Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Il mio nome è Jiang. Sono un ricercatore post-dottorato a Harvard e al MIT Health, Scienze e Tecnologia. E il mio nome è Amir Manchi e sono uno studente universitario del professor ha SANE lab a Harvard, MIT, divisione di Scienze e Tecnologie Sanitarie.

Questa diapositiva mostra lo schema del processo per realizzare il dispositivo: si effettua una spin-coating di SUA 50 sulla superficie di vapore di silicio, quindi si posiziona una maschera sopra il vapore di silicio, seguita da esposizione a raggi UUV e sviluppo. Alla fine si ottengono dei pad posizionati sul vapore di silicio. Successivamente, si può semplicemente versare il PDMS, procedere con la polimerizzazione e la cottura, effettuare un piccolo foro e infine sigillare il dispositivo in PDMS a un vetrino di vetro mediante plasma di ossigeno.

Ok, siamo ora nella stanza di microfabbricazione all'interno del laboratorio e inizieremo realizzando alcuni strati di PDMS. Con PDMS intendo il termine scientifico polidimetilsilossano, un polimero organico. È il polimero organico a base di silicio più utilizzato.

In realtà si tratta di una miscela di due componenti diversi: una base di elastomero siliconico e un agente indurente per elastomero siliconico. Il rapporto è di 10 parti di base e 1 parte di agente indurente. Abbiamo bisogno di circa 10 grammi di base e, di conseguenza, di circa 1 grammo di agente indurente per elastomero, che proverò a mescolare accuratamente con la base.

Utilizzerò le pipette. Ora che la miscela è pronta, la verserò effettivamente sulla superficie della wafer di silicio. L'idea è che queste wafer di silicio abbiano alcuni schemi sulla loro superficie.

In realtà, questi aiutano il polimero PDMS a ottenere il disegno desiderato, e utilizziamo tali disegni per creare canali, scanalature o qualsiasi altro motivo necessario su questi polimeri. Il passo successivo consiste nel rimuovere le numerose bolle presenti nella miscela, sottoponendola a vuoto per evitare che le bolle rimangano all'interno del polimero. Posizionerò i gel di PDMS sul wafer di silicio all'interno della camera a vuoto.

Chiuderò la camera e aprirò il vuoto. Dopo la scomparsa delle bolle, circa dopo un paio di minuti, posizioneremo il campione in forno per tutta la notte, a circa 70 gradi Celsius, il che favorirà la solidificazione. Il modello a cui voglio che prestiate attenzione comprende queste tre diverse camere di riserva, necessarie per creare dei gradienti in modo da avere una concentrazione nulla da un lato e una quantità specifica di concentrazione da questo lato, con una variazione uniforme verso quest'ultima; realizzeremo inoltre un piccolo foro all'estremità opposta, che in questo caso fungerà da uscita.

Il passo successivo consiste nel ritagliare uno di questi modelli e trasferirlo in una piastra petri, con la superficie del modello rivolta verso l'alto. Spero che riusciate a vedere i tre ingressi e l'uscita che vi ho descritto su questo modello. Utilizzeremo punzoni piccoli per gli ingressi, in modo da poter usare tubi di polietilene, mentre userò punzoni più grandi per l'uscita, al fine di ottenere una riserva di liquido.

Quindi inizieremo con il primo ingresso. Farò un foro, lo stesso con il secondo e anche un altro piccolo foro per il terzo. L'ultimo passaggio consiste nel fare un foro grande all'uscita.

Quindi, una volta terminato, avremo lo strato A-P-D-M-S, che è lo strato superiore, e utilizzerò un altro strato di vetro nella parte inferiore. Questi microvetri costituiranno lo strato inferiore dei miei dispositivi microfolici. Ora ci troviamo nella stanza di microfabbricazione e ho un livello di vetro e uno di PDMS e voglio unirli tra loro.

Ciò che utilizzeremo ora è una macchina chiamata pulitrice al plasma. All'interno della camera avverrà che il plasma contribuisce a rompere l'equilibrio superficiale debole e a sostituirlo con gruppi chimici altamente reattivi, e inoltre la superficie diventerà effettivamente idrofila. Quello che accadrà ora è che prenderò il modello in PDMS, che era lo strato superiore e presentava alcuni canali al suo interno, e rimuoverò il nastro che avevo applicato in precedenza per evitare che polvere si attaccasse al nostro modello.

