Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali tumorali dal carcinoma a cellule squamose della testa e del collo o dalle linee cellulari HNSCC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trattamento del cancro su come utilizzare la chemioterapia per superare la radioresistenza del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza una combinazione di marcatori per ottenere un'elevata specificità nelle cellule staminali tumorali provenienti da linee cellulari HNSCC.

A dimostrare la procedura saranno Prescillia Battiston-Montagne, il nostro tecnico, e Marion Gilormini, un dottorato di ricerca del mio laboratorio. Per selezionare una popolazione laterale di cellule staminali tumorali mediante saggio di efflusso colorante Hoechst, etichettare prima una provetta conica Hoechst e una Hoechst e Verapamil. Successivamente, lavare una coltura cellulare HNSCC con PBS sterile seguito dall'aggiunta di un millilitro di Tripsyn EDTA.

Dopo tre minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con un terreno di coltura cellulare fresco e contare le cellule. Diluire la coltura a una volta da 10 a 10 cellule per millilitro e completare il terreno della linea cellulare parentale. Quindi aggiungere 100 microlitri alla provetta di Hoechst e Verapamil e quattro millilitri di cellule alla provetta di Hoechst.

Successivamente, mescolare delicatamente 10 microlitri di soluzione di Verapamil cloridrato da cinque millimolari nel campione di Hoechst e Verapamil, seguiti da cinque microlitri di Hoechst per una volta 10 per la sesta cellula in entrambe le provette. Quindi coprire i campioni con un foglio di alluminio e posizionarli a 37 gradi Celsius. Dopo 90 minuti con miscelazione delicata ogni 15 minuti centrifugare le provette e risospendere i pellet in due millilitri di PBS.

Dopo una centrifugazione centrale, risospendere il pellet Hoechst e Verapamil in 500 microlitri di ioduro di propidio in PBS e il pellet Hoechst in quattro millilitri dello stesso. Ora filtrate i campioni attraverso filtri cellulari da 70 micron in provette FACS per rimuovere eventuali aggregati e posizionate i campioni su ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi, caricare il campione Hoechst sul citometro a flusso e aprire la finestra Global Worksheet nel software del citometro a flusso.

Fare clic su Dot Plot per creare un grafico sul foglio di lavoro globale e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare i parametri di dispersione in avanti e lateralmente. Crea un grafico a punti con altezza di dispersione laterale allo stesso modo, quindi fai clic su polygon gate per creare una regione P1 nel secondo grafico per selezionare le singole celle e discriminare i doppietti. Quindi, crea un'area di Hoechst rossa con un grafico a punti dell'area di Hoechst blu e fai clic con il pulsante destro del mouse sulle celle per evidenziare la popolazione P1.

Quindi creare una regione P2 per selezionare la popolazione negativa di cellule del colorante di Hoechst che appare come un braccio laterale a sinistra della popolazione principale di cellule e raccogliere 10.000 degli eventi campione di Hoechst. Per confermare che il gate P2 che rappresenta la popolazione laterale sia posizionato correttamente, raccogli anche 10.000 eventi campione di Hoechst e Verapamil. La popolazione laterale dovrebbe scomparire.

Quindi smistare la popolazione laterale di cellule negative al colorante di Hoechst in un tubo conico da 15 millilitri contenente un millilitro di terreno cellulare completo simile a una staminale tumorale. Alla fine dell'ordinamento, far girare le cellule e risospendere il pellet della popolazione laterale in un millilitro di terreno cellulare fresco completo simile a una staminale tumorale. Quindi contare le cellule e seminarle al numero appropriato in un nuovo pallone di coltura cellulare.

Per selezionare il sottogruppo CD44-high/ALDH-high dalle cellule della popolazione laterale ordinate, etichettare prima sette provette coniche sterili da 15 millilitri come indicato. Successivamente, diluire le cellule selezionate a una volta da 10 a sette cellule per millilitro nel terreno delle cellule staminali e aliquotare 100 microlitri di cellule nelle provette CD44-APC e IGG1-APC non colorate e quattro millilitri di cellule nelle provette ALDH e CD44-APC, il tutto su ghiaccio. Centrifugare le cellule e risospendere i pellet CD44-APC e IGG1-APC non colorati in 100 microlitri di tampone uno del kit ALDEFLUOR.

