Clonogenica saggio: cellule aderenti

Ciao, mi chiamo Lum e attualmente sto svolgendo il mio dottorato di ricerca presso il BE IDI Heart and Diabetes Institute sotto la supervisione del Dr.Tom Carianne, che è a capo del Laboratorio di Medicina Epigenomica. In questo video, dimostrerò la procedura nota come Clon Genic Survival Assay. Si tratta di una tecnica vecchia di 50 anni, che consente di valutare l'impatto di diversi trattamenti, come l'esposizione a radiazioni o agenti chimici, sulla vitalità riproduttiva cellulare.

Il saggio di sopravvivenza congenica è una tecnica centrale nella biologia delle radiazioni per valutare la sensibilità alle radiazioni di diverse linee cellulari e testare l'efficacia di diversi composti radioprotettivi o radiosensibilizzanti. Quando si utilizza una linea cellulare aderente ad A, il test di sopravvivenza criogenica consiste in tre fasi. In primo luogo, il trattamento di un monostrato di cellule aderenti.

In secondo luogo, la preparazione di una sospensione di una singola cellula e l'impiattamento di un numero noto di cellule e piatti dipinti, e in terzo luogo, la colorazione, il conteggio e le colonie formate dopo un periodo di incubazione. In questo video, utilizzerò cellule umane immortalizzate del cino site per dimostrare come il saggio della Bibbia poligenica possa essere utilizzato per determinare le proprietà di protezione radio dell'antiossidante naturale. 1225 flas M vengono seminati di cellule in cinque mil di terreno in anticipo, in modo che il giorno dell'esperimento ci siano 1 milione di cellule per pallone.

50 microlitri del farmaco vengono aggiunti a diverse concentrazioni ai cinque mil di terreno in ciascun pallone adeguatamente etichettato per raggiungere la concentrazione richiesta, vengono utilizzate cinque concentrazioni e un controllo del veicolo in questo caso, PBS. Dopo l'aggiunta del farmaco, le cellule vengono incubate per un'ora nelle condizioni appropriate per la linea cellulare utilizzata Dopo l'incubazione. I flussi, escludendo il gruppo di controllo, vengono irradiati al dosaggio scelto, che in questo caso è di quattro grigi prodotti da una sorgente di cesio emettitrice di raggi gamma.

Dopo l'irradiazione, i terreni vengono versati e ogni pallone viene lavato con due mil di PBS per cinque minuti. Dopo aver versato il PBS, due mil di tripsina allo 0,05% vengono aggiunti a ciascun pallone per staccare le cellule aderenti A dal pallone. Cinque millilitri di DMEM contenenti il 10% di siero fetale bovino vengono quindi aggiunti a ciascun pallone per disattivare la tripsina.

L'intero contenuto del fasc viene quindi trasferito in provette di falco da 10 millilitri etichettate. Una volta completate, queste provette vengono centrifugate per cinque minuti, dopodiché il supinatore viene scartato con cura senza disturbare il palato e a ciascuna provetta vengono aggiunti cinque mil di terreno di coltura. La concentrazione di cellule per ogni campione è calcolata ENC, così come il volume necessario di ciascun campione per raggiungere la concentrazione finale delle cellule da placcare in cinque piastre di Petri per campione con cinque millilitri di terreno ciascuna.

Ad esempio, per il gruppo di controllo, vengono piastrate 100 celle per piatto, quindi il volume necessario per ottenere 500 celle per 25 millilitri viene calcolato per campioni più concentrati, eseguire una diluizione 10 volte o una diluizione seriale 100 volte per ridurre al minimo l'errore coinvolto quando si utilizzano volumi inferiori a 100 microlitri. Ora il volume precedentemente calcolato viene preparato in una provetta Falcon contenente 25 millilitri di terreno per ogni campione. I campioni possono ora essere trasferiti su piastre pre to precedentemente etichettate, aggiungendo cinque millilitri a ciascuna piastra per facilitare la manipolazione e il trasporto.

Conserva i piatti in un contenitore grande, sterile o disinfettato. Le piastre vengono quindi poste in un'incubatrice umidificata nelle condizioni appropriate e incubate per otto giorni. Se si utilizzano cheratinociti dopo otto giorni, rimuovere con cura le piastre dall'incubatrice e disporle tutte una ad una all'interno di una cappa aspirante.

Fai attenzione a maneggiare il posto con delicatezza in modo che le colonie che si sono formate non vengano disturbate. Togliete i coperchi e aggiungete cinque ml di soluzione salina allo 0,9% in ogni piatto per lavarli. Puntare la punta di preparazione nell'angolo del piatto ed evitare di toccare il fondo del piatto in modo che eventuali colonie non vengano raschiate via accidentalmente.

Dopo cinque minuti, aspirare con cura la soluzione salina. Ora, le colonie vengono fissate con tre millilitri di formula al 4% e gli elettrocateteri devono essere sostituiti per evitare l'evaporazione. Dopo 15 minuti o mezz'ora, la formula viene aspirata e smaltita in modo appropriato.

Le colonie sono ora pronte per essere colorate con lo 0,1% di cristallovioletto, cinque millilitri vengono aggiunti a ogni piatto e i coperchi vengono sostituiti dopo mezz'ora o un'ora. Il colorante viene quindi lavato via con acqua distillata e le stoviglie vengono capovolte e lasciate asciugare per una notte. Le colonie sono ora pronte per essere contate.

Le colonie possono essere contate manualmente utilizzando un microscopio da dissezione. Qualsiasi gruppo di cellule contenente 50 o più cellule è considerato una colonia. E questo conclude la nostra dimostrazione del test di sopravvivenza congenica.

Il vantaggio principale di questo test rispetto ad altre tecniche è che è incredibilmente sensibile e può rilevare la sopravvivenza in un ampio intervallo anche dopo sei log di uccisione cellulare. Questo, questa sensibilità si ottiene placcando un numero maggiore di celle. Questo saggio può essere facilmente utilizzato per altri scopi, come il test, come il test della citotossicità.

Grazie per l'attenzione.