto un gradiente chimica ben definita formata miscelando due soluzioni all&#39;interno della camera di flusso. Il gradiente chimica risultante è stato precedentemente osservato per iniezione colorante e caratterizzato in dettaglio da Song et al. 14. Gradienti di concentrazione lisce sono formate in direzione trasversale, come illustrato in Figura 1. Il profilo di concentrazione era ripida ...

I biofilm hanno interazioni complesse con l'ambiente circostante. Per studiare in modo completo le interazioni biofilm-ambiente, presentiamo qui una serie di metodi per creare un ambiente chimico eterogeneo per lo sviluppo del biofilm, per quantificare la velocità del flusso locale e per analizzare il trasporto di massa all'interno e intorno alle colonie di biofilm.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare le interazioni del biofilm con l'ambiente circostante utilizzando metodi integrati per raggiungere tale scopo. Viene realizzato un sistema di cella a flusso microfluidico con doppia entrata, nel quale terreni contenenti glucosio e privi di glucosio vengono pompati attraverso una cella a flusso, generando un gradiente di glucosio. I batteri vengono aggiunti al sistema e i biofilm vengono lasciati sviluppare nell'arco di diversi giorni.I biofilm vengono quindi analizzati mediante microscopia confocale 3D per caratterizzare il trasporto del soluto. All'interno dei biofilm, vengono iniettati traccianti fluorescenti nel sistema di flusso ed eseguita un'acquisizione temporizzata per caratterizzare il campo di flusso attorno alle colonie di biofilm; inoltre, vengono iniettate microsfere fluorescenti ed eseguita un'acquisizione temporizzata. L'analisi del trasporto del soluto e del tracciamento delle particelle sui dati ottenuti dimostra l'utilità di questo metodo nella valutazione dei processi del biofilm in diversi ambienti chimici all'interno di un singolo dispositivo e in un unico insieme di esperimenti.Il principale vantaggio di questi metodi è che consentono la valutazione simultanea di diversi aspetti delle interazioni tra biofilm e ambiente. I metodi descritti in questo articolo possono contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla formazione di biofilm in ambienti naturali o nelle infezioni correlate ai biofilm. All'interno di una cappa a flusso laminare, trasferire una colonie di Posa PAO1 GFP e una colonia di E. coli DH5α da una piastra LB in provette separate contenenti tre millilitri di brodo LB.Incubare le colture durante la notte a 37 gradi Celsius agitando a 225 giri al minuto. Questo sistema di flusso si basa su una cella microfluidica con doppio ingresso che facilita l'osservazione della crescita del biofilm in presenza di un gradiente chimico ben definito, generato dalla miscelazione di due soluzioni all'interno della camera di flusso. Durante il flusso, si forma un gradiente di concentrazione uniforme in direzione trasversale.A causa della diffusione, il profilo di concentrazione è ripido vicino all'ingresso e più attenuato a valle. Nel giorno dell'esperimento, assemblare con cura il sistema di flusso. Innanzitutto, fissare il tubo alla pompa peristaltica, quindi collegare un'estremità del tubo a una bottiglia contenente 900 millilitri di mezzo FAB con glucosio, e l'altra estremità a un trappola per bolle.Ripetere questo processo per collegare una seconda bottiglia di mezzo litro contenente 900 millilitri di fab senza glucosio a una seconda trappola per bolle. Successivamente, inserire valvole a tre vie appena prima degli ingressi della cella a flusso e collegare ciascuna delle trappole per bolle alla cella a flusso. Infine, collegare l'uscita della cella a flusso a una bottiglia per rifiuti.Assicurarsi che la cella a flusso sia posizionata con il lato del vetrino coprioggetto rivolto verso il basso, in modo da permettere alle cellule sospese di depositarsi sul vetrino. Dopo aver assemblato il sistema a flusso, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 millilitri all'ora per ogni ingresso per riempire il sistema. Il mezzo fab viene introdotto nei due ingressi, con glucosio fornito soltanto in uno dei due. Successivamente, operando nella cappa, diluire le due colture batteriche in rapporto uno a uno in un millilitro di acqua sterile, con un OD 600 equivalente di 0.01 per ciascun batterio, per inoculare la cella a flusso; utilizzare una siringa di plastica sterile per iniettare 500 microlitri di inocolo in ciascuno dei due ingressi della cella a flusso attraverso la valvola a tre vie.Dopo l'iniezione, arrestare la pompa e lasciare che le cellule batteriche si attacchino al vetrino per un'ora; una volta che le cellule si sono attaccate, impostare la pompa a 0,03 millilitri al minuto per ogni ingresso e far fluire il sistema per tre giorni a temperatura ambiente, durante i quali si sviluppa un biofilm sotto un gradiente di esposizione al glucosio. Trascorsi tre giorni, utilizzare un pennarello e un righello per disegnare una griglia sul lato del vetrino della cella a flusso in preparazione all'acquisizione delle immagini.Questo aiuterà