Quindi aggiungere cinque microlitri dell'inibitore dell'ALDH DEAB alle provette ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Risospendere le cellule nella provetta ALDH e CD44-APC in quattro millilitri di reagente C contenente quattro millilitri di tampone uno e 20 microlitri di reagente dal kit e trasferire immediatamente 100 microlitri di queste cellule nelle provette ALDH, ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Quindi posizionare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce, mescolando i campioni dopo 15 minuti con un leggero vortice.

Al termine dell'incubazione, centrifugare tutti i campioni ed eliminare i surnatanti. Quindi posizionare tutte le provette sul ghiaccio e risospendere il pellet ALDH e CD44-APC in quattro millilitri di tampone A, un CD44-APC e i pellet ALDH DEAB e CD44-APC in 100 microlitri dello stesso. Risospendere il pellet IGG1-APC in 100 microlitri di tampone B e le provette ALDH e ALDH e DEAB non colorate in 100 microlitri di tampone uno.

Dopo 10 minuti, centrifugare nuovamente tutti i campioni seguiti da un lavaggio in 1 millilitro di tampone uno per tutti i campioni tranne il campione ALDH e CD44-APC, che viene lavato in quattro millilitri di tampone uno. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere tutti i pellet in un millilitro di tampone fresco, ad eccezione del campione ALDH e CD44-APC, che viene risospeso in quattro millilitri di tampone. Ora caricare le provette ALDH e CD44-APC sul citometro a flusso e creare un APC by fitsy dot plot per visualizzare la popolazione a doppia colorazione.

Quindi, caricare il tubo ALDH per creare un gate per le celle ALDH-high. Le celle positive dovrebbero scomparire quando viene caricata la provetta ALDH e DEAB. Nello stesso grafico, creare un secondo gate utilizzando le provette CD44-APC e IGG1-APC per selezionare le celle alte CD44.

Le celle positive scompariranno quando il tubo IGG1-APC viene caricato. Quindi caricare le provette ALDH e CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC per creare un terzo gate che include le celle CD44-high/ALDH-high. Utilizzare una provetta ALDH-CD44 a doppia colorazione per posizionare l'ultimo gate sulle celle a doppia positività.

Quindi smistare le cellule CD44-high/ALDH-high in una provetta conica da 15 millilitri contenente un millilitro di terreno cellulare completo simile a una staminale, raccogliendo le cellule CD44-low/ALDH-low in un millilitro di terreno di coltura cellulare completo come desiderato. Dopo il secondo ordinamento, placcare le cellule CD44-high/ALDH-high in un pallone di coltura cellulare appropriato con terreno cellulare completo simile alle staminali tumorali nell'incubatore di coltura cellulare per 18-24 ore. Quando le cellule si sono attaccate al fondo del pallone, cambiare il terreno di coltura e rimettere il pallone nell'incubatrice.

Per confermare il potenziale tumorale delle cellule CD44-high/ALDH-high, tripsinizzare il monostrato simile a uno stelo tumorale come dimostrato per ottenere una sospensione di una singola cellula e trasferire una volta 10 alle sei cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in un terreno a basso contenuto di siero integrato con eparina, fattore di crescita epidermico umano ricombinante e B27 e incubare le cellule in una capsula di Petri a basso ancoraggio nell'incubatore di coltura cellulare fino a quando le sfere tumorali non vengono osservate al microscopio ottico. Quando lo smistamento viene eseguito per la prima volta su una nuova linea cellulare, è necessario confermare il potenziale tumorale della linea cellulare come evidenziato dalla sua capacità di formare sfere tumorali in terreno privo di siero in vitro.

Inoltre, la QPCR dovrebbe dimostrare un'elevata espressione di beta-catenina e di altri marcatori di cellule staminali simili da parte delle cellule CD44-high/ALDH-high. Le cellule CD44-high/ALDH-high dovrebbero anche essere in grado di formare tumori in situ quando iniettate in basse quantità rispetto alle cellule CD44-low/ALDH-low. Una volta padroneggiata, ogni selezione delle cellule dovrebbe essere in grado di essere completata in cinque ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di proteggere i campioni marcati con fluorocromo dall'esposizione diretta alla luce. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi di migrazione dell'invasione, per rispondere a ulteriori domande sul coinvolgimento delle cellule staminali tumorali nel processo metastatico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro per esplorare i meccanismi di fuga del tumore nel cancro HNSCC.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule staminali tumorali dalle linee cellulari HNSCC utilizzando l'analisi multiparametrica, citofluorimetrica e la selezione cellulare. Non dimenticare che lavorare con le cellule tumorali e gli agenti di DNA intercalanti può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.