Name: Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Scopri un metodo semplice per preparare gel di poliacrilammide in piastre multiwell per studiare le risposte cellulari dipendenti dalla rigidità. Questa tecnica rapida ed economica non richiede attrezzature specializzate.

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Questo lavoro è stato finanziato dai fondi iniziali forniti alla Dott.ssa Silviya Zustiak dall'Università di Saint Louis e da una sovvenzione del President's Research Fund (PRF) assegnata alla Dott.ssa Silviya Zustiak dall'Università di Saint Louis. Ringraziamo Naveed Ahmed e Keval Shah per l'assistenza tecnica.

1. Preparazione di soluzioni e Aliquote Hydrogel associati <ol><li> Preparazione della soluzione poliacrilammide gel precursore. <ol><li> Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1. NOTA: Queste soluzioni possono essere preparati in grandi lotti e conservati a 4 ° C fino a diversi mesi. <ol><li> ATTENZIONE: L&#39;acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare, se in polvere: così, utilizzare preferibilmente il 40% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (&lt;23 ° C, e ben ventilato). </li><li> ATTENZIONE: Bis-acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare,quando in polvere: così, utilizzare preferibilmente 2% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (&lt;4 ° C, e ben ventilato). </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione e utilizzo di N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamino) esanoato (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) aliquote. ATTENZIONE: Sulfo-SANPAH provoca grave irritazione oculare; maneggiare con i guanti e la corretta protezione degli occhi o il viso. Conservare a -20 ° C alla ricezione e prima in aliquote. <ol><li> Per memorizzare sulfo-SANPAH: sciogliere Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Aliquota della soluzione di riserva in 50 provette micro da 20 ml per provetta. Freeze Flash in ghiaccio secco o in azoto liquido (un passaggio facoltativo, ma preferito per preservare la massima efficienza reticolante) e conservare a -80 ° C. NOTA: Le aliquote can essere conservati per alcuni mesi. </li><li> Per utilizzare solfo-SANPAH: scongelare brevemente un&#39;aliquota e diluire in 480 ml di acqua deionizzata. Utilizzare immediatamente. Sulfo-SANPAH idrolizza rapidamente in acqua: quindi prendere cautela per eseguire tutti i passaggi sopra in fretta. </li></ol></li><li> Preparazione di persolfato di ammonio (M r 228,18 g / mol) aliquote. NOTA: persolfato di ammonio provoca occhi, irritazione della pelle e delle vie respiratorie. Indossare dispositivi di protezione adeguati durante la manipolazione. Maneggiare persolfato di ammonio in polvere in una cappa. Conservare la polvere in un luogo asciutto e ben ventilato. Una volta aliquotati, la soluzione diluita può essere utilizzato sul banco di lavoro. <ol><li> Sciogliere persolfato di ammonio in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale persolfato di ammonio del 10% w / v. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione di collagene di tipo I. <ol><li> Preparare 0,2 mg / ml soluzione di collagene diluendo il magazzino in modoluzione in 1x tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4. Conservare brevemente ghiaccio o utilizzare immediatamente dopo la diluizione. </li></ol></li></ol> 2. Idrogel Preparazione (fare riferimento alla figura 1) <ol><li> Preparazione di vetrini idrofobici. <ol><li> Mettere alcune gocce di una soluzione idrofobico su una lastra di vetro e utilizzare carta velina per diffondere attraverso la superficie. Lasciate asciugare e pulire con un fazzolettino di carta di nuovo per uniformare il rivestimento idrofobo. NOTA: soluzione idrofobico Conservare in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Indossare indumenti protettivi durante la manipolazione. Lavorare