Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet
21 maggio 2020
Un collo di bottiglia nel ciclo "design-build-test" dell'ingegneria microbica è la velocità con cui possiamo eseguire schermi funzionali di ceppi. Descriviamo un metodo ad alto throughput per lo screening della deformazione applicato a centinaia a migliaia di cellule di lievito per esperimento che utilizza il sequenziamento dell'RNA basato sulle gocciole.
ICO, o ICO-seq è il primo adattamento del sequenziamento dell'RNA ad alta produttività ai microbi. Questo metodo ha valutato la funzione microbica su scala genomica. Per i microbi ingegnerizzati, questo metodo può chiarire come le modifiche al genoma microbico possano perturbare le sue funzioni.
Ottenere lievito da una coltura di sospensione e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere di nuovo le cellule in PBS ad una concentrazione di circa 750.000 cellule per millilitro. Quindi, mescolare l'agarosio del punto di fusione ultra-basso in PBS e riscaldare la miscela a 90 gradi Celsius, fino a quando l'agarosio si scioglie.
Caricare la miscela di agarosio in una siringa, con un filtro da 0,22 micron collegato. Posizionare una pompa per siringhe davanti a un riscaldatore di spazio impostato su 80 gradi Celsius e posizionare la siringa nella pompa. Riempire una seconda siringa con la sospensione del lievito e riempire una terza siringa con olio fluorurato, con fluorosuperfattivo ionico al 2%.
Caricare entrambe le siringhe nelle pompe della siringa. Collegare il tubo dalle siringhe al dispositivo A.Posizionare un tubo conico da 15 millilitri in un secchio di ghiaccio e guidare il tubo di uscita nel tubo conico. Impostare la portata per ogni siringa e raccogliere circa un millilitro di emulsione nel tubo conico da 15 millilitri.
Dopo aver atteso cinque minuti per impostare l'agarosio nel tubo, aggiungere un volume uguale di perfluoro-ottanolo al 20% in olio fluorurato all'emulsione. Mescolare l'emulsione e il perfluoro-ottanolo invertendo il tubo conico alcune volte. Centrifugare l'emulsione rotta a 2.000 volte G per due minuti.
Assicurarsi che gli idrogel si siano pelletati sopra le fasi dell'olio e della PFO. Rimuovere le fasi di olio e PFO. Aggiungere due millilitri di tampone tet(W) per sospendere di nuovo gli idrogel.
Trasferire la sospensione in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare di nuovo il tubo a 2.000 volte G per due minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente gli idrogel in tet(W).
Dopo aver filato gli idrogel a 2.000 volte G per due minuti, sospendere di nuovo gli idrogel in due millilitri di mezzo di coltura del lievito. Incubare il tubo durante la notte a 30 gradi Celsius, con tremori. Ogni ceppi cresce a tassi diversi.
La scelta di un tempo di media e incubazione appropriato è essenziale per garantire che il lievito cresca all'interno dell'idrogel, ma non cresca troppo, portando le cellule a fuoriuscire nei media. In primo luogo, trasferire gli idrogel in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 2.000 volte G per due minuti.
Lavare gli idrogel due volte con PBS e poi una volta in tampone di sferoplastizzazione. Eseguire una diluizione 40x dell'enzima sferoplastante nel tampone di sferoplastizzazione. Quindi, aggiungere un millilitro dell'enzima diluito agli idrogel.
Incubare il tubo degli idrogel a 37 gradi Celsius per un'ora. Il lievito trattato sarà più trasparente. Dal tubo contenente la sospensione dell'idrogel, prelevare 0,8 millilitri della sospensione dal fondo del tubo e trasferirlo in una siringa non con aggiunta di un millilitro.
Posizionare la siringa nel supporto per siringhe stampato in 3D. Centrifugare la siringa e il supporto a 2.000 volte G per due minuti. Prima di procedere, assicurarsi che gli idrogel siano ben imballati sul fondo della siringa.
Posizionare 240.000 perline drop-seq in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifuga il tubo a 1.000 volte G per un minuto. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le perline in due millilitri di tampone di lysis di lievito 0,9x, con cloruro di sodio 500 millimolare.
Inserire una barra di agitazione e trasferire la sospensione del tallone in una siringa da tre millilitri. Preparare un'altra siringa, contenente diversi millilitri di tensioattivi PFPE-PEG in olio fluorurato. Ottenere la siringa precedentemente preparata di idrogel confezionati di cloni di lievito.
