Name: Clonogenica saggio: cellule aderenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Impara il saggio di clonogenesi per valutare la viabilità riproduttiva cellulare in risposta a trattamenti come radiazioni o agenti chimici. Questa tecnica consolidata è fondamentale in biologia cellulare e radiobiologia.

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Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). HR è supportato da un australiano post-laurea e premi BakerIDI scintilla luminosa. Questo lavoro è finanziato dal CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), istituito e sostenuto nell&#39;ambito del programma di ricerca cooperativa del governo australiano Centri. CO è il destinatario un australiano post-laurea e un premio CRC-BID borsa di studio integrativa.

1. Cellule Cultura e set-up sperimentale <ol><li> Cheratinociti umani sono mantenuti come monostrati in 75 fiaschi tessuto cm 2 di coltura contenente 15 mL di cheratinociti-SFM (K-SFM) media (GIBCO, mezzo privo di siero) arricchito con L-glutamina (2 mm), fattore di crescita epidermico (5 ng / mL), estratto di ipofisi bovina (40 mg / ml) e 20 mg / mL di gentamicina. Le cellule sono coltivate in umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. </li><li> Le cellule vengono seminate in 12 x 25 cm 2 di tessuto fiasche di coltura contenente 5 ml di K-SFM media. </li></ol> Sospensioni singola cella sono preparati da tripsinizzazione. Le cellule sono lavate con tampone fosfato e incubate con un 0,05% tripsina / EDTA soluzione per 5-10 minuti. Quando le cellule iniziano a diventare arrotondate e ~ 30% individuale, da 3 volumi di medie Dulbecco modificato aquila contenente il 10% di siero fetale bovino viene aggiunto per neutralizzare la tripsina. Le cellule sono staccati pipettando su e giù (20 volte). Le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro. Numero di cellule appropriate sono teste di serie in base al tempo di raddoppio della linea cellulare (circa 20 ore per l&#39;uomo FEP-1811 cheratinociti). Lo scopo è quello di raggiungere confluenza ~ 90% (~ 10 6 cellule per cilindro), il giorno dell&#39;esperimento. Un esperimento composto da 12 fiaschi è ottimale per un singolo test clonogenica (sei controllo irraggiati e sei fiaschi irradiati) che può essere completato in circa quattro ore. 2. Trattamento e irradiazione <ol><li> Curare le cellule per un tempo adeguato con un contenuto significativo radiazioni modificando composto ed esporre le cellule a radiazioni ionizzanti o γ-radiazioni o raggi-X. </li></ol> Tipicamente sei fiaschi servire come efficienza placcatura (non trattato) e controlli unico farmaco. Gli altri sei palloni sono irradiati. In questo esempio cheratinociti umani sono trattati con varie concentrazioni di Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals integrità internazionale, Spring Hill, TN, Stati Uniti; dati rappresentativi per 20 mg / ml è indicato sotto), una formulazione idrosolubile antiossidante naturale, per 1 ora a 37 ° C. Le cellule sono irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min). 3. Placcatura <ol><li> Dopo il trattamento, sospensioni singola cella sono ottenuti come descritto in precedenza. </li><li> Il numero di cellule in ogni campione sono contati con cura utilizzando un emocitometro e diluito in modo tale che il numero di cellule appropriate sono seminati in piastre di Petri (cinque repliche di ciascuno in 15 piatti mm). La placcatura efficienza e / o sopravvivere frazione dovrebbe essere anticipato al momento di decidere il numero di cellule alle sementi per piastra. Lo scopo è quello di raggiungere una gamma di fra 20 - 150 colonie. </li> Piastre di Petri sono disposti in una scatola umidificata clonazione di plastica e incubate in un 5% di CO 2 ambiente a 37 ° C per la formazione di colonie. </ol> Il tempo di incubazione per la formazione di colonie varia da 1-3 settimane per le diverse linee cellulari, è accettato che il tempo deve essere pari ad almeno sei divisioni cellulari. In questo esempio, i piatti di controllo per cheratinociti umani richiedono otto giorni per formare cloni sufficientemente ampio costituito da 50 o più celle. 4. Fissaggio e colorazione Colonie Completare i seguenti passaggi in una cappa aspirante. <ol><li> Delicatamente rimuovere il supporto da ciascuna delle piastre per aspirazione. </li><li> Lavare ogni piatto con 5 ml di soluzione salina allo 0,9%. </li><li> Fissare le colonie con 5 ml di soluzione neutra al 10% formalina tamponata per 15-30 minuti. </li><li> Macchia viola con 5 ml 0,01% (w / v) di cristallo nella dH 2 O per 30-60 minuti. </li><li> Lavare viola eccesso di cristallo con dH 2 O e lasciare i piatti ad asciugare. </li></ol> 5. Conteggio delle colonie Stereomicroscopio <ol><li> Colonie contenenti più di 50 celle singole si contano utilizzando uno stereomicroscopio. </li></ol> Digital imaging e il conteggio utilizzando software di imaging <ol><li> Le immagini digitali delle colonie sono ottenuti utilizzando una fotocamera o dispositivo di scansione </li><li> Le colonie sono contate utilizzando l&#39;imaging pacchetti software di analisi come descritto di seguito. </li></ol> Conta delle cellule usando ImageJ (Fiji versione 1.44a) <ol><li> Aprire il file immagine in Fiji, andare su File -&gt; Apri. </li><li> Se necessario convertire l&#39;immagine in formato 8-bit, vai su Immagine -&gt; Regola Soglia ...-&gt;. </li><li> Regolare la soglia di ridurre i livelli di non-specifico background in modo che solo le colonie vengono rilevati. </li><li> Contare le colonie con la seguente: andare al processo - Binary&gt; -&gt; Trova maxima. </li></ol> Per questo formato di immagine, la tolleranza rumore può essere impostato a 0. Assicurarsi che l&#39;opzione di fondo della luce sia selezionata e visualizzare in anteprima i massimi rilevati per verificare che tutte le colonie di cellule sono stati correttamente registrati.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo esempio umano FEP-1811 cheratinociti sono stati trattati con diverse concentrazioni fino a 100 mg / ml CPF; dato viene mostrato per 20 mg / mL CPF per 1 ora a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono state irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Per i trattamenti di controllo non trattato solo di droga e 100 cellule sono state placcate in ogni capsula di Petri e 1000 cellule per piatto sono stati p...

