Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilamide in un formato a piastre con pozzetti multipli. Questo viene ottenuto innanzitutto posizionando la soluzione precurtore del gel tra una piastra di vetro rivestita con un materiale idrofobo e un supporto flessibile in plastica adesiva all'acrilammide. Il secondo passaggio consiste nello staccare il gel dalla piastra di vetro, al quale esso risulta covalentemente legato tramite il supporto in plastica flessibile dopo la polimerizzazione, e lasciarlo asciugare.

Successivamente, il gel secco e il supporto di plastica flessibile sottostante vengono tagliati nelle forme desiderate e incollati, con il lato in plastica rivolto verso il basso, ai fondi delle pozzette di una piastra a pozzette multiple o di qualsiasi altro contenitore per colture cellulari. L'ultimo passaggio consiste nel rivestire i gel di poliacrilammide assemblati nella piastra a pozzette multiple con un rivestimento adesivo per cellule, come un monocstrato di collagene di tipo uno. Infine, vengono utilizzate la microscopia e altre tecniche di caratterizzazione cellulare per osservare l'effetto del substrato sottostante di poliacrilammide.

In particolare, la sua rigidità sui comportamenti cellulari. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è che consente la manipolazione di qualsiasi rigidità e spessore di gel di polimeri, nonché il loro assemblaggio in formato di piastra multi-pozzetti, in modo economico ed efficiente in termini di tempo, cosa non offerta da altri metodi. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da uno studente nel mio laboratorio.

Per prima cosa, preparare la soluzione precursore di poli acrilamide mescolando acrilamide, l'agente di reticolazione bis acrilamide e acqua deionizzata. Sciogliere Sul OPA nel dimetilsolfossido a 50 milligrammi per millilitro. Aliquotare 20 microlitri della soluzione madre in 10 tubi da microcentrifuga. Successivamente, congelare rapidamente le soluzioni in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius.

Successivamente, sciogliere il perossisolfato di ammonio in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale di perossisolfato di ammonio pari al 10% peso in volume. Aliquotare 25 microlitri della soluzione di perossisolfato di ammonio in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Preparare una soluzione di collagene a 0,2 milligrammi per millilitro diluendo la soluzione stock di collagene di tipo I in 1x PBS a pH 7,4.

Tutte le soluzioni vengono mantenute sul ghiaccio fino all'uso. A questo punto, posizionare alcune gocce di una soluzione idrofobica su una piastra di vetro e utilizzare carta da filtro per distribuirle sulla superficie. Dopo aver lasciato asciugare la piastra all'aria, passare nuovamente la carta da filtro per uniformare il rivestimento idrofobico.

Tagliare un supporto di plastica flessibile in modo che corrisponda alle dimensioni della piastra di vetro rivestita di materiale idrofobo. Quindi segnare il lato idrofobo del supporto di plastica flessibile incidendo leggermente la superficie con uno strumento appuntito, come un bisturi. Per la preparazione del gel, aggiungere 4972,5 microlitri di soluzione precursore di poli acrilamide alla concentrazione finale desiderata in un tubo conico da 50 millilitri.

Posizionare il tubo in una camera disaerante per 30 minuti con il coperchio aperto. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione di perossido di ammonio precedentemente preparata alla soluzione gelificata di DGAs per ottenere una concentrazione finale di perossido di ammonio dello 0,05%. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di TM me per ottenere una concentrazione finale di TM me dello 0,5%. Mescolare delicatamente la soluzione aspirando e dispensando da tre a cinque volte. Successivamente, posizionare distanziatori di silicone dello spessore desiderato sul lato idrofilo del supporto in plastica flessibile.

Quindi pipettare la soluzione del gel sul supporto in plastica flessibile tra gli spaziatori e sovrapporre uno slide di vetro rivestito idrofobico. Dopo aver lasciato polimerizzare il gel per 45 minuti, staccare delicatamente il supporto in plastica flessibile con il gel di poliacrilamide covalentemente legato sulla superficie e posizionare il gel con il lato superiore rivolto verso l'alto per farlo asciugare all'aria. Una volta asciutto, tagliare il gel di poliacrilamide nelle forme desiderate.

Preparare circa 500 microlitri di Polymethyl soane per ogni piastra a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore per incollare i gel al fondo di una piastra multipozzetto. Posizionare una piccola goccia di Polymethyl soane al centro di ogni pozzetto utilizzando pinzette. Posizionare un gel di poliacrilammide in ogni pozzetto con il lato del supporto di plastica flessibile rivolto verso il basso.

Dopo la polimerizzazione del poli dimetil silossano, aggiungere una piccola quantità del campione di cellulosa precedentemente preparato in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta trasferibile e ruotare delicatamente da un lato all'altro per ricoprire uniformemente la superficie del gel. Posizionare la piastra sotto una lampada UV ad alta intensità per cinque minuti. Al termine, risciacquare i gel con PBS per rimuovere l'eccesso di cellulosa.

Successivamente, aggiungere con la pipetta circa 50 microlitri della soluzione di collagene di tipo I precedentemente preparata in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno due ore dopo il risciacquo con PBS per rimuovere l’eccesso di soluzione di collagene. Sterilizzare i gel con luce UV in una cappa a flusso laminare per due ore.

Infine, immergere i gel nel mezzo completo per tutta la notte per idratarli ed equilibrarli. Utilizzare i gel per l'adesione cellulare immediatamente oppure conservarli in frigorifero per un massimo di due giorni. Il modulo di Young in funzione di diverse concentrazioni di acrilamide e bis-acrilamide, indicate rispettivamente come A e B, è mostrato qui come previsto.

Sia il modulo di stoccaggio G primo che il modulo di perdita G secondo sono indipendenti dalla frequenza. È stato inoltre confermato che l'essiccazione e successiva riidratazione dei gel non influisce sul loro modulo di Young. Utilizzando il crosslinker Sulo sampa, è possibile ottenere un rivestimento uniforme di collagene su idrogel di qualsiasi rigidità.

È stato osservato che, quando seminate su gel di poli acrilamide per 24 ore, le cellule di carcinoma mammario M-D-A-M-B 2 31 sono rimaste rotonde sui gel morbidi da 0,5 e 1 chilo pascal, ma sono state in grado di espandersi e allungarsi sul gel rigido da 100 chilo pascal. Inoltre, gli idrogeli realizzati su un supporto di plastica flessibile sono trasparenti e permettono una facile visualizzazione e microscopia. Inoltre, il supporto di plastica flessibile non presenta autofluorescenza e quindi non interferisce con l’imaging di cellule marcate con fluorofori.

La morfologia cellulare è stata ulteriormente quantificata in termini di area complessiva di espansione cellulare e circolarità cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare in modo efficiente ed economico gel di poliammide in un formato a piastre multipozzetto. Per lo studio della biologia cellulare dipendente dalla rigidità.