Name: Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Impara a isolare cellule staminali tumorali dal carcinoma squamoso testa-collo usando citometria a flusso multiparametrica. Questo metodo identifica popolazioni CD44-alte/ALDH-alte per studiare resistenza alle terapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Thibault Andrieu e Sebastien Dussurgey della piattaforma di citometria a flusso di UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) per i loro consigli e l'aiuto durante la nostra cernita. Questo lavoro è stato realizzato nell'ambito scientifico di ETOILE e Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida locali sulla cura degli animali. Tutti i dettagli di questo studio sono stati approvati dal CECCAPP, un comitato etico francese. 1. Selezione di una popolazione Side (SP) dalla Hoechst Dye Efflux Assay <ol><li> Colorazione 50 milioni di cellule con colorante Hoechst 33342. <ol><li> Preparare due 15 ml provette sterili con fondo conico: un tubo con l&#39;etichetta &quot;Hoechst&quot; e uno con l&#39;etichetta &quot;Hoechst e Verapamil&quot;. Preparare 10 ml di soluzione di cloridrato 5 mM Verapamil in acqua sterile. Preparare il terreno di coltura (CM) per le cellule staminali. <ol><li> Per preparare CM per CSC (CM-CSC), combinare il seguente: mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% di siero fetale bovino (FCS), 0,04 mg / L di idrocortisone , 100 U / ml di penicillina, 0,1 g / L di streptomicina, e 20 ug / L del fattore di crescita epidermico (EGFR). </li></ol></li><li> Sotto una cappa a flusso laminare, trypsinize cellule. Rimuovere i supporti, lavare con sterile tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA (0,5 g / L) per un pallone da 75 cm². Incubare 3 minuti a 37 ° C. Arrestare la reazione aggiungendo mezzo di coltura utilizzati per la linea cellulare parentale. Contare il numero di cellule utilizzando un contaglobuli. <ol><li> Per preparare CM per linea cellulare parentale (CM-P), integrare DMEM con 10% FCS, 0,4 mg / L di idrocortisone, 100 U / ml di penicillina e 0,1 g / L di streptomicina). </li></ol></li><li> Diluire la sospensione cellulare ottenuta nello stadio 1.1.2 per ottenere 10 7 cellule / ml in CM-P. Dividere la sospensione cellulare nelle 2 provette preparate: mettere 100 microlitri (10 6 cellule) nel tubo &quot;Hoechst e Verapamil&quot; e 4 ml (4 x 10 7 cellule) nel tubo &quot;Hoechst&quot;. </li><li> Nel campione &quot;Hoechst e Verapamil&quot;, aggiungere 10 ml di soluzione di cloridrato 5 mM Verapamil (concentrazione finale: 0.5 mm) e mescolare delicatamente. Aggiungere 5 ml di 1 g / L soluzione Hoechst (concentrazione finale: 0,1 g / L). Nel campione # &amp;34; Hoechst &quot;, aggiungere 5 ml di 1 g / L Hoechst soluzione per 10 6 cellule (200 ml totale) D&#39;ora in poi, mantenere i campioni al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio.. </li><li> Incubare tutte le provette a bagnomaria a 37 ° C per 1 ora e 30 min. Mescolare delicatamente ogni 15 minuti per evitare che le cellule da stabilirsi. </li><li> Tubi centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet con 2 ml di PBS 1x. </li><li> Tubi centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere &quot;Hoechst e Verapamil&quot; pellet in 500 ml di 5 mg / L ioduro di propidio (PI) diluito in tampone PBS e il pellet &quot;Hoechst&quot; in 4 ml di 5 mg / L PI diluito in tampone PBS. </li><li> Trasferire soluzioni campione attraverso un colino 70 micron cella per rimuovere aggregati e raccogliere le cellule singole in tubi per la captazione campione sul citofluorimetro. I campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio. </li></ol></li><li> iosolation della popolazione Side Escludendo colorante Hoechst da Cell Sorting. <ol><li> Eseguire Hoechst separazione cellulare negativa su una citometria a flusso sorter con i seguenti parametri: laser UV (355 nm), 2 rivelatori sul percorso del laser UV con il blu Hoechst (450/50 BP) e rosso Hoechst (610/20 BP) filtri e 2 collettori. <ol><li> In primo luogo, analizzare campione &quot;Hoechst&quot; che funge da controllo positivo