<table><tbody><tr><td>Mezzo privo di siero per cheratinociti</td><td>Mezzo di crescita</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Supplementato con 2 mM L-glutammina, 20&amp;#x03BC;g/ml di gentamicina, fattore di crescita epidermico ed estratto di ipofisi bovina.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Tripsina 0,05% / EDTA per staccare le cellule aderenti; soluzione stock 10x diluita in PBS senza Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Mezzo essenziale modificato di Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Mezzo di crescita</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Supplementato con 10% di FBS e 20&amp;#x03BC;g/ml di gentamicina; utilizzato per neutralizzare la tripsina/EDTA.</td></tr><tr><td>Soluzione salina 0,09%</td><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td>Utilizzata per lavare le colonie.</td></tr><tr><td>Soluzione formale 10% neutra tampone</td><td>Soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Circa 4% di formaldeide; utilizzata per fissare le colonie.</td></tr><tr><td>Violetto cristallo</td><td>Polvere</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>Soluzione di violetto cristallo allo 0,01%, preparata in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, utilizzata per colorare le colonie.</td></tr><tr><td>Irradiatore Gammacell 1000 elite</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Scatola per clonazione</td><td></td><td></td><td></td><td>Scatola di plastica con fori praticati su lati opposti del coperchio; utilizzata per conservare le piastre di Petri durante l'incubazione prolungata per la formazione di colonie.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Modello 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Utilizzato per contare le colonie costituite da &amp;gt;50 cellule.</td></tr></tbody></table>