Evacuare la testa di acquiescenza e captare la siringa. Inserire le tre siringhe, gli idrogel, le sospensioni perline e l'olio nelle pompe per siringhe. Collegare le siringhe tramite tubi al dispositivo B, il dispositivo di incapsulamento.
Posizionare l'estremità del tubo di uscita in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Impostare la portata per ogni siringa. Raccogliere circa 1.000 millilitri di emulsione o eseguire il dispositivo fino a quando non rimangono idrogel.
Quindi seguire il protocollo drop-seq per la sintesi cDNA, la preparazione della libreria e il sequenziamento. Utilizzando un dispositivo microfluidico, le cellule di lievito sono state incapsulate in goccioline da 160 micrometri. Uno splitter otto volte divise queste goccioline in otto goccioline da 60 micrometri.
L'incubazione notturna ha portato alla crescita di colonie di lievito isogenico all'interno di alcuni idrogel. Prima di caricare gli idrogel di lievito nel secondo dispositivo microfluidico, sono stati lavati e immersi in una soluzione per digerire le pareti cellulari. La corretta digestione è stata verificata per microscopia, con cellule di lievito trattate con una morfologia più riflettente.
Un flusso di perline di cattura dell'mRNA nel tampone di lysis è stato mescolato con un flusso di idrogel di lievito a confezionamento ravvicinato prima della giunzione di rilascio del secondo dispositivo microfluidico. Nell'emulsione risultante, circa il 10% delle goccioline raccolte conteneva una perla con una colonia di lysed. Questo flusso di lavoro di sequenziamento della colonia isogenica è stato utilizzato per analizzare la risposta di commutazione opaca bianca dei C.albicans.
Il componente principale, pc, analisi e una riduzione della dimensionalità tSNE hanno indicato una concordanza generale tra il set di dati campione e un set di dati di riferimento. L'analisi TSNE ha rivelato tre ammassi di cellule. Mentre il cluster due era composto prevalentemente da celle del set di dati di esempio, i cluster zero e uno erano costituiti da celle di entrambi i campioni.
La sovrapposizione dell'espressione WH11 sul tSNE indicava che l'ammasso conteneva probabilmente colonie bianche. L'espressione STF2 è aumentata nel cluster uno, coerentemente con i dati ottenuti in precedenza. Nei cluster zero e due, WH11 e STF2 erano significativamente down-regulated rispetto al cluster uno.
I microbi androgeni hanno un potenziale sempre maggiore per produrre in serie prodotti biologici per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. Seguendo questa procedura, è possibile applicare una varietà di strumenti bioinformatici per analizzare ulteriormente i dati di sequenziamento.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo ad alto rendimento per la selezione di ceppi nell'ingegneria microbica, utilizzando specificamente il sequenziamento dell'RNA basato su goccioline per analizzare cellule di lievito. Il metodo consente valutazioni funzionali di microrganismi ingegnerizzati su scala genomica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria microbica
- Selezione ad alto rendimento
- Sequenziamento dell'RNA
Sfondo
- Lo screening funzionale di ceppi microbici è spesso lento e inefficiente.
- I metodi ad alto rendimento possono aumentare significativamente la velocità di queste valutazioni.
- Il sequenziamento dell'RNA basato su goccioline offre un approccio innovativo per valutare le funzioni microbiche.
- Comprendere le perturbazioni del genoma può guidare strategie di ingegneria microbica.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di screening rapido per ceppi di lievito mediante sequenziamento dell'RNA.
- Chiarire gli impatti funzionali delle modifiche genomiche nei microrganismi ingegnerizzati.
- Migliorare l'efficienza del ciclo progetta-costruisci-verifica nell'ingegneria microbica.
Metodi Utilizzati
- Le cellule di lievito sono state coltivate e preparate a una concentrazione specifica.
- Sono state utilizzate microfluidica basata su goccioline per incapsulare le cellule di lievito.
- È stata eseguita una sequenza dell'RNA sulle cellule incapsulate per valutare l'espressione genica.
- Sono stati applicati strumenti bioinformatici per analizzare i dati di sequenziamento.
Risultati principali
- Il metodo ha incapsulato con successo cellule di lievito in goccioline per l'analisi ad alto rendimento.
- Sono state generate colonie isogeniche e analizzate per i profili di espressione genica.
- L'analisi delle componenti principali ha rivelato cluster distinti di espressione genica.