per la colorazione e citofluorimetro set-up. </li><li> Utilizzando il software citometro, sulla finestra &quot;Global foglio di lavoro&quot;, clicca su &quot;Dot Plot&quot; (quinta foto in alto a destra) e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. Su ordinata, con un clic destro, selezionare FSC-A (forward scatter) e sulla ascisse, SSC-A (lato dispersione) (Figura 1A). Allo stesso modo, creare un SSC-W contro SCC-H diagramma a punti. Su questa seconda dot plot, per creare una regione P1, fai clic su &quot;Polygon gate&quot; (quattordicesima alto foto a destra) (Figura 1B) 33. Nota: La regione P1comprendere le singole cellule e discriminare doppiette. </li><li> Opzionale: Escludere PI cellule positive con la creazione di un FSC-A rispetto a PI gated su P1. Su questa trama di punti, selezionare la popolazione negativo PI (P2) di escludere le cellule morte PI positivi. </li><li> Utilizzando il software citometro, sulla finestra &quot;Global foglio di lavoro&quot;, cliccare su &quot;Dot Plot&quot; e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. Su ordinata, con un clic destro, selezionare blu Hoechst-A e ascisse, rosso Hoechst-A. Con un clic destro sulla popolazione, selezionare &quot;Mostra della popolazione&quot; e P1. Su questo diagramma a punti, creare una regione (P2) per selezionare le celle negativo Hoechst popolazione lato colorante (SP) che appaiono come un braccio laterale sulla sinistra della principale popolazione di cellule (Figura 1C). </li></ol></li><li> Analizzare il campione &quot;Hoechst&quot; e raccogliere 10.000 eventi. Per garantire che il P2 cancello, che rappresenta la popolazione SP, è ben posizionata, analizzare il campione &quot;Hoechst e Verapamil&quot; (10.000 eventi)per osservare la scomparsa della popolazione SP (Figura 1D). </li><li> Raccogliere le cellule negative colorante SP Hoechst in un tubo da 15 ml contenente 1 ml di CM-CSC preparati in 1.1.1.1. </li><li> Al termine della selezione cellulare, centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 ml di CM-CSC. Contare il numero di cellule filtrate usando un contatore cellulare e trasferire il numero appropriato di cellule in un pallone di coltura (vedi Tabella 1). Aggiungere CM-CSC e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Mantenere cellule in coltura nelle stesse condizioni per un massimo di 2 passaggi fino a quando c&#39;è un minimo di 5 x 10 7 cellule (vedere il passaggio 3, &quot;metodo di coltura cellulare&quot;). </li></ol></li></ol> 2. Selezione del CD44 alta / ALDH alta sub-popolazione nella popolazione Side Sorted <ol><li> Colorazione 50 milioni di celle SP con il Detection Kit ALDH e CD44 anticorpo. <ol><li> Preparare sette 15 ml provette sterili evidenziate nel modo seguente: &quot;senza macchia&quot; (tubo a), &quot;CD44-APC&quot; (tubo b), &quot;IgG1-APC&quot; (tubo c), &quot;ALDH&quot; (tubo d), &quot;ALDH e DEAB &quot;(tubo e),&quot; ALDH e CD44-APC &quot;(tubo f),&quot; ALDH, DEAB e CD44-APC &quot;(tubo g). Mantenere tutte le provette e reagenti a 4 ° C durante la colorazione. </li><li> Preparare tampone A con 4,5 ml di tampone 1 (contenuto nel kit) e 45 microlitri di CD44-APC (Allophycocyanin) anticorpi (diluizione 1: 100). Preparare tampone B con 100 ml di buffer di 1 e 1 ml di anticorpi IgG1-APC (diluizione 1: 100). Preparare tampone C con 4 ml di tampone 1 e 20 ml di reagente del kit. </li><li> Preparare una sospensione cellulare delle cellule precedentemente filtrate (passo 1.2.5) a 10 7 cellule / ml. Aggiungere 100 microlitri (10 6 cellule) della sospensione cellulare ai tubi a, b, c, e 4 ml (4 x 10 7 cellule) per tubo f. Per il momento non mettere cellule in tubi d, e, e g. </li><li> Centrifugare le provette contenenti le cellule a 250 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tubi a, bec in 100 microlitri di tampone 1. Aggiungere 5 ml di dietilaminobenzaldehide (DEAB), un inibitore ALDH per tubi e g. <ol><li> Risospendere le cellule in provetta F con 4 ml di reagente C e trasferire immediatamente 100 ml in tubi d, E e G. Incubare tutte le provette a bagnomaria a 37 ° C per 