in un ambiente ben ventilato. </li></ol></li><li> Preparazione del supporto plastico flessibile. <ol><li> Tagliare il supporto di plastica flessibile per adattarsi alle dimensioni della lastra di vetro idrorepellente rivestita. </li><li> Contrassegnare lato idrofoba del supporto plastico flessibile leggermente graffiare la superficie con un attrezzo appuntito come un bisturi. NOTA: Una volta che il gel - che è completamente trasparente - asciuga, I graffi aiuteranno a distinguere da che parte il supporto di plastica flessibile contiene il gel. NOTA: Il supporto di plastica flessibile ha un idrofobico e un lato idrofila. Una volta depositato, poliacrilammide aderisce in modo permanente al lato idrofila del supporto plastico che facilita la successiva manipolazione idrogel. </li></ol></li><li> Gel Preparazione (esempio volumi sono indicati per soluzioni gel precursori 5 ml). NOTA: 5 ml sarebbero sufficienti a produrre ~ 40 gel quando lo spessore iniziale gel è di 0,5 mm. Più gel possono essere prodotti se lo spessore gel viene ridotta. <ol><li> Inserire 4972,5 ml di soluzione di precursore di poliacrilammide concentrazione finale desiderata (Tabella 1) in una provetta conica da 50 ml. Mettere in una camera di degasaggio per 30 minuti con il tappo aperto. NOTA: ossigeno agisce come una trappola radicali liberi e, quando presente, inibisce la polimerizzazione. </li><li> Aggiungere 25 ml di 10% w / v di ammonio persolfato (vedi punto 1.3) per ottenere una finaleammonio persolfato concentrazione dello 0,05%. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiammina (TEMED, M r 116.24 g / mol) alla soluzione di gel degasato per ottenere una concentrazione finale di 0,5 TEMED%. NOTA: Conservare TEMED in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Maneggiare in una cappa indossando i dispositivi di protezione adeguati. Tenere ben chiuso sotto gas inerte, come è altamente dell&#39;aria e sensibile all&#39;umidità. </li><li> Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù 3 - 5 volte. Non vortice per evitare la diffusione di ossigeno nella soluzione di gel precursore. </li><li> Pipettare la soluzione di gel sul lato idrofila del supporto plastico flessibile e panino con idrofobico rivestita vetrino. Separate le due slitte con distanziali silicone di spessore desiderato (ad esempio 0,5 mm). Lasciare una piccola quantità (~ 100 ml) di soluzione di precursore di polimero nella provetta conica da 50 ml di utilizzare come indicatore di gelificazione. NOTA:Qualsiasi spacer potrebbe essere utilizzato. Per esempio, una singola striscia di Parafilm dà spessore gonfio gel finale di 100 - 120 micron. </li><li> Posizionare un altro lastra di vetro in cima al flessibile panino supporto / gel plastica per accertare una superficie piana idrogel sulla polimerizzazione. </li><li> Lasciare polimerizzare il gel per 45 minuti, anche se meno tempo può essere utilizzato per i gel di maggiore% in peso, se desiderato. Per verificare che il gel ha polimerizzato, osservare la soluzione rimanente nel tubo conico da 50 ml; se la soluzione rimanente è gelificata, allora è probabile che gelificazione sulla lastra di vetro è stata avviata pure. Si noti tuttavia che l&#39;apertura anticipata dello stampo impedirà completa polimerizzazione. </li><li> Una volta che il gel si forma, staccare il supporto plastico flessibile con il gel di poliacrilammide covalentemente attaccato sulla parte superiore, e impostare gel-side-up asciugare all&#39;aria. NOTA: convezione o essiccazione calore possono anche essere utilizzati per accelerare questo passaggio. Una volta essiccato sul supporto di plastica flessibile, il gel può essere negoziod tempo indeterminato. <ol><li> Segna tutti i punti scoperti del supporto plastico flessibile, dove gel di poliacrilammide non formano a causa di bolle. Mark mentre il gel è ancora idratata quanto ciò fondono con il supporto plastico flessibile quando il gel è asciutto. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. multipozzetto gruppo piastra, Collagene Coating, e sterilizzazione <ol><li> Assieme piastra multipozzetto. <ol><li> Una volta asciugato, tagliato gel PA in forme desiderate. <ol><li> Per una piastra a 96 pozzetti, utilizzare un buco pugno pesante, con un diametro di circa 6 mm. Usare un taglierino pesante per tagliare gel in forme quadrate o rettangolari. In alternativa, usare le forbici. </li></ol></li><li> Preparare circa 500 ml di PDMS per piastra da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Per incollare i gel al fondo di una piastra multipozzetto, posizionare una piccola goccia (~ 5 microlitri) di polidimetilsilossano (PDMS) al centro della ogni pozzetto. Utilizzando pinze, collocare uno polyacrylamide gel in ogni lato supporto plastico bene, flessibili verso il basso. Per consentire PDMS curare, lasciare la piastra montata a 37 ° C per un minimo di 4 ore. </li></ol></li><li> Rivestimento Collagene di gel di poliacrilammide. <ol><li> Con una pipetta di trasferimento, mettere una piccola quantità (7-8 ml) di solfo-SANPAH (vedi punto 1.2.2) in ogni pozzetto e turbolenza da un lato all&#39;altro per rivestire la superficie del gel in modo uniforme. Lavoro prontamente dal solfo-SANPAH non è stabile in acqua. </li><li> Posizionare la piastra ben sotto una lampada UV ad alta intensità (intensità = 37 mW, λ = 302-365 nm) per 5 min. Sciacquare i gel con PBS per rimuovere l&#39;eccesso solfo-SANPAH. </li><li> Pipettare 50 ml di 0,2 mg / ml di collagene di tipo I soluzione (vedi punto 1.4) in ogni pozzetto. Lasciare la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno 2 ore o O / N a 4 ° C. NOTA: Per accelerare il processo di verniciatura collagene, una pipetta di trasferimento può essere utilizzata per aggiungere la soluzione di collagene. Tipicamente, 1 - 2 gocce di soluzione deve essere sufficiente per completarely coprire la superficie del gel. </li><li> Lasciare la piastra bene a temperatura ambiente per almeno 2 ore per consentire il collagene legame. </li><li> Risciacquare con PBS per rimuovere la soluzione di collagene in eccesso e sterilizzare ai raggi UV (λ = 200 nm) in una cappa coltura tissutale per 2 ore. </li><li> Mettere a bagno i gel in terreno completo (fare riferimento alla sezione 4.1 per mezzo di composizione) O / N per idratare ed equilibrare. Utilizzare per la cella di semina immediatamente o conservare in frigorifero per un massimo di 2 giorni. </li></ol></li></ol> 4. Semina cellulare su PA Rigidità Assay NOTA: Sebbene tipico per linee comuni di cellule di mammifero, il protocollo descritto in questa sezione è specificamente utilizzato con il cancro al seno linea cellulare MDA-MB-231 (vedi figure 4 e 5). <ol><li> Raccogliere cellule dal pallone di coltura tissutale da esposizione al 5% tripsina / EDTA per 5 min a 37 ° C. Utilizzare ~ 80 ml ​​di tripsina / EDTA per ogni cm 2 di cultura dell&#39;area pallone; per esempio, utilizzare 2 ml di tripsina / EDTA fora T25 pallone di coltura cellulare. Risospendere le cellule raccolte in mezzo completo addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina a una concentrazione cellulare finale desiderata. Tenendo conto delle cellule tempo di raddoppio e la lunghezza del tempo le cellule saranno seminate sul dosaggio, scegliere concentrazione cellulare sub-confluenti appropriata. Assicurarsi che media aggiunto è sufficiente per immergere completamente il idrogel. NOTA: Poiché i idrogel sono stati pre-equilibrata nei media (fare riferimento al punto 3.2.6) 100 Volume ml dovrebbe essere sufficiente. Tipici volumi medi utilizzati per piastre a pozzetti multipli devono essere sufficienti in quanto i gel sono stati pre-equilibrata in media nel passaggio precedente. NOTA: Il test sarebbe appropriato per qualsiasi tipo di cellula attaccamento-dipendente. <ol><li> Contare