clonogenica saggio: cellule aderenti

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Il (o ​​formanti colonie) clonogenica saggio è stato stabilito per più di 50 anni, la carta originale che descrive la tecnica è stata pubblicata nel 1956 1. Oltre a documentare il metodo, lo studio punto di riferimento iniziale generato la prima dose di radiazioni curva di risposta per i raggi X irradiato mammiferi (HeLa), le cellule in coltura 1. Fondamentalmente, il saggio clonogenica consente una valutazione delle differenze di vitalità riproduttiva (capacità delle cellule di produrre progenie, cioè una singola cellula a formare una colonia di 50 o più cellule) tra le cellule di controllo non trattato e le cellule che hanno subito diversi trattamenti come l&#39;esposizione a radiazioni ionizzanti, composti chimici vari (es. agenti citotossici) o in altri casi la manipolazione genetica. Il test è diventata la tecnica più ampiamente accettata in biologia radiazioni ed è stato ampiamente utilizzato per valutare la sensibilità alle radiazioni di diverse linee cellulari. Inoltre, il saggio clonogenica è comunemente usato per monitorare l&#39;efficacia di composti radiazioni modifica e per determinare gli effetti di agenti citotossici e di altre terapie anti-cancro sulla capacità formanti colonie, in diverse linee cellulari. Un tipico esperimento di sopravvivenza clonogenica utilizzando linee di cellule aderenti coinvolge tre componenti distinte, 1) il trattamento del monostrato cellulare in flaconi colture di tessuti, 2) preparazione di sospensioni singola cellula e placcatura un adeguato numero di cellule in piastre di Petri e 3) di fissaggio e colorazione colonie dopo un periodo di incubazione rilevante, che potrebbe variare da 1-3 settimane, a seconda della linea cellulare. Qui mostriamo la procedura generale per l&#39;esecuzione del test clonogenica con linee cellulari aderenti con l&#39;utilizzo di una linea cellulare umana immortalata cheratinociti (FEP-1811) 2. Inoltre, i nostri obiettivi sono quelli di descrivere caratteristiche comuni di test clonogenica compreso il calcolo del rendimento della placcatura e le frazioni di sopravvivenza dopo l&#39;esposizione delle cellule alle radiazioni, e per esemplificare la modifica della radiazione-risposta con l&#39;utilizzo di una formulazione antiossidante naturale.

L&#39;applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l&#39;esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

Il saggio clonogenico (o di formazione di colonie) è stato introdotto più di 50 anni fa; l'articolo originale che descrive la tecnica è stato pubblicato nel 19561. ...