30 min e proteggere dalla luce diretta usando un foglio di alluminio. Mescolare la sospensione cellulare gentilmente con vortex dopo 15 minuti per evitare che le cellule da stabilirsi. </li></ol></li><li> Da questo momento, mantenere i tubi in ghiaccio e al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio. Centrifugare tutte le provette a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> tubo Risospendere f in 4 ml e tubi be g con 100 ml di tampone A. Risospendere tubo c con 100 ml di tampone B. Per gli altri tubi, aggiungere 100 ml di tampone 1. Incubare 10 minuti a 4 °; C. </li><li> Centrifugare tutte le provette a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risciacquare una volta con 1 ml di tampone 1 (4 ml per tubo f) e centrifugare di nuovo a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere tubo f pellet in 4 ml e tutti gli altri tubi in 1 ml di tampone 1. </li><li> Trasferire le soluzioni campione attraverso 70 filtri cellulari micron per rimuovere aggregati e raccogliere le cellule singole in tubi appropriati per l&#39;assorbimento del campione sul citofluorimetro. </li></ol></li><li> Isolamento del CD44 alta / alta ALDH cellulare Popolazione per Fluorescence Activated di separazione delle cellule. <ol><li> Eseguire CD44 alta / ALDH alta cell sorting su un citofluorimetro sorter con i seguenti parametri: laser blu (488 nm) e laser rosso (633 nm), 1 rivelatore sul percorso laser blu con un filtro FITC (530/30), 1 rivelatore sul percorso laser rosso con un filtro APC (660/20) e di 2 collettori. </li><li> Utilizzando il software citometro, clicca su &quot;Dot Plo(Quinta foto in alto a destra) t &quot;per creare un FSC-A vs SSC-A dot plot come descritto nella sezione 1.2.1.2, per controllare la morfologia cellulare e selezionare una popolazione composta di singole cellule con un SSC-W contro SSC-H dot plot. </li><li> Utilizzando il software citometro, sulla finestra &quot;Global foglio di lavoro&quot;, cliccare su &quot;Dot Plot&quot; e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. In ordinata, con un clic destro, selezionare APC-A e ascisse, FITC-A al fine di selezionare la popolazione doppia macchiato. Creare un cancello con tubi d ed e per selezionare alti cellule ALDH (Figura 2A). Nota: le cellule positive scompaiono in tubo e trattati con DEAB (Figura 2B). <ol><li> Nella stessa tabella, creare una seconda porta usando b ec tubi per selezionare elevati cellule CD44 (Figura 2C e 2D). cellule positive scompaiono nel tubo contenente IgG1-APC. Analizzare i tubi F e G e creare una terza porta che comprende CD44 alta / ALDH &lt;sup&gt; cellule di alta (Figura 2E e 2F). Nota: Se le cellule positive sono presenti nel tubo contenente IgG1-APC (Figura 2D), l&#39;interazione tra cellule e l&#39;anticorpo APC-tinto non è specifico. </li></ol></li><li> Raccogliere CD44 alta / ALDH cellule di alta in una provetta da 15 ml contenente 1 ml di CM-CSC. Raccogliere anche CD44 basso / ALDH bassa in un tubo da 15 ml contenente 1 ml di CM 19. Nota: Preparare CM-CSC come descritto al punto 1.1.1.1. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di CM-CSC. Contare il numero di cellule ordinati. </li></ol></li></ol> 3. Metodo cellulare Cultura <ol><li> Dopo il doppio ordinamento delle cellule come descritto sopra, piastra celle ordinate in un pallone di coltura appropriato (Tabella 1) con CM-CSC a 37 ° C con 5% di CO 2. Dopo 18-24 ore,verificare se le cellule hanno aderito e cambiare il terreno di coltura. Cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni fino a quando le colonie espansione sono superiori al 50% confluenti. </li><li> Utilizzare il volume appropriato di tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabella 1) per trypsinize cellule dal pallone di coltura. Incubare le cellule da 3 a 5 min a 37 ° C. Aggiungere il volume appropriato di CM-CSC (Tabella 1) per fermare l&#39;azione di tripsina. </li><li> Contare il numero di cellule ottenute e la piastra 4 x 10 5 cellule in un pallone di coltura 175 cm² con CM-CSC. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. A questa concentrazione, le cellule con un tempo di raddoppio di 24 ore sarà al 70% confluenti in 7 giorni. </li><li> Utilizzare CSC per in vitro o in vivo prima di aver subito 3 passaggi. </li></ol> 4. Conferma di tumore potenziale e CSC Caratteristiche <ol><li> Tumore Sphere Formazione per confermare il potenziale tumore della CD44 alta / ALDHalti cellule. <ol><li> Trypsinize cellule come descritto al punto 3.2. Aggiungere 1 x 10 6 cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un DMEM: F12 (3: 1) FCS medie libero, 20 ng / ml di rhEGF, 4 mg / L di eparina e 1x B27. Incubare le cellule in un pallone di coltura 6 così bassa piastre di ancoraggio a 37 ° C e 5% CO 2. Nota: Uso DMEM: F12 (3: 1) medium contenente il 5% di FCS, 20 ng / ml di rhEGF, 4 mg / L di eparina e 1x B27 se la cella non crescere senza FCS. </li><li> Osservare la formazione sfera tumore con un microscopio ottico da 4 a 10 giorni dopo la semina (Figura 3A). Nota: Tumor diametro della sfera deve essere superiore a 35 micron. Alti / alti cellule CD44 ALDH mostreranno un tumore formazione più veloce e più avanzata sfera in termini di numero e di dimensioni rispetto a CD44 basso / ALDH basso. </li></ol></li><li> La valutazione di In Vivo tumorigenicity DopoL&#39;iniezione sottocutanea di CD44 alti / alti ALDH cellule in topi NOD-SCID. <ol><li> Dopo la cernita, risospendere le cellule in PBS a tre diverse concentrazioni (10 4 cellule / ml, 10 5 cellule / ml, e 10 6 cellule / ml). Iniettare per via sottocutanea 100 pl di 10 4 cellule / ml (10 3 cellule) nella regione fianco destro di 6 topi. Fare lo stesso per 10 5 cellule / ml (10 4 cellule), e 10 6 cellule / ml (10 5 cellule). Nota: Lower diluizione di 10 3 cellule possono essere testati. </li><li> Iniettare la stessa concentrazione di CD44 bassi / ALDH basse cellule nella regione fianco sinistro. Topi Monitor iniettata per un massimo di 10 settimane per vedere la progressione del tumore 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li>
<li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+%27Jedi%27+that+went+over+to+the+%27dark+side.%27%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133%2B+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67(2006).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+Cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li>
<li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li>
<li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064(2009).</li>
<li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+CD133%28%2B%29+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li>
<li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met%E2%81%BA+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li>
<li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li>
<li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li>
<li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+CD44%2B+cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44%28%2B%29ALDH1%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li>
<li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li>
<li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinelt%2C+E+%22Technical+Bulletin%3A+Standardizing+Application+Setup+Across+Multiple+Flow+Cytometers+Using+BD+FACSDiva+Version+6+Software%22">Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software</a>. , BD Biosciences. (2012).</li>
<li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li>
<li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li>
<li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li>
<li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2%2FNeu+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l&#39;isolamento successo di CSC da una linea cellulare specifica che è applicabile ad altre linee cellulari HNSCC. Isolati testa e del collo CSC sono quindi adatte per l&#39;ulteriore caratterizzazione molecolare in vitro e validazione funzionale da trapianto in topi immunodeficienti 19. Tuttavia, alcune modifiche possono essere testate seconda popolazione lato o le alte percentuali alta / ALDH CD44 presenti nella linea cellul...