il numero di cellule al microscopio invertito utilizzando un emocitometro. Carico 10 ml di sospensione cellulare in ogni porto emocitometro e la media del numero di celle da almeno 8 quadranti. Per ottenere ilconcentrazione cellulare finale, moltiplicare il numero di celle da 10 4. NOTA: I migliori risultati di conteggio delle cellule si ottengono quando il numero di cellule in ogni quadrante emocitometro è 20 - 50. </li></ol></li><li> Coltivare le cellule sul test rigidità PA in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Cambiare i media ogni 2 - 3 giorni. Raccogliere cellule quando necessario dall&#39;esposizione al 5% tripsina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Utilizzare ~ 80 ml ​​di tripsina / EDTA per cm 2 di pallone di coltura tissutale. Durante tutte le fasi di manipolazione cellulare, prestare particolare attenzione a non disturbare la superficie di idrogel: aspirato o medio pipetta leggermente inclinando la piastra pozzetti lateralmente e toccando la punta della pipetta sulla parete laterale di ogni bene, al contrario di toccare l&#39;idrogel. NOTA: Ad eccezione facendo particolare attenzione a non danneggiare la superficie idrogel durante la movimentazione coltura tissutale normale, le cellule seminate su dosaggio rigidità può essere manipolato nello stesso modo come se fossero seminate suad una piastra multipozzetto regolare. </li></ol> 5. Imaging di celle seminate su PA Rigidità Assay <ol><li> Celle di immagine direttamente sul test rigidità PA. NOTA: Qualsiasi microscope - invertito, fluorescenza o confocale, può essere utilizzata per l&#39;imaging cellulare. NOTA: Il supporto di plastica flessibile utilizzato per costruire il test di rigidità è completamente trasparente e non possiede autofluorescenza o interferire con l&#39;imaging cellulare. Tuttavia, anche se il supporto flessibile di plastica è trasparente, capacità di imaging saranno limitati dalla distanza di lavoro dell&#39;obiettivo. Il supporto di plastica flessibile ha uno spessore di 0,23 mm e una distanza di lavoro tipica di un obiettivo 10X è ~ 4 mm bruscamente decrescente per ingrandimenti maggiori. <ol><li> Per l&#39;imaging cellulare dal vivo, posizione PA rigidità test in portatarga microscopio e immagine. Tenere sessioni di imaging in 2 ore, o utilizzare un microscopio equipaggiato con una camera climatica per tempi più lunghi di imaging. </li><li> Quando im cellulare dal vivol&#39;invecchiamento non è l&#39;obiettivo, fissare le cellule in soluzione di formaldeide 4% integrato con 0,1% di detergente. Immergere le cellule in fissante a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore. Risciacquare con PBS due volte. Smaltire i rifiuti fissativo in un contenitore per rifiuti designato. NOTA: Le celle possono essere esposte immediatamente o conservate immersi in PBS a 4 ° C fino a 2 settimane. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica su inalazione e contatto. Maneggiare con guanti in una cappa. NOTA: il protocollo di fissazione delle cellule deve essere scelto in base ai protocolli di colorazione e di trattamento delle cellule successive, in quanto alcuni fissativi danneggiano alcune proteine ​​cellulari. </li><li> Per l&#39;imaging fluorescente, macchia cellule con colorazione cella desiderata direttamente nel piatto pozzetti fisso. Immagine immediatamente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gel di poliacrilammide, originariamente sviluppati per elettroforesi, 28 sono oggi utilizzati di routine come substrati di coltura cellulare per studiare gli effetti di substrato rigidità sulla morfologia delle cellule, la motilità e la comunicazione 3,24,29 tra le altre caratteristiche cellulari. Poliacrilammide consente la manipolazione del substrato rigidità che comprende la rigidità di tutti i tessuti molli del corpo (0,3 - 300 kPa) 1 con una semplice variazione della concentrazione ...

