Lievito Colony metodo di inserimento
22 marzo 2011
Un metodo per l'integrazione di colonie di lievito che permette di sezionamento per la microscopia ottica ed elettronica. Questo protocollo consente di determinare la distribuzione delle cellule sporigeni e cellule pseudohyphal all'interno di colonie disposizione un nuovo strumento per comprendere l'organizzazione di tipi di cellule all'interno di una comunità fungine.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incorporare colonie di lievito. Ciò si ottiene rimuovendo prima una colonia e l'agar sottostante da una piastra di agar, posizionandola su diverse gocce di agar fuso e coprendola rapidamente con altro aer fuso. Successivamente, l'AER in eccesso viene tagliato dalla colonia per renderla abbastanza piccola da entrare in uno stampo.
La colonia di AER incorporata viene quindi fissata, colorata, disidratata e infine infiltrata con resina di speroni. Il blocco viene quindi posto in uno stampo con ulteriori speroni di resina incubati fino a indurimento e quindi sezionato. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la distribuzione dei tipi di cellule all'interno di una colonia di lievito attraverso la microscopia ottica o elettronica.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica a scansione, è che consente di determinare la struttura interna della colonia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo microbico, come la distribuzione dei tipi di cellule all'interno delle colonie. Questo metodo ha fornito informazioni sulla struttura delle colonie di croce CAC, ma è probabile che possa essere applicato anche ad altri microrganismi.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la manipolazione e l'inclusione delle colonie possono essere difficili da apprendere da un protocollo scritto. L'idea di questo metodo è stata ispirata da alcuni dati genetici che abbiamo pubblicato nel 2002 che suggerivano che le spore non erano distribuite uniformemente nelle colonie. Abbiamo adattato un metodo per il sezionamento delle colonie che è stato sviluppato da engelberg nel laboratorio delle pinne.
Quindi iniziamo. Iniziare incubando il lievito Wild S visi su piastre a coclea a 30 gradi fino a quando non sono presenti circa 300 colonie. Usando una spatola stretta, rimuovere le colonie di uno o due millimetri di diametro, una alla volta dalla piastra.
Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, la punta dell'uomo posiziona diverse gocce di agar al 2% a 42 gradi Celsius su un vetrino da microscopio e posiziona immediatamente la colonia sull'agar a faccia in su prima che l'AER si solidifichi. Metti diverse altre gocce di agar sulla colonia e lascia che l'agar si solidifichi assicurandoti che l'intera colonia, compresa la parte superiore della colonia, sia racchiusa nell'agar. In tutti i passaggi successivi del protocollo con una lama di rasoio.
Taglia l'AER attorno alla colonia e posiziona il blocco AER contenente la colonia. In una fiala da 3,5 millilitri di silicato di silicato contenente il 2% di aldeide paraforme e il 2% di glutaraldeide, devono essere lavorate colonie fissative una alla volta per evitare l'essiccazione, ma nella stessa fiala possono essere inserite fino a 10 colonie. Lasciare le colonie per sette giorni a quattro gradi Celsius.
Dopo una settimana, rimuovere il fissativo e lavare le colonie agricole due volte, utilizzando circa 1,5 millilitri di sodio molare 0,15. Catare a pH 7,2 e incubare su ghiaccio dopo ogni lavaggio per 15 minuti senza agitare. Successivamente questo lavaggio altre due volte.
Utilizzando 1,5 millilitri di un tampone X OS, composto da 100 millimolari di fosfato monopotassico, 10 millimolari di cloruro di magnesio a pH 6,0, incubando su ghiaccio per cinque minuti dopo ogni lavaggio. Successivamente, utilizzando la stessa fiala, eseguire il trattamento con osmio e i lavaggi elencati qui e nella parte scritta di questo protocollo. Quindi, di nuovo, utilizzando la stessa fiala, eseguire le disidratazioni graduali elencate qui e nel protocollo scritto allegato la mattina successiva.
Preparare il reagente degli speroni come mostrato qui e nel protocollo scritto allegato. Lavare immediatamente i blocchi agricoli cinque volte per 10 minuti ciascuno con 1,5 millilitri di etanolo al 100% a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio con etanolo, rimuovere solo una quantità sufficiente di etanolo in modo che il blocco agricolo rimanga coperto.
Utilizzando una pipetta da pascolo, inserire circa 0,5 millilitri di reagente speroni nella fiala e ruotare su una ruota a bassa velocità per 15 minuti. A temperatura ambiente dopo la rotazione, lasciare riposare la fiala per 30 minuti. Quindi, rimuovere completamente la soluzione.
Quindi aggiungere 1,5 millilitri di reagente speroni per coprire il blocco agricolo. Anche in questo caso, ruotare la fiala su una rotella per 15 minuti a temperatura ambiente e lasciare riposare per 30 minuti. Ripetere questo lavaggio.
