Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra a più pozzetti. Ciò si ottiene inserendo prima la soluzione precursore del gel tra una lastra di vetro rivestita idrofobica e un supporto in plastica flessibile adesiva acrilammidica. Il secondo passo consiste nel staccare il gel dalla lastra di vetro, che si è attaccata in modo covalente al supporto di plastica flessibile durante la polimerizzazione e lasciarlo asciugare.

Successivamente, il gel secco e il supporto di plastica flessibile sottostante vengono tagliati nelle forme desiderate e incollati con il lato di plastica rivolto verso il basso sul fondo di una piastra multipozzetto o di qualsiasi altro recipiente per colture cellulari. Il passaggio finale consiste nel rivestire i gel di poliacrilammide assemblati con piastra multipozzetto con un rivestimento adesivo cellulare, come un monostrato di collagene di tipo uno. In definitiva, la microscopia, così come altre tecniche di caratterizzazione cellulare, vengono utilizzate per osservare l'effetto del substrato di poliacrilammide sottostante.

In particolare, la sua rigidità sui comportamenti cellulari. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è che consente la gestione di qualsiasi rigidità e spessore di gel di polietilene, nonché il loro assemblaggio in un formato di piastra multi-pozzetto, in un modo economico ed efficiente in termini di tempo, non consentito da altri metodi. La dimostrazione della procedura sarà fatta come studente nel mio laboratorio.

Innanzitutto, preparare la soluzione precursore del gel di poliacrilammide mescolando acrilammide, il reticolante bis acrilammide e l'acqua deionizzata dissolvono Sul OPA in dimetil solfuro a 50 milligrammi per millilitro. Aliquotare 20 microlitri della soluzione madre in 10 provette per microcentrifuga. Quindi flashare, congelare le soluzioni in azoto liquido e conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Quindi, sciogliere l'ammonio per solfato in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale di ammonio per solfato del 10% in peso in volume. Eloqua 25 microlitri di soluzione di ammonio per solfato in 10 provette per microcentrifuga e conservarla a 20 gradi Celsius. Preparare una soluzione di collagene da 0,2 milligrammi per millilitro diluendo la soluzione madre di collagene di tipo uno in un XPBS a pH 7,4.

Tutte le soluzioni vengono mantenute in ghiaccio fino all'uso. A questo punto, posizionare alcune gocce di una soluzione idrofobica su una lastra di vetro e utilizzare della carta velina da stendere sulla superficie. Dopo aver lasciato asciugare la lastra all'aria, strofinare nuovamente con carta velina per uniformare il rivestimento idrofobico.

Tagliare un supporto di plastica flessibile in modo che corrisponda alle dimensioni della lastra di vetro con rivestimento idrofobico. Quindi segnare il lato idrofobico del supporto in plastica flessibile graffiando leggermente la superficie con uno strumento affilato come un bisturi. Per la preparazione del gel, aggiungere 4972,5 microlitri di soluzione di precursore di poliacrilammide della concentrazione finale desiderata in una provetta conica da 50 millilitri.

Posizionare la provetta in una camera di degasaggio per 30 minuti con il tappo aperto. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione di ammonio per solfato precedentemente preparata alla soluzione in gel DGAs per ottenere una concentrazione finale di ammonio per solfato dello 0,05%Quindi aggiungere 2,5 microlitri di TM me per ottenere una concentrazione finale di TM ME dello 0,5%Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù da tre a cinque volte. Posizionare quindi i distanziatori in silicone dello spessore desiderato sul lato idrofilo del supporto in plastica flessibile.

Quindi pipettare la soluzione in gel sul supporto di plastica flessibile tra i distanziatori e il sandwich con una luce scorrevole in vetro con rivestimento idrofobico. Dopo aver lasciato polimerizzare il gel per 45 minuti, staccare il supporto di plastica flessibile con il gel di poliacrilammide attaccato in modo covalente sulla parte superiore e far asciugare il gel con il lato del gel all'aria. Una volta essiccato, tagliare il gel di poliacrilammide nelle forme desiderate.

Preparare circa 500 microlitri di polimetilsoano per piastra da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore per incollare i gel sul fondo di una piastra a più pozzetti. Posizionare una piccola goccia di polimetilsoano al centro di ogni pozzetto usando una pinza. Posizionare un gel di poliacrilammide in ogni supporto di plastica ben flessibile con il lato rivolto verso il basso.

Dopo aver polimerizzato il polidimetil suboxano, posizionare una piccola quantità di sampa di cellulosa precedentemente preparata in ciascun pozzetto con una pipetta di trasferimento e agitare da un lato all'altro per rivestire uniformemente la superficie del gel. Posizionare la piastra a pozzetti sotto una lampada UV ad alta intensità per cinque minuti. Al termine, sciacquare i gel con PBS per rimuovere il violoncello in eccesso.

Dopo questa pipetta, versare circa 50 microlitri della soluzione di collagene di tipo uno precedentemente preparata in ciascuna. Lasciare bene la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno due ore dopo il risciacquo con PBS per rimuovere la soluzione di collagene in eccesso. Sterilizzare i gel sotto la luce UV in una cappa di coltura tissutale per due ore.

Infine, immergere i gel in mezzo completo durante la notte per idratare ed equilibrare. Utilizzare immediatamente i gel per l'alloggiamento delle cellule o conservare in frigorifero per un massimo di due giorni al modulo di Young in funzione di diversi acrilammide e bis. Le concentrazioni di acrilammide designate rispettivamente come A e B sono mostrate qui come anticipato.

Sia il modulo di accumulo G primo che il modulo di perdita G doppio primo sono indipendenti dalla frequenza. È stato anche confermato che l'essiccazione e la successiva reidratazione dei gel non hanno influenzato il modulo dei loro piccoli. Utilizzando il reticolante Sulo sampa, è possibile ottenere un rivestimento uniforme di collagene su idrogel di qualsiasi rigidità.

È stato osservato che quando seminati su gel di poliacrilammide per 24 ore, le cellule del cancro al seno M-D-A-M-B 2 31 sono rimaste rotonde sui gel morbidi da 0,5 e un chilo, ma sono state in grado di diffondersi e allungarsi sul gel rigido da 100 chilogrammi di pascal. Inoltre, gli idrogel realizzati sopra il supporto in plastica flessibile sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione e microscopia. Inoltre, il supporto in plastica flessibile non emette automaticamente fluorescenza e quindi non interferisce con l'imaging di cellule marcate in fluorescenza.

La morfologia cellulare è stata ulteriormente quantificata in termini di area di diffusione cellulare complessiva e circolarità cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di quanto sia efficiente ed economico assemblare i gel di poliammide in un formato di piastra multipozzetto. Per lo studio della biologia cellulare rigidità-dipendente.