La maggior parte dei tessuti del corpo sono materiali viscoelastici morbidi con un modulo di Young che vanno da 0,1 kPa per cervello a 100 kPa per cartilagine morbida, ma, più in ricerca sulle cellule vitro è condotta su coltura tissutale polistirene (TCP), che ha un modulo di ~ 1 GPa . 1 Questa mancata corrispondenza rigidità influenza notevolmente il modo in cui le cellule rispondono al loro ambiente. Un crescente corpo di ricerca è quindi dedicata alla chiarire l&#39;effetto del substrato rigidità sul destino di vari tipi cellulari, comprese le cellule staminali 2,3. 4 Come risultato, più idrogel sono stati sviluppati per aiutare nella comprensione della cella rigidità-dipendente biologia compresi poliacrilammide (PA), 5-7 polietilene glicole (PEG), 8,9 polidimetilsilossano (PDMS), 10 e alginato. 11 Mentre la prova che substrato rigidità ha un impatto sostanziale sul destino delle cellule è in crescita, la maggior parte degli studi sono condotti su scala ridotta con un piccolo numero di samples. Sistematiche, studi multidimensionali sull&#39;effetto di substrato rigidità per una serie di tipi cellulari o condizioni ambientali sono rare. 12 Sono state sviluppate diverse tecnologie idrogel high-throughput promettenti, tra cui microarrays basati PEG, 13 dispositivi microfluidici per la produzione di microsfere di agarosio idrogel, 14 o micro e nano-aste in cui la rigidità è modulata dal diametro e altezza delle microrods. 15 Tuttavia , le tecnologie per preparare questi substrati sono sofisticati e disponibili per il numero limitato di laboratori. Gran parte della ricerca che coinvolge rigidità modulato le risposte delle cellule utilizza poliacrilammide (PA) gel che non sono solo poco costoso e semplice da implementare, ma mostrano anche una gamma fisiologicamente rilevanti di modulo di Young, vale a dire 0,3 -. 300 kPa 16-22 Tuttavia, i metodi esistenti per fabbricare PA gel per colture cellulari molto lavoro e, conseguentemente, di preparazioneared in piccoli lotti. Alcune delle difficoltà associate alla preparazione di gel PA come substrati cellulari derivano dal requisito che i gel devono essere preparati: 1) in assenza di ossigeno per permettere la completa polimerizzazione, 2) con una superficie piana e liscia per consentire cellulare uniforme attaccamento e diffusione, e 3) fissata in modo al fondo del piatto di coltura cellulare per prevenire galleggiante. Diversi gruppi hanno tentato di produrre gel PA per colture cellulari in grandi lotti. Semler et al. Fogli spessi preparati dei gel PA che erano poi &quot;tagliata&quot; con un perforatore e posizionati in piastre da 96 pozzetti. 23 Tuttavia, questo metodo è limitato a gel rigide, cioè,&gt; 1 kPa nel modulo di Young, perchè più morbido gel sono &quot;sticky&quot;, difficile da tagliare, e facilmente danneggiati. Mih et al. Sviluppato una tecnica più sofisticata che permette i gel da polimerizzare direttamente in una piastra multipozzetto fondo di vetro. <sup&gt; 6 Questo è stato ottenuto versando le soluzioni di gel in lastre di vetro-bottom funzionalizzate e formando gel da &quot;sandwich&quot; di loro con un allineamento coprioggetti personalizzato. 6 Anche se, lievi effetti di bordo molto promettenti sono stati ancora osservati con questa tecnica. Inoltre, la tecnica richiede una matrice custom-designed non immediatamente accessibili a molti laboratori e costose piastre a pozzetti multipli con fondo di vetro. Questo documento descrive un modo semplice e poco costoso da montare gel PA in una piastra multipozzetto che potrebbe facilmente essere adottata da qualsiasi laboratorio. Qui, un supporto plastico flessibile è utilizzato, che ha due lati - uno idrofoba, che è repellente per gel PA, e uno idrofila, che si lega covalentemente il gel PA sulla deposizione. Una volta fogli di gel PA vengono depositati e permanentemente affissa al supporto plastico flessibile, consente la movimentazione gel di qualsiasi spessore o rigidità e taglio in qualsiasi forma desiderata. Questo approach non solo produce custom &#39;vetrini&#39; di plastica in formati non altrimenti disponibili in commercio, ma evita anche la necessità di pre-trattare le superfici di vetro, sia vetrini o pozzetti di costose lastre di pozzetti con fondo di vetro, con una soluzione PA vincolante, che è un noioso e un passo che richiede tempo. Infine, uniformi fogli gel PA possono essere preparati in grandi lotti e de-idratato conservati per alcuni mesi. In sintesi, il saggio qui presentato è un miglioramento rispetto ai metodi esistenti in diversi aspetti. In primo luogo, il processo di assemblaggio piastra multipozzetto è efficiente, e il costo complessivo dei materiali necessari è basso. In secondo luogo, gli idrogel sono prodotte in grandi lotti in un unico film gel omogeneo. Infine, solo materiali che sono commercialmente disponibili sono richiesti. L&#39;utilità del saggio è illustrato esplorare l&#39;effetto di substrato rigidità sulla morfologia cellulare e zona diffusione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% Acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo 1, da coda di ratto, 3,68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione idrofobica &#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polidimeilsilossano (PDMS) [Kit elastomero Slygard 182]</td><td>Adesivi Elsworth</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Detergente: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kit di blocco dell'adesione cellulare basato su BSA &#8212; Kit array di adesione cellulare ECM</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>flexible plastic support &#8212; GelBond PAG Film per gel di poliacrilammide</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in vetro</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Fisher</td><td>Scientific 3181345107</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>piastra da 96 pozzetti (fondo piatto)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso (1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25&nbsp; ml, 50&nbsp; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (FALCON): 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ml: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1-200&nbsp; &#956; l, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso standard in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Guanti da esplorazione senza polvere</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori in silicone &#8212; Foglio di silicone, 0,5 mm di spessore/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Forno UV</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Camera a vuoto/degasatore</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto per degasatore</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per aspirazione chimica</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito (Axiovert 25)</td><td>Incubatore</td><td>663526</td><td></td>Zeiss</tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