a individuare le regioni di imaging da controcolorare per l'osservazione di e coli. Innanzitutto, spegnere le luci per oscurare l'area di lavoro, poiché la controcolorazione è sensibile alla luce. Utilizzare una siringa per iniettare lentamente un millilitro di colorante rosso fluorescente per acidi nucleici, permeante alle cellule e diluito, nella valvola a tre vie a monte della camera di flusso.Fermare il flusso. Mantenere la cella a flusso stagnante al buio per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti.Riprendere il flusso a 0,03 millilitri al minuto e lavare lo stain non legato per 15 minuti. Quindi arrestare il flusso ed osservare i biofilm mediante microscopia confocale con un obiettivo da 63 x. Individuare un campo visivo contenente una quantità adeguata di biomassa con colonie di biofilm ben separate, come mostrato qui.Quindi acquisire pile di immagini 3D nei canali appropriati per mappare i modelli spaziali dello sviluppo del biofilm all'interno dell'immagine della cella a flusso, i biofilm in corrispondenza di tre o più distanze longitudinali o lungo l'asse X rispetto all'ingresso della cella a flusso e in tre posizioni trasversali o lungo l'asse Y rispetto al gradiente nutrizionale imposto. Per caratterizzare i modelli di trasporto della soluzione all'interno del biofilm, iniziare con la cella a flusso. Dopo tre giorni di sviluppo del biofilm, nuovamente, operando al buio.Fermare la pompa per interrompere il flusso, aprire le trappole per bolle per rilasciare la pressione di iniezione. Quindi utilizzare una siringa per iniettare un millilitro di soluzione diluita del tracciante sci-fi in una delle valvole a tre vie a monte della cella di flusso. Dopo aver iniettato la soluzione sci-fi, chiudere le trappole per bolle.Regolare la valvola a tre vie e riavviare la pompa a 0,03 millilitri al minuto per erogare la soluzione sci-fi nella cella a flusso. Successivamente, passare alla modalità di acquisizione confocale XYT con una frequenza di acquisizione di 0,15 hertz. È preferibile un'elevata risoluzione temporale per visualizzare la penetrazione del colorante, tuttavia, una scansione rapida riduce la qualità dell'immagine.Impostare quindi la velocità di scansione e la media delle linee in modo da bilanciare la risoluzione temporale dell'acquisizione con la qualità dell'immagine. Una volta impostati i parametri di acquisizione, riavviare la pompa per riprendere il flusso. Alla velocità di 0,03 millilitri al minuto, sci five verrà erogato contemporaneamente nella cella a flusso.Avviare l'acquisizione confocale in time-lapse. Al termine dell'acquisizione in time-lapse, eseguire l'analisi della diffusione seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato.Per caratterizzare il campo di flusso intorno ai biofilm, diluire le microsfere fluorescenti di un micrometro in acqua sterilizzata fino a una concentrazione finale di solidi dello 0,2% e un volume finale di 0,5 millilitri. Quindi, vortexare per assicurarsi che le microsfere siano ben disperse, arrestare il flusso e quindi iniettare e introdurre le microsfere fluorescenti diluite nella cella di flusso. Come in precedenza, modificare la portata a 0,01 millilitri all'ora.La bassa portata consente un monitoraggio accurato del percorso della particella. Passare alle impostazioni confocali in modalità XYT e impostare il software per tracciare il movimento della particella in una singola fetta Z. Acquisire serie temporali di immagini come in precedenza, utilizzando una frequenza di acquisizione di un hertz. Ripetere la procedura di iniezione delle particelle e acquisire immagini in diverse posizioni assiali (Z). Al termine dell'acquisizione, seguire le istruzioni riportate nel documento allegato per calcolare i vettori di flusso e studiare le interazioni batteriche in un biofilm sottoposto a un gradiente di glucosio. Posa GFP ed E. coli sono stati differenziati nei biofilm a due specie mediante colorazione contrastante.Con cyto sono state acquisite 62 immagini in ciascuna delle nove regioni di imaging sulla camera a flusso. Negli overlay mostrati qui, posa GFP appare verde o gialla, ed e coli appare rossa. Posa ha dominato la biomassa del biofilm nelle regioni con alte concentrazioni di glucosio, mentre e coli ha dominato nelle regioni con basse concentrazioni di glucosio.Pertanto, le due specie occupavano nicchie ecologiche distinte. Questi risultati dimostrano l'utilità della cella a flusso microfluidica con doppio ingresso nello studio dell'attività di sviluppo dei biofilm e delle interazioni in ambienti complessi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare una cella a flusso microfluidica con doppio ingresso per coltivare biofilm in gradienti chimici e di come ottenere parametri ambientali per lo sviluppo dei biofilm mediante l'iniezione di particelle fluorescenti o traccianti dopo lo sviluppo.Questi metodi hanno aperto la strada ai ricercatori nei campi della microbiologia ambientale e clinica per esplorare le complesse interazioni tra comunità microbiche e l'ambiente circostante.

