Name: Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Impara la microfabbricazione di un dispositivo microfluidico per generare gradienti spaziali e temporali. Questo protocollo consente di studiare la migrazione cellulare direzionata in biologia cellulare.

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Microfabrication A. del gradiente di generazione dispositivo a microfluidi <ol><li> Il wafer di silicio viene trattato con plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY). </li><li> Photoresist negativo (SU-8 50, MicroChem, MA) è spin-rivestito a 1000 rpm per 1 minuto su un wafer di silicio. </li><li> Il wafer è morbido al forno a 65 ° C per 10 minuti e successivamente a 95 ° C per 30 minuti su una piastra. </li><li> Il wafer viene esposto alla luce UV (200W) per 3 minuti attraverso una maschera di trasparenza con una dimensione minima di 30 micron. </li><li> Il wafer è post forno a 65 ° C per 1 minuto e 95 ° C per 10 min. </li><li> Si stampo padronale con 100 canali micron di spessore è sviluppato utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist. </li><li> Il wafer che contiene microcanali è posto in un piatto di Petri-. </li><li> Stampi poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) sono fabbricati da elastomero di silicone di miscelazione e catalizzatore (10:1 ratio). </li><li> La miscela PDMS si versa nello stampo Si maestro. </li><li> Lo stampo maestro Si è posto su un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle per 10 minuti. </li><li> PDMS è curata a 70 ° C per 1 ~ 2 ore. </li><li> Stampi PDMS si stacca dallo stampo maestro Si. </li></ol> B. Apparato Sperimentale <ol><li> Prese d&#39;ingresso delle cellule, sbocco, e infondendo il PDMS dispositivo basato microfluidi sono punzonati utilizzando punzoni taglienti. </li><li> Un dispositivo e un vetrino (2 × 3 pollici) sono irreversibilmente legati dal plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY). </li><li> Tubi in polietilene (PE 20, Becton Dickinon, MD) è inserito nel insenature infondendo del dispositivo a microfluidi e successivamente collegato ad una pompa a siringa. </li><li> Isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano (MW = 10kD, 10 mM, Sigma) ed tampone (PBS, Invitrogen, CA) sono infuse nel dispositivo a microfluidi per confermare gradienti stabile all&#39;interno del dispositivo fluidica. </li><li> Matrice extracellulare (ECM) (cioè, fibronectina) è rivestita all&#39;interno del dispositivo a microfluidi per 1 ora in incubatore (37 ° C). </li><li> Fibroblasti NIH 3T3 sono trypsinized e dissociato. </li><li> Cellule dissociate vengono caricati nel dispositivo a microfluidi (800 micron di larghezza) alla densità cellulare di 2 × 10 6 cellule / ml. </li><li> 2 media ml e 50 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF) è infuso in un dispositivo a microfluidi per la generazione di gradienti solubili mediante una pompa a siringa (0,05 microlitri / min). </li><li> Le cellule sono monitorati in tempo reale ogni 5 minuti utilizzando un microscopio invertito (Nikon TE 2000). </li></ol>

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

Cellule esposte a gradienti di concentrazione stabile di EGF in un dispositivo a microfluidi migrato verso concentrazioni più elevate. L&#39;orientamento direzionale della migrazione cellulare, indice chemiotattica, la motilità delle cellule migrano sono state indagate attraverso l&#39;analisi delle cellule di tracking. Pertanto, questo gradiente di generazione piattaforma microfluidica potrebbe essere utile per studiare le metastasi del cancro, l&#39;embriogenesi, e la guida degli assoni.

<table><tbody><tr><td>Dextrano-FITC</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>Dextrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (10 kD)</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>Fattore di crescita epidermico ricombinante umano</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>Polidimetilsilossano (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb)</td></tr><tr><td>Fotoresist negativo</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td></td><td></td><td></td><td>Wafer di silicio, 4 pollici</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulatura in polietilene</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>linea cellulare</td><td></td><td></td><td>cellule fibroblastiche</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

un gradiente di generazione del dispositivo microfluidic di biologia cellulare

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

La fabbricazione e il funzionamento di un gradiente che generano dispositivo a microfluidi per studiare il comportamento cellulare è descritto. Una piattaforma microfluidica è uno strumento che permette di sperimentazione, perché può manipolare con precisione i flussi di liquidi, consentono high-throughput esperimenti, e generare stabile gradienti di concentrazione solubile. Rispetto ai convenzionali generatori di pendenza, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) microfluidica dispositivi basati in grado di generare gradienti di concentrazione stabile di fattori di crescita ben definiti profili. Qui, abbiamo sviluppato semplice gradiente dispositivi che generano microfluidica con tre ingressi separati. Tre microcanali combinati in un unico microcanali per generare gradienti di concentrazione. La stabilità e la forma dei gradienti di fattori di crescita sono stati confermati da isothyiocyanate fluoresceina (FITC)-destrano con un peso molecolare simile al fattore di crescita epidermico (EGF). L&#39;utilizzo di questo dispositivo a microfluidi, abbiamo dimostrato che i fibroblasti esposti a gradienti di concentrazione di EGF migrati verso concentrazioni più elevate. L&#39;orientamento direzionale di migrazione delle cellule e della motilità delle cellule migrano sono state quantitativamente valutate attraverso l&#39;analisi delle cellule di tracking. Così, questo gradiente apparecchio che può generare microfluidi potrebbe essere utile per studiare e analizzare il comportamento delle cellule migrano.

Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l&#39;embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Viene descritta la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico per la generazione di gradienti finalizzato allo studio del comportamento cellulare. Una piattaforma microfluidica è un...

Il mio nome è Jiang. Sono un ricercatore post-dottorato a Harvard e al MIT Health, Scienze e Tecnologia. E il mio nome è Amir Manchi e sono uno studente universitario del professor ha SANE lab a Harvard, MIT, divisione di Scienze e Tecnologie Sanitarie.Questa diapositiva mostra lo schema del processo per realizzare il dispositivo: si effettua una spin-coating di SUA 50 sulla superficie di vapore di silicio, quindi si posiziona una maschera sopra il vapore di silicio, seguita da esposizione a raggi UUV e sviluppo. Alla fine si ottengono dei pad posizionati sul vapore di silicio. Successivamente, si può semplicemente versare il PDMS, procedere con la polimerizzazione e la cottura, effettuare un piccolo foro e infine sigillare il dispositivo in PDMS a un vetrino di vetro mediante plasma di ossigeno.Ok, siamo ora nella stanza di microfabbricazione all'interno del laboratorio e inizieremo realizzando alcuni strati di PDMS. Con PDMS intendo il termine scientifico polidimetilsilossano, un polimero organico. È il polimero organico a base di silicio più utilizzato.In realtà si tratta di una miscela di due componenti diversi: una base di elastomero siliconico e un agente indurente per elasto

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Biologia

Abbiamo descritto un protocollo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici che può consentire la cattura delle cellule e della cultura. In questo approccio microstrutture modellata come scanalature all'interno dei canali microfluidica sono utilizzati per creare le regioni a basso sforzo di taglio all'interno del quale cellula possono attraccare.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Presentiamo un metodo semplice per produrre dispositivi microfluidici capaci di applicare simili condizioni dinamiche a più ceppi distinti, senza la necessità di una stanza pulita o litografia morbida.

Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

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Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

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Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

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