semplice poliacrilammide-based a più pozzetti rigidità assay per lo studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Attualmente, la maggior parte della ricerca cellulare in vitro viene eseguita su polistirene di coltura di tessuti rigidi (~1 GPa), mentre la maggior parte delle cellule del corpo sono attaccate a una matrice elastica e molto più morbida (0,1 – 100 kPa). Poiché tale discrepanza di rigidità influisce notevolmente sulle risposte cellulari, vi è un forte interesse nello sviluppo di materiali idrogel che si estendono su un'ampia gamma di rigidità per fungere da substrati cellulari. I gel di poliacrilammide, che sono economici e coprono l'intervallo di rigidità di tutti i tessuti molli del corpo, sono l'idrogel di scelta per molti gruppi di ricerca. Tuttavia, la preparazione del gel di poliacrilammide è lunga, noiosa e adatta solo per piccoli lotti. Qui, descriviamo un test che, utilizzando un film plastico flessibile permanente come supporto strutturale per i gel, consente la preparazione di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. La tecnica è più veloce, più efficiente e meno costosa rispetto ai metodi attuali e consente la preparazione di gel di dimensioni personalizzate non altrimenti disponibili. Poiché non richiede alcuna attrezzatura specializzata, il metodo potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca e sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Poliacrilammide (PA) idrogel sono ampiamente usati per testare le risposte delle cellule rigidità-dipendente. 17,24 Miscelando varie concentrazioni di acrilammide (A) e bis-acrilamide (B) si possono fare gel PA che abbracciano la gamma di maggior rigidità tessuti molli in il corpo - 0,3 -.. 300 modulo di kPa giovane 1 Tuttavia, la preparazione di gel di poliacrilammide è noioso e che richiede tempo, spesso limitando la loro utilità in applicazioni &quot;high throughput&quot; come per lo screening e...