- I risultati hanno indicato differenze significative nell'espressione genica correlate alla morfologia delle colonie.
Conclusioni
- Questo metodo ad alto rendimento migliora la capacità di analizzare in modo efficiente ceppi microbici.
- Le informazioni ottenute possono guidare futuri interventi di ingegnerizzazione di microrganismi per applicazioni biotecnologiche.
- L'approccio è applicabile a diverse specie microbiche oltre al lievito.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il screening ad alto rendimento di ceppi rimane un collo di bottiglia nell'ingegneria microbica nonostante i progressi nell'editing del genoma. Questo metodo di sequenziamento dell'RNA basato su goccioline consente una valutazione funzionale a livello del genoma dei ceppi di lievito ingegnerizzati, affrontando direttamente il compromesso tra produzione di informazioni e rendimento. Fornendo un'inferenza fenotipica a partire dai profili trascrizionali, supporta una selezione predittiva dei ceppi con maggiore affidabilità e accelera il ciclo progetta-costruisci-verifica nella produzione di biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando modifiche genomiche a fenotipi funzionali mediante letture su scala trascrittoma.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso un profilo quantitativo dell'espressione genica che chiarisce gli effetti a livello di percorsi determinati da modifiche genetiche.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio identificando ceppi con firme di espressione desiderate associate a percorsi bersaglio, riducendo la dipendenza da saggi a bassa produttività.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera colonie isogeniche di lievito standardizzate, incapsulate in goccioline, adatte per lo screening fenotipico basato su RNA-seq riproducibile.
- Scalabilità: Consente l'elaborazione parallela di migliaia di ceppi geneticamente distinti, superando i limiti dei metodi tradizionali di selezione delle colonie e basati su matrici.
- Qualità dei dati: Produce misurazioni quantitative ed espanse dell'espressione genica, consentendo confronti robusti tra librerie di ceppi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Applicato al passaggio bianco-opaco di Candida albicans, un fenotipo associato alla virulenza, dimostrandone l'utilità nella caratterizzazione di ceppi patogeni.
- Continuità traslazionale: Collega modifiche genetiche a risultati fenotipici attraverso biomarcatori di espressione (ad esempio, WH11, STF2), supportando la selezione di ceppi allineata ai biomarcatori.
- Riduzione del rischio preclinico: Permette l'identificazione precoce di ceppi non funzionali o anomali, riducendo il rischio di fallimento nello sviluppo successivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro di ingegneria dei ceppi microbici, dalla costruzione della libreria alla validazione funzionale, consentendo una priorizzazione dei ceppi guidata dal trascrittoma prima dell'identificazione del ceppo promettente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando come le perturbazioni genomiche influenzino l'espressione genica globale in contesti isogenici.
- Screening: Fornisce sistemi microbici standardizzati e pronti per il saggio, con output trascrizionali riproducibili, per testare la risposta a composti o condizioni.
- Analisi: Offre cluster di espressione derivati da PCA e tSNE e sovrapposizioni di geni marcatore che consentono la classificazione fenotipica e il confronto tra ceppi.
- Ricerca traslazionale: Collega i genotipi dei ceppi agli stati fenotipici attraverso marcatori conservati, favorendo la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di librerie di ceppi di lievito e altri microrganismi in progetti multipli e aree terapeutiche diverse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle relazioni tra ceppo e funzione riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie a dati di espressione su scala genomica.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione mediante l'incapsulamento microfluidico e la crescita controllata di colonie su idrogel.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'allocazione del capitale consentendo una rapida valutazione multiparametrica dei ceppi.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento adeguato al rischio identificando precocemente nello sviluppo ceppi con profili molecolari indicativi di fenotipi desiderati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, genetica del lievito e preparazione di librerie per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
- Presuppone l'accesso a dispositivi per la generazione di goccioline, oli fluorurati, surfattanti e infrastrutture a valle per il sequenziamento e l'analisi bioinformatica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dell'idrogel, sferoplastazione e accoppiamento a microsfere, al fine di ottenere risultati coerenti.
- Richiede l'ottimizzazione del tempo di incubazione e del mezzo di coltura per prevenire una crescita eccessiva dell'idrogel e la fuoriuscita delle cellule, fenomeni dipendenti dal ceppo utilizzato.
- È limitato dalla necessità di disporre di biomarcatori trascrizionali con associazioni fenotipiche note, necessarie per effettuare inferenze fenotipiche accurate a partire dai dati di RNA-seq.