Lo posizionerò all'interno della camera. La fase successiva prevede l'utilizzo di un vetrino, che fungerà da strato inferiore all'interno del dispositivo. Pertanto, posizionerò anche questo all'interno della camera.

E chiudo completamente la camera, prima spegnendo l'alimentazione e poi la pompa; a questo punto dobbiamo tornare a questa macchina tra circa cinque minuti. Quello che farò è spegnere la macchina: prima spegnerò la pompa e poi l'alimentazione, quindi aprirò la camera.

Questo suono è in realtà dovuto alla pressione negativa applicata durante il processo all'interno della camera. Quindi rimuoverò gli strati diversi e vorrò unirli insieme. Poiché il vetro è lo strato inferiore, lo prenderò nella mano sinistra e lo terrò fermo, quindi prenderò lo strato di PDMS e lo posizionerò sopra lo strato di vetro.

Ma poiché attualmente i pattern sono rivolti verso l'alto, inverto in qualche modo lo strato di PDMS. Lo posizionerò sul vetro dopo averli premuti insieme. Si attaccano molto facilmente e parte del vantaggio di questo processo di trattamento al plasma è la resistenza adesiva e la permanenza.

Questo è l'aspetto finale. Quindi, per riepilogare, queste sono le nostre aperture di ingresso e questa è l'uscita; siamo pronti per passare al passo successivo. La cottura della fibra all'interno del dispositivo, quindi un'ora nell'incubatrice, poi prelevare un campione SIM dall'incubatrice dopo un'ora, aggiungere il cibo per colture di pesce e quindi preparare la soluzione.

Per preparare la soluzione di EGF, aggiungiamo semplicemente due millilitri di mezzo di coltura come Azure, aggiungendo 15 nanogrammi per EGF e 10 micromolari di 50 D; questa soluzione risulta molto difficile da utilizzare per visualizzare il gradiente di EGF attraverso il canale. Successivamente, preleviamo due millilitri di mezzo, mezzo virtuale, e aggiungiamo altri due millilitri di mezzo. Queste due posizioni contengono solo colture normali, infusione normale di colture normali nel dispositivo.

Quindi rimuovo la bolla, ricollego, anche questa è una bolla mobile M che scende di nuovo. Poi uso semplicemente 15 nanogrammi di EGF e 10 micromolar di fi dextra e due mil di mezzo dai campioni prelevati, metto la soluzione nella siringa e quindi elimino la bolla. Infine, passo alla soluzione, riporto indietro l’interruttore.

La soluzione viene aspirata nella siringa per gas ed è necessario premere SH diverse volte per rimuovere le bolle d'aria; quindi si passa alla siringa contenente la soluzione da utilizzare. Successivamente si ruota la valvola a tre vie in modo che la soluzione fluisca attraverso la barra a tre vie, il tubo e fuoriesca dal tubo stesso. Dopo che la miscela esce dalla soluzione, è possibile inserire il tubo nel dispositivo My Predict; tutte e tre le soluzioni sono identiche. È sufficiente collegare delicatamente l'ingresso del canale di infusione.

Quindi, alla fine, due sono mezzi di coltura normali. Uno è il mezzo di coltura con EGF e per confermare il profilo del gradiente di EGF. Questo è il cell in net, cell in net.

Questo creerà l'uscita per le cellule, generando quindi un gradiente mediante il canale a tre hub e successivamente generando il gradiente all'interno dell'area cellulare. Normalmente, quello che si desidera fare è semplicemente posizionare le cellule, sospendere le cellule, posizionarle all'uscita e quindi aspirare delicatamente il mezzo, permettendo così alle cellule di fluire attraverso l'area cellulare, dove si depositeranno automaticamente e aderiranno al rivestimento, assicurandosi che le cellule si espandano completamente. Dopo aver verificato che le cellule si siano completamente espanse, si può semplicemente iniziare l'infusione e quindi studiare la migrazione cellulare utilizzando il dispositivo generatore di gradienti.