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilamide in un formato a piastre con pozzetti multipli. Questo viene ottenuto innanzitutto posizionando la soluzione precurtore del gel tra una piastra di vetro rivestita con un materiale idrofobo e un supporto flessibile in plastica adesiva all'acrilammide. Il secondo passaggio consiste nello staccare il gel dalla piastra di vetro, al quale esso risulta covalentemente legato tramite il supporto in plastica flessibile dopo la polimerizzazione, e lasciarlo asciugare.Successivamente, il gel secco e il supporto di plastica flessibile sottostante vengono tagliati nelle forme desiderate e incollati, con il lato in plastica rivolto verso il basso, ai fondi delle pozzette di una piastra a pozzette multiple o di qualsiasi altro contenitore per colture cellulari. L'ultimo passaggio consiste nel rivestire i gel di poliacrilammide assemblati nella piastra a pozzette multiple con un rivestimento adesivo per cellule, come un monocstrato di collagene di tipo uno. Infine, vengono utilizzate la microscopia e altre tecniche di caratterizzazione cellulare per osservare l'effetto del substrato sottostante di poliacrilammide.In particolare, la sua rigidità sui comportamenti cellulari. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è che consente la manipolazione di qualsiasi rigidità e spessore di gel di polimeri, nonché il loro assemblaggio in formato di piastra multi-pozzetti, in modo economico ed efficiente in termini di tempo, cosa non offerta da altri metodi. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da uno studente nel mio laboratorio.Per prima cosa, preparare la soluzione precursore di poli acrilamide mescolando acrilamide, l'agente di reticolazione bis acrilamide e acqua deionizzata. Sciogliere Sul OPA nel dimetilsolfossido a 50 milligrammi per millilitro. Aliquotare 20 microlitri della soluzione madre in 10 tubi da microcentrifuga. Successivamente, congelare rapidamente le soluzioni in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius.Successivamente, sciogliere il perossisolfato di ammonio in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale di perossisolfato di ammonio pari al 10% peso in volume. Aliquotare 25 microlitri della soluzione di perossisolfato di ammonio in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Preparare una soluzione di collagene a 0,2 milligrammi per millilitro diluendo la soluzione stock di collagene di tipo I in 1x PBS a pH 7,4.Tutte le soluzioni vengono mantenute sul ghiaccio fino all'uso. A questo punto, posizionare alcune gocce di una soluzione idrofobica su una piastra di vetro e utilizzare carta da filtro per distribuirle sulla superficie. Dopo aver lasciato asciugare la piastra all'aria, passare nuovamente la carta da filtro per uniformare il rivestimento idrofobico.Tagliare un supporto di plastica flessibile in modo che corrisponda alle dimensioni della piastra di vetro rivestita di materiale idrofobo. Quindi segnare il lato idrofobo del supporto di plastica flessibile incidendo leggermente la superficie con uno strumento appuntito, come un bisturi. Per la preparazione del gel, aggiungere 4972,5 microlitri di soluzione precursore di poli acrilamide alla concentrazione finale desiderata in un tubo conico da 50 millilitri.Posizionare il tubo in una camera disaerante per 30 minuti con il coperchio aperto. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione di perossido di ammonio precedentemente preparata alla soluzione gelificata di DGAs per ottenere una concentrazione finale di perossido di ammonio dello 0,05%. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di TM me per ottenere una concentrazione finale di TM me dello 0,5%. Mescolare delicatamente la soluzione aspirando e dispensando da tre a cinque volte. Successivamente, posizionare distanziatori di silicone dello spessore desiderato sul lato idrofilo del supporto in plastica flessibile.Quindi pipettare la soluzione del gel sul supporto in plastica flessibile tra gli spaziatori e sovrapporre uno slide di vetro rivestito idrofobico. Dopo aver lasciato polimerizzare il gel per 45 minuti, staccare delicatamente il supporto in plastica flessibile con il gel di poliacrilamide covalentemente legato sulla superficie e posizionare il gel con il lato superiore rivolto verso l'alto per farlo asciugare all'aria. Una volta asciutto, tagliare il gel di poliacrilamide nelle forme desiderate.Preparare circa 500 microlitri di Polymethyl soane per ogni piastra a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore per incollare i gel al fondo di una piastra multipozzetto. Posizionare una piccola goccia di Polymethyl soane al centro di ogni pozzetto utilizzando pinzette. Posizionare un gel di poliacrilammide in ogni pozzetto con il lato del supporto di plastica flessibile rivolto verso il basso.Dopo la polimerizzazione del poli dimetil silossano, aggiungere una piccola quantità del campione di cellulosa precedentemente preparato in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta trasferibile e ruotare delicatamente da un lato all'altro per ricoprire uniformemente la superficie del gel. Posizionare la piastra sotto una lampada UV ad alta intensità per cinque minuti. Al termine, risciacquare i gel con PBS per rimuovere l'eccesso di cellulosa.Successivamente, aggiungere con la pipetta circa 50 microlitri della soluzione di collagene di tipo I precedentemente preparata in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno due ore dopo il risciacquo con PBS per rimuovere l’eccesso di soluzione di collagene. Sterilizzare i gel con luce UV in una cappa a flusso laminare per due ore.Infine, immergere i gel nel mezzo completo per tutta la notte per idratarli ed equilibrarli. Utilizzare i gel per l'adesione cellulare immediatamente oppure conservarli in frigorifero per un massimo di due giorni. Il modulo di Young in funzione di diverse concentrazioni di acrilamide e bis-acrilamide, indicate rispettivamente come A e B, è mostrato qui come previsto.Sia il modulo di stoccaggio G primo che il modulo di perdita G secondo sono indipendenti dalla frequenza. È stato inoltre confermato che l'essiccazione e successiva riidratazione dei gel non influisce sul loro modulo di Young. Utilizzando il crosslinker Sulo sampa, è possibile ottenere un rivestimento uniforme di collagene su idrogel di qualsiasi rigidità.È stato osservato che, quando seminate su gel di poli acrilamide per 24 ore, le cellule di carcinoma mammario M-D-A-M-B 2 31 sono rimaste rotonde sui gel morbidi da 0,5 e 1 chilo pascal, ma sono state in grado di espandersi e allungarsi sul gel rigido da 100 chilo pascal. Inoltre, gli idrogeli realizzati su un supporto di plastica flessibile sono trasparenti e permettono una facile visualizzazione e microscopia. Inoltre, il supporto di plastica flessibile non presenta autofluorescenza e quindi non interferisce con l’imaging di cellule marcate con fluorofori.La morfologia cellulare è stata ulteriormente quantificata in termini di area complessiva di espansione cellulare e circolarità cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare in modo efficiente ed economico gel di poliammide in un formato a piastre multipozzetto. Per lo studio della biologia cellulare dipendente dalla rigidità.

