Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet

Un collo di bottiglia nel ciclo "design-build-test" dell'ingegneria microbica è la velocità con cui possiamo eseguire schermi funzionali di ceppi. Descriviamo un metodo ad alto throughput per lo screening della deformazione applicato a centinaia a migliaia di cellule di lievito per esperimento che utilizza il sequenziamento dell'RNA basato sulle gocciole.

ICO, o ICO-seq è il primo adattamento del sequenziamento dell'RNA ad alta produttività ai microbi. Questo metodo ha valutato la funzione microbica su scala genomica. Per i microbi ingegnerizzati, questo metodo può chiarire come le modifiche al genoma microbico possano perturbare le sue funzioni.

Ottenere lievito da una coltura di sospensione e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere di nuovo le cellule in PBS ad una concentrazione di circa 750.000 cellule per millilitro. Quindi, mescolare l'agarosio del punto di fusione ultra-basso in PBS e riscaldare la miscela a 90 gradi Celsius, fino a quando l'agarosio si scioglie.

Caricare la miscela di agarosio in una siringa, con un filtro da 0,22 micron collegato. Posizionare una pompa per siringhe davanti a un riscaldatore di spazio impostato su 80 gradi Celsius e posizionare la siringa nella pompa. Riempire una seconda siringa con la sospensione del lievito e riempire una terza siringa con olio fluorurato, con fluorosuperfattivo ionico al 2%.

Caricare entrambe le siringhe nelle pompe della siringa. Collegare il tubo dalle siringhe al dispositivo A.Posizionare un tubo conico da 15 millilitri in un secchio di ghiaccio e guidare il tubo di uscita nel tubo conico. Impostare la portata per ogni siringa e raccogliere circa un millilitro di emulsione nel tubo conico da 15 millilitri.

Dopo aver atteso cinque minuti per impostare l'agarosio nel tubo, aggiungere un volume uguale di perfluoro-ottanolo al 20% in olio fluorurato all'emulsione. Mescolare l'emulsione e il perfluoro-ottanolo invertendo il tubo conico alcune volte. Centrifugare l'emulsione rotta a 2.000 volte G per due minuti.

Assicurarsi che gli idrogel si siano pelletati sopra le fasi dell'olio e della PFO. Rimuovere le fasi di olio e PFO. Aggiungere due millilitri di tampone tet(W) per sospendere di nuovo gli idrogel.

Trasferire la sospensione in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare di nuovo il tubo a 2.000 volte G per due minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente gli idrogel in tet(W).

Dopo aver filato gli idrogel a 2.000 volte G per due minuti, sospendere di nuovo gli idrogel in due millilitri di mezzo di coltura del lievito. Incubare il tubo durante la notte a 30 gradi Celsius, con tremori. Ogni ceppi cresce a tassi diversi.

La scelta di un tempo di media e incubazione appropriato è essenziale per garantire che il lievito cresca all'interno dell'idrogel, ma non cresca troppo, portando le cellule a fuoriuscire nei media. In primo luogo, trasferire gli idrogel in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 2.000 volte G per due minuti.

Lavare gli idrogel due volte con PBS e poi una volta in tampone di sferoplastizzazione. Eseguire una diluizione 40x dell'enzima sferoplastante nel tampone di sferoplastizzazione. Quindi, aggiungere un millilitro dell'enzima diluito agli idrogel.

Incubare il tubo degli idrogel a 37 gradi Celsius per un'ora. Il lievito trattato sarà più trasparente. Dal tubo contenente la sospensione dell'idrogel, prelevare 0,8 millilitri della sospensione dal fondo del tubo e trasferirlo in una siringa non con aggiunta di un millilitro.

Posizionare la siringa nel supporto per siringhe stampato in 3D. Centrifugare la siringa e il supporto a 2.000 volte G per due minuti. Prima di procedere, assicurarsi che gli idrogel siano ben imballati sul fondo della siringa.

Posizionare 240.000 perline drop-seq in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifuga il tubo a 1.000 volte G per un minuto. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le perline in due millilitri di tampone di lysis di lievito 0,9x, con cloruro di sodio 500 millimolare.

Inserire una barra di agitazione e trasferire la sospensione del tallone in una siringa da tre millilitri. Preparare un'altra siringa, contenente diversi millilitri di tensioattivi PFPE-PEG in olio fluorurato. Ottenere la siringa precedentemente preparata di idrogel confezionati di cloni di lievito.

Evacuare la testa di acquiescenza e captare la siringa. Inserire le tre siringhe, gli idrogel, le sospensioni perline e l'olio nelle pompe per siringhe. Collegare le siringhe tramite tubi al dispositivo B, il dispositivo di incapsulamento.

Posizionare l'estremità del tubo di uscita in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Impostare la portata per ogni siringa. Raccogliere circa 1.000 millilitri di emulsione o eseguire il dispositivo fino a quando non rimangono idrogel.

Quindi seguire il protocollo drop-seq per la sintesi cDNA, la preparazione della libreria e il sequenziamento. Utilizzando un dispositivo microfluidico, le cellule di lievito sono state incapsulate in goccioline da 160 micrometri. Uno splitter otto volte divise queste goccioline in otto goccioline da 60 micrometri.

L'incubazione notturna ha portato alla crescita di colonie di lievito isogenico all'interno di alcuni idrogel. Prima di caricare gli idrogel di lievito nel secondo dispositivo microfluidico, sono stati lavati e immersi in una soluzione per digerire le pareti cellulari. La corretta digestione è stata verificata per microscopia, con cellule di lievito trattate con una morfologia più riflettente.

Un flusso di perline di cattura dell'mRNA nel tampone di lysis è stato mescolato con un flusso di idrogel di lievito a confezionamento ravvicinato prima della giunzione di rilascio del secondo dispositivo microfluidico. Nell'emulsione risultante, circa il 10% delle goccioline raccolte conteneva una perla con una colonia di lysed. Questo flusso di lavoro di sequenziamento della colonia isogenica è stato utilizzato per analizzare la risposta di commutazione opaca bianca dei C.albicans.

Il componente principale, pc, analisi e una riduzione della dimensionalità tSNE hanno indicato una concordanza generale tra il set di dati campione e un set di dati di riferimento. L'analisi TSNE ha rivelato tre ammassi di cellule. Mentre il cluster due era composto prevalentemente da celle del set di dati di esempio, i cluster zero e uno erano costituiti da celle di entrambi i campioni.

La sovrapposizione dell'espressione WH11 sul tSNE indicava che l'ammasso conteneva probabilmente colonie bianche. L'espressione STF2 è aumentata nel cluster uno, coerentemente con i dati ottenuti in precedenza. Nei cluster zero e due, WH11 e STF2 erano significativamente down-regulated rispetto al cluster uno.

I microbi androgeni hanno un potenziale sempre maggiore per produrre in serie prodotti biologici per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. Seguendo questa procedura, è possibile applicare una varietà di strumenti bioinformatici per analizzare ulteriormente i dati di sequenziamento.