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Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Fonte: Miquel Guennoc, C., et al. Nuovo metodo per l'analisi qualitativa multiscala di biofilm batterici su colonie fungine filamentose utilizzando microscopia confocale ed elettronica. J. Vis. Esp. (2017)Questo video mostra la preparazione di una coltura fungina su membrane di cellofane trattate per supportare la formazione di colonie e la crescita radiale. Successivamente mostra la coltivazione e la preparazione delle cellule batteriche del suolo per saghi di interazione. Infine, illustra...

Stabilimento di una co-coltura fungo-batterica per la formazione di biofilm

Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

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L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

Il ruolo di assortimento (segregazione spaziale) in scenari evolutivi può essere esaminato utilizzando semplici sistemi microbici in laboratorio che permettono la regolazione della distribuzione spaziale controllato. Modificando la densità cellulare fondatore, vari livelli di assortimento possono essere visualizzati utilizzando ceppi batterici fluorescente nei biofilm colonie di Bacillus subtilis.

Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Citometria a flusso in combinazione con il clustering visual offre un facile da usare e veloce metodo per lo studio di biofilm acquatici. Può essere utilizzato per la caratterizzazione di biofilm, rilevamento delle modifiche nella struttura della comunità di biofilm e la rilevazione delle particelle abiotiche incorporato nel biofilm.

Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

I biofilm microbici formano architetture complesse a interfasi e si sviluppano in modelli spaziali altamente dipendenti dalla scala. Qui, introduciamo un sistema sperimentale (hard e software) per l'acquisizione automatizzata di set di dati di tomografia a coerenza ottica 3D (OCT). Questo set di strumenti consente la caratterizzazione non invasiva e multiscala della morfogenesi dei biofilm nello spazio e nel tempo.

Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

Le alterazioni indotte da antimicrobici dell'architettura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa differiscono tra gli isolati clinici coltivati da pazienti con fibrosi cistica e infezione polmonare cronica. Dopo la microscopia confocale, il software COMSTAT può essere utilizzato per quantificare le variazioni nell'architettura del biofilm (ad esempio, area superficiale, spessore, biomassa) per i singoli isolati per valutare l'efficacia degli agenti anti-infettivi.

Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT

Qui viene presentata una procedura rapida e standardizzata per stabilire comunità di biofilm multispecie sinergiche da vari suoli della rizosfera. Si tratta di un protocollo unico progettato per sondare e simulare il complesso microbiota del suolo della rizosfera.

Un approccio alla costruzione di comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera

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Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

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