Ciao, mi chiamo Lum e attualmente sto svolgendo il mio dottorato presso l'istituto BE IDI Heart and Diabetes Institute sotto la supervisione del dott. Tom Carianne, responsabile del Laboratorio di Medicina Epigenomica. In questo video, illustrerò la procedura nota come Clonogenic Survival Assay. Si tratta di una tecnica di 50 anni, che consente di valutare l'impatto di diversi trattamenti, come l'esposizione a radiazioni o agenti chimici, sulla vitalità riproduttiva cellulare.L'assay di sopravvivenza congeneico è una tecnica fondamentale nella biologia della radiazione per valutare la sensibilità radiante di diverse linee cellulari e testare l'efficacia di diversi composti radio-protettivi o radio-sensibilizzanti. Quando si utilizza una linea cellulare aderente, l'assay di sopravvivenza criogenico si compone di tre fasi. Primo, il trattamento di un monostrato di cellule aderenti.In secondo luogo, la preparazione di una sospensione di singole cellule e la semina di un numero noto di cellule in piastre trattate, e in terzo luogo, la colorazione, il conteggio e le colonie formate dopo un periodo di incubazione. In questo video, utilizzerò cellule immortalizzate di cino site umane per dimostrare come il saggio poligenico Bible possa essere impiegato per determinare le proprietà radio protettive dell'antiossidante naturale. 1225 provette vengono seminate con cellule in cinque millilitri di mezzo in anticipo, in modo che nel giorno dell'esperimento vi sia 1 milione di cellule per provetta.50 microlitri del farmaco vengono aggiunti a diverse concentrazioni ai cinque millilitri di terreno in ciascun matraccio opportunamente etichettato per raggiungere la concentrazione richiesta; vengono utilizzate cinque concentrazioni, oltre a un controllo con veicolo, in questo caso PBS. Dopo l'aggiunta del farmaco, le cellule vengono incubate per un'ora nelle condizioni appropriate per la linea cellulare utilizzata. Successivamente all'incubazione, i campioni, escluso il gruppo di controllo, vengono irradiati alla dose scelta, che in questo caso è di quattro gray prodotti da una sorgente di cesio emittente di raggi gamma.Dopo l'irradiazione, i mezzi vengono versati via e ogni fiala viene lavata con due millilitri di PBS per cinque minuti. Dopo aver eliminato il PBS, vengono aggiunti due millilitri di tripsina allo 0,05% in ogni fiala per staccare le cellule aderenti A dalla fiala. Successivamente, vengono aggiunti cinque millilitri inferiori di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino in ogni fiala per inattivare la tripsina.I contenuti completi del fasc vengono quindi trasferiti in provette falcon da 10 millilitri etichettate. Al termine, queste provette vengono centrifugate per cinque minuti, dopo di che il sopranatante viene scartato con attenzione senza disturbare il palletto, e vengono aggiunti cinque mililitri di mezzo crecy a ciascuna provetta. La concentrazione delle cellule per ogni campione viene calcolata ENC, così come il volume necessario di ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di cellule da seminare in cinque piastre di Petri per campione, con cinque millilitri di mezzo ciascuna.Ad esempio, per il gruppo di controllo, vengono seminate 100 cellule per piastra, quindi il volume necessario per ottenere 500 cellule ogni 25 millilitri viene calcolato; per campioni più concentrati, eseguire una diluizione 10 volte o una diluizione seriale 100 volte per minimizzare l'errore associato all'uso di volumi inferiori a 100 microlitri. Ora il volume precedentemente calcolato viene preparato in un tubo Falcon contenente 25 millilitri di terreno per ogni campione. I campioni possono ora essere trasferiti nelle piastre precedentemente etichettate, aggiungendo cinque millilitri per ogni piastra per facilitare la manipolazione e il trasporto.Conservare le piastre in un contenitore grande, sterile o disinfettato. Le piastre vengono quindi posizionate in un incubatore umidificato nelle condizioni appropriate e incubate per otto giorni. Se si utilizzano cheratinociti dopo otto giorni, rimuovere con attenzione le piastre dall'incubatore e disporle una alla volta all'interno di una cappa chimica.Maneggiare con cura la piastra in modo da non disturbare eventuali colonie formate. Rimuovere i coperchi e aggiungere cinque ml di soluzione salina allo 0,9% in ogni piastra per lavarle. Indirizzare la punta della pipetta verso l'angolo della piastra ed evitare di toccare il fondo in modo da non rimuovere accidentalmente le colonie.Dopo cinque minuti, aspirare con attenzione la soluzione salina. Ora, le colonie vengono fissate con tre millilitri di 4%formula, e i tappi devono essere sostituiti per evitare l'evaporazione. Dopo da 15 minuti a mezz'ora, la formula viene aspirata e smaltita correttamente.Le colonie sono ora pronte per essere colorate con violetto di cristallo allo 0,1%: vengono aggiunti cinque millilitri a ogni piastra e i coperchi vengono riposizionati dopo mezz'ora a un'ora. Il colorante viene quindi rimosso con acqua distillata e le piastre vengono capovolte e lasciate asciugare tutta la notte. Le colonie sono ora pronte per essere contate.Le colonie possono essere contate manualmente utilizzando un microscopio stereoscopico. Qualsiasi aggregato di cellule contenente 50 o più cellule è considerato una colonia. Con questo si conclude la nostra dimostrazione del saggio di sopravvivenza congenico.Il principale vantaggio di questo saggio rispetto ad altre tecniche è la sua estrema sensibilità, che consente di rilevare la sopravvivenza anche dopo una riduzione cellulare di sei ordini di grandezza. Questa sensibilità viene ottenuta seminando un numero maggiore di cellule. Questo saggio può essere facilmente utilizzato anche per altre finalità, ad esempio per valutare la citotossicità.Grazie per aver guardato.

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