Fai un passo altre tre volte. Dopo gli ultimi 30 minuti, rimuovere il reagente degli speroni e aggiungere un nuovo reagente per gli speroni per coprire i blocchi. Lasciare riposare i blocchi agricoli a temperatura ambiente per quattro ore.
Sostituire il reagente degli speroni e ruotare durante la notte. La mattina seguente, sostituire il reagente degli speroni e lasciare le fiale in rotazione fino al giorno successivo. La mattina successiva, posizionare il reagente degli speroni in stampi di silicone numerati per coprire appena il fondo degli stampi.
Quindi posizionare i blocchi di agri negli stampi e incubare a 60 gradi Celsius per quattro ore. Dopo quattro ore, completare gli stampi con altri speroni, reagente e incubare a 60 gradi Celsius durante la notte. Rimuovere i blocchi dallo stampo per il sezionamento.
Qui è mostrato un esempio di micrografia a luce di una sezione attraverso il centro di una colonia di colonia di lievito Wild S Visia. Questo lievito è un ceppo di tipo selvatico isolato dagli essudati degli alberi. La colonia è stata incubata per sei giorni su terreno YNA prima del sezionamento.
In questa immagine, l'asai, lo pseudo hyphy e il lievito ovoidale sono facilmente distinguibili ed è evidente anche la regione della colonia che invade l'agar sottostante. Le frecce aperte indicano le frecce riempite asai rappresentative indicano le celle vegetative ovoidali rappresentative la punta della freccia piena indica catene di cellule allungate e si. Questa immagine è un esempio di micrografia elettronica da una sezione sottile di un ceppo di lievito da laboratorio SH 1 0 2 0 e W 3 0 3.Background.
La colonia è stata incubata per sei giorni su terreno YNA prima del sezionamento. L'immagine mostra una regione della colonia contenente un'alta frequenza di cellule sporulate. Una freccia indica la struttura a doppio strato della parete di spore.
Nella parte A, mostriamo una sezione di una colonia di quattro giorni con una griglia composta da 15 rettangoli sovrapposti all'immagine nella parte B.La frequenza delle cellule correlate alle spore in ogni rettangolo è l'innesto con le 15 barre corrispondenti ai 15 rettangoli mostrati nella parte A.I dati sono la media e l'errore standard di quattro colonie indipendenti di quattro giorni Nella parte C, Vengono mostrati i mezzi e gli errori standard per quattro colonie indipendenti di otto giorni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane con un giorno intero e diversi giorni da una a tre ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di aggiungere immediatamente le soluzioni in modo che i blocchi non si secchino Seguendo questa procedura.
Altri metodi, come la microscopia immunoelettronica, potrebbero essere utilizzati per determinare la distribuzione delle cellule che esprimono particolari proteine dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ci ha permesso di osservare non solo il patterning delle cellule sporulate, ma anche il patterning delle cellule pseudoifali nelle colonie di croce CCI. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare le colonie di lievito per il sezionamento.
Non dimenticare che molti dei reagenti per microscopia utilizzati in questo protocollo possono essere estremamente pericolosi. Ricordarsi di utilizzare una cappa aspirante, indossare indumenti protettivi e smaltire correttamente i reagenti. Ok, questo è tutto.
Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per incorporare colonie di lievito, consentendo il sezionamento per microscopia ottica ed elettronica. Il protocollo facilita l'analisi di cellule sporulate e pseudoifali all'interno delle colonie, contribuendo alla comprensione dell'organizzazione dei tipi cellulari nelle comunità fungine.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Biologia fungina
Contesto
- Le colonie di lievito presentano diversi tipi cellulari.
- Comprendere la distribuzione cellulare è cruciale per studiare le comunità fungine.
- I metodi tradizionali potrebbero non fornire informazioni dettagliate sull'organizzazione cellulare.
- Questo metodo offre un nuovo approccio per la visualizzazione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo per incorporare colonie di lievito.
- Consentire un'analisi dettagliata della distribuzione dei tipi cellulari.
- Migliorare la comprensione dell'organizzazione delle comunità fungine.
Metodi utilizzati
- Rimozione delle colonie di lievito da piastre di agar.
- Incorporazione delle colonie in agar fuso.
- Taglio dell'agar in eccesso per adattarsi agli stampi.
- Fissazione, colorazione, disidratazione e infiltrazione con resina.
Risultati principali
- Incorporazione riuscita di colonie di lievito per microscopia.
- Visualizzazione di cellule sporulate e pseudoifali.
- Analisi dettagliata della distribuzione dei tipi cellulari all'interno delle colonie.
- Nuove intuizioni sull'organizzazione delle comunità fungine.
Conclusioni
- Il metodo di incorporazione è efficace per l'analisi al microscopio.
- Fornisce uno strumento prezioso per studiare la struttura delle colonie di lievito.
- La ricerca futura può basarsi su questo metodo per esplorare le interazioni fungine.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