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L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere...

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Questo video mostra un test per studiare l'effetto della rigidità della matrice extracellulare (ECM) sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Gli idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile, ricoperti di collagene, sono stratificati in una piastra a più pozzetti per imitare la rigidità della ECM fisiologica. Dopo aver sovrapposto cellule endoteliali umane sugli idrogel e aver infettato le cellule con batteri Listeria monocytogenes ingegnerizzati per esprimere una proteina...

Un test per studiare l'impatto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica

Questo video mostra la microscopia time-lapse quantitativa per valutare la disseminazione di Listeria monocytogenes dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare attraverso le cellule endoteliali. Un idrogel più morbido facilita una più rapida diffusione batterica attraverso le cellule endoteliali rispetto alle controparti più rigide, evidenziando l'influenza della rigidità della matrice sulla disseminazione batterica.

Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Substrati con rigidità nella gamma kilopascal sono utili per studiare la risposta delle cellule a rigidità di micro-ambiente fisiologicamente rilevanti. Utilizzando solo un microscopio a fluorescenza widefield, il modulo di Young di gel di silicone morbido può essere determinato utilizzando un rientro con una sfera adatta.

Misura di rigidità dei substrati in morbido Silicone per gli studi di Mechanobiology usando un microscopio a fluorescenza Widefield

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.

Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie A seguito di impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT)

Scopri un metodo semplice per preparare gel di poliacrilammide in piastre multiwell per studiare le risposte cellulari dipendenti dalla rigidità. Questa tecnica rapida ed economica non richiede attrezzature specializzate.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

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