RT-PCR quantitativo ad alta produttività in campioni C. elegans singoli e sfusi che utilizzano la tecnologia nanofluidica

Il nostro protocollo ha migliorato sia la produttività che l'efficienza in termini di tempo per ottenere dati RT-qPCR direttamente da campioni singoli o da piccoli campioni di massa senza la necessità di isolamento dell'RNA. Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere oltre 9.000 risultati RT-qPCR in soli due giorni di lavoro al banco, un processo che in genere richiederebbe circa cinque settimane utilizzando la qPCR standard a 96 pozzetti. Questo protocollo fornisce un test RT-qPCR più veloce, robusto e altamente sensibile in C.elegans, ideale per monitorare la variabilità interindividuale nell'espressione genica tra vermi isogenici.

Inizia raccogliendo i vermi dal loro prato batterico su una piastra media di crescita di nematodi fresca e senza semi e lasciando che i vermi si muovano intorno alla piastra per cinque minuti. Mentre i vermi si acclimatano, in una cappa priva di RNasi, mescolare 10 microlitri di tampone di lisi con uno o 100 Dnasi I per campione e posizionare il coperchio di una striscia PCR capovolta sulla piattaforma di un endoscopio da dissezione. Quindi aggiungere 10 microlitri della miscela di lisi ai tappi delle provette PCR a cupola e raccogliere i vermi dalla piastra per evitare di trasferire batteri in ciascuna fessura del coperchio.

Quando tutti i vermi sono stati trasferiti, chiudere i tappi e far girare le provette per cinque secondi prima di metterle in un pallone Dewar di azoto liquido. Dopo gli ultimi cinque secondi, scongelare i tubi in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius prima di ripetere la procedura di congelamento/scongelamento altre nove volte. Dopo l'ultimo ciclo di congelamento/scongelamento, miscelare i campioni lisati su un miscelatore termico per 20-30 minuti a quattro gradi Celsius e circa 1800 giri al minuto.

Al termine dell'incubazione della miscelazione, centrifugare i campioni come dimostrato e aggiungere un microlitro di soluzione di arresto appena scongelata a ciascuna provetta. Per la trascrizione inversa di campioni caldi sfusi, in una cappa priva di RNasi, preparare una master mix di tampone enzimatico e aggiungere 14 microlitri di master mix a 11 microlitri di ciascun campione. Eseguire i campioni attraverso un termociclatore utilizzando il programma di trascrizione inversa indicato e diluire il prodotto di cDNA risultante in un rapporto da uno a quattro in acqua priva di nucleasi.

Per una preamplificazione specifica per il target, aggiungere 3,75 microlitri di master mix di preamplificazione in un pozzetto per campione in una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 1,25 microlitri di ciascuna soluzione di cDNA a ciascun pozzetto di master mix. Quando tutti i campioni sono stati caricati, coprire la piastra con del nastro sigillante e agitare brevemente i campioni prima di centrifugarli, quindi caricare la piastra su un termociclatore ed eseguire il programma come indicato. Per rimuovere i primer non incorporati dalla preamplificazione, al termine del termociclo centrifugare la piastra del campione e rimuovere con cautela il sigillo.

Aggiungere due microlitri di miscela master di esonucleasi I a ciascuna reazione di preamplificazione e richiudere, centrifugare e caricare nuovamente la piastra nel termociclatore. Al termine del ciclo, diluire i campioni con 18 microlitri di tampone Tris-EDTA. Per impostare un chip multi-array, aggiungere 3,6 microlitri di master mix di caricamento del saggio e 0,4 microlitri di primer inverso diretto da 50 micromolari in un pozzetto per campione in una piastra da 384 pozzetti.

Quindi aggiungere 2,2 microlitri di sample master mix e 1,8 microlitri di ciascun campione preamplificato trattato con esonucleasi I nei pozzetti appropriati della piastra. Per impostare un chip single-array, aggiungere 5,4 microlitri della master mix di caricamento del saggio e 0,6 microlitri del primer inverso diretto a un pozzetto per campione di una seconda piastra a 384 pozzetti, quindi aggiungere 3,3 microlitri di sample master mix e 2,7 microlitri di ciascun campione trattato con esonucleasi I preamplificata ai pozzetti appropriati della piastra single-array preparata. Per innescare il chip nanofluidico per la prima esecuzione, tenendo il chip a un angolo di 45 gradi, iniettare lentamente e con attenzione 150 microlitri di fluido della linea di controllo negli accumulatori del chip.

Quando tutto il fluido è stato caricato, rimuovere la pellicola protettiva blu dalla parte inferiore del chip e posizionare il chip nella macchina di priming per PCR nanofluidica con il codice a barre rivolto verso l'esterno. Quindi eseguire lo script Prime(153x). Dopo l'adescamento, posizionare il chip su una superficie scura e, man mano che ogni test o miscela di campioni viene caricato, rimuovere i tappi di barriera corrispondenti, se necessario, e aggiungere il volume appropriato di test o miscela di campioni agli ingressi corrispondenti del chip nanofluidico secondo il piano sperimentale.

Dopo il caricamento, posizionare il chip nel termociclatore nanofluidico ed eseguire il protocollo appropriato nel software di raccolta dati. Se l'intero chip multi-array non viene utilizzato, eseguire un'esecuzione post-script per consentire l'utilizzo a valle degli array di chip rimanenti. Per verificare se il protocollo worm-to-Ct è un metodo di estrazione valido del cDNA, il metodo è stato confrontato con i metodi standard di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidio.

A livello globale, i livelli di espressione dell'mRNA hsp-70 per 100 nanogrammi di RNA totale erano comparabili utilizzando sia il metodo fenolo-cloroformio che il metodo verme-to-Ct. Tuttavia, nei casi di massima espressione di hsp-70, l'espressione era più alta con il metodo worm-to-Ct, indicando una migliore sensibilità. Per l'estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidium di campioni di massa, l'hsp-70 è diminuito dell'82,7% nei mutanti hsf-1 rispetto ai controlli e del 92,3% per il caldo-Ct, indicando che la diminuzione era paragonabile tra i due metodi.

Utilizzando il cDNA ottenuto da campioni di massa di 25 vermi o da una media di 36 campioni di vermi singoli, i metodi hanno rilevato livelli di espressione comparabili per tutti gli chaperoni testati, indicando che i parametri ottenuti da singoli vermi sono affidabili. Qui viene mostrata l'espressione media di più trascritti hsp da singoli vermi a seguito di un breve shock termico. Come osservato, la variabilità nell'espressione dei trascritti differisce notevolmente tra i diversi geni.

Per ogni trascrizione testata utilizzando campioni di singoli vermi, i coefficienti tecnici di variabilità erano inferiori ai coefficienti biologici di variabilità, indicando che i triplicati tecnici non erano necessari per la stima dei parametri quando la qPCR veniva eseguita su singoli vermi. Quando si esegue questo protocollo, è essenziale pipettare accuratamente piccoli volumi e non pipettare al contrario nel chip nanofluidico. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere grandi set di dati RT-qPCR, che possono quindi essere esportati ed elaborati a piacere utilizzando script Excel o R.