Testa e del collo a cellule squamose di carcinoma (HNSCC) è un tumore comune in tutto il mondo e nonostante i progressi nei trattamenti attuali, i pazienti con malattia avanzata hanno una prognosi sfavorevole. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni generale del paziente è di circa il 30%, nonostante la combinazione di approcci terapeutici tra cui la chirurgia, chemio-radioterapia e-terapie mirate. Recenti studi attribuiscono recidive locali e metastasi a distanza per la sopravvivenza delle cellule staminali simil-tumorali (CSC) a seguito di terapie antitumorali 1. Ci sono prove a sostegno accumulando l&#39;esistenza di cellule che presentano cellule staminali proprietà (capacità di stato indifferenziato, auto-rinnovamento e differenziazione, e l&#39;attività della telomerasi) in vari tumori solidi, tra cui seno, del cervello, della prostata, del polmone, del colon, del pancreas, del fegato e della pelle 2- 10. Tuttavia, l&#39;origine della CSC rimane poco chiaro 11,12. Essi possono derivare dalla trasformazione maligna delle cellule staminali normali 3,13 o dedifferenziazione delle cellule tumorali che acquisiscono CSC-come caratteristiche 14,15. Pertanto, la comprensione percorsi distintivi relativi a CSC fornirà spaccato la diagnosi precoce e il trattamento di HNSCC resistenti. E &#39;stato proposto che CSC possiedono anche fenotipi resistenti che eludono chemioterapia standard e radioterapia, con conseguente ricaduta del tumore rispetto alla massa di cellule tumorali 16-19 e sono localizzate in ipossico nicchie 20. Numerosi fattori sono stati proposti per spiegare queste resistenze di CSC, come la propensione al quiescenza, migliorato di riparazione del DNA, up-regolati meccanismi di controllo del ciclo cellulare, Kärcher radicali liberi 21. Inoltre, diversi percorsi molecolari oncogeni possono essere attivati ​​in modo specifico CSC 17. Al fine di migliorare la conoscenza della CSC per ulteriori mirate terapie, abbiamo bisogno di metodi affidabili per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento di CSC, a causa della eterogeneità dei marcatori di cellule staminali nel legativari tipi di tumori 22. In HNSCC, staminali simil-cellule tumorali-inizio sono stati isolati da tumori di pazienti primario di classificare cellule che esprimono diversi biomarcatori CSC (come ad esempio l&#39;efflusso di droga trasportatori espressione 23, CD44 alto, alto CD24 basso CD133, c-Met + fenotipo 10,24, 25, o ALDH alta attività 26) o la coltivazione di tumore primario del paziente in modo da formare squamospheres che hanno proprietà CSC. Tuttavia, il numero di squamospheres diminuisce drasticamente dopo due passaggi, dando così un campione di dimensioni piccole per un&#39;ulteriore caratterizzazione studi 27. Pertanto, test in vitro a partire da linee cellulari ben consolidata è una soluzione più facile da progettare esperimenti, al fine di migliorare la conoscenza della CSC. Lo scopo di questo articolo è quello di proporre un metodo per isolare CSC da linee cellulari HNSCC utilizzando multiparametrica citometria a flusso di analisi di unND cellule di smistamento. L&#39;espressione di CD44 in correlazione con diverse proprietà CSC compresa l&#39;attività ALDH, laterale della popolazione (SP) fenotipo, capacità formazione sferoide e tumorigenicità sono utilizzati per isolare e caratterizzare questa sotto-popolazione di CSC. CD44, una glicoproteina sulla superficie cellulare, è coinvolto nella adesione cellulare e la migrazione. CD44 è altamente espresso in molti tumori solidi CSC 28, anche nel cancro della testa e del collo modelli 29-31. Inoltre, alti cellule CD44 possono generare in vivo un tumore eterogeneo, mentre CD44 bassi cellule non possono 10. Il saggio SP si basa sul potenziale differenziale delle cellule per efflusso il colorante Hoechst 22 attraverso la famiglia ATP-binding cassette (ABC) del trasportatore proteine ​​overexpressed all&#39;interno della membrana CSC. Questo test prevede l&#39;uso di inibitori del trasportatore ABC come verapamil in campioni di controllo. Deidrogenasi (ALDH) è un enzima intracellulare che è coinvolto nella conversione di retinolo a macerareL&#39;acido inoic durante staminali precoce differenziazione delle cellule 25,26. Le cellule che presentano l&#39;attività spettacolo staminali come il comportamento delle cellule di alta ALDH in HNSCC 26 e pochissimi numero di alta cellule ALDH sono in grado di generare tumori in vivo 26,32. La combinazione di questi marcatori e proprietà è stato usato con successo da Bertrand e t al. Per studiare la resistenza in vitro e in vivo di questi CSC PHOTON e ​​ioni di carbonio radiazioni 19. I loro risultati hanno mostrato chiaramente che la combinazione di vari marcatori e le proprietà delle cellule sono più selettivi per gli studi sulle popolazioni utili HNSCC CSC di approcci singolo marcatore.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale di vitello Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone solubile in acqua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La soluzione deve essere preparata appena prima dell'uso perché è molto instabile</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Integratore (50x), meno vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosivo, tossicità acuta (orale, cutanea, inalazione) categoria 4</td></tr><tr><td>Verapamil cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione) categoria 3</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione) categoria 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, anticorpo umano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, anticorpo umano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Particella di coltro Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Linea cellulare CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Regalo da John Little' s</td> <td>Laboratorio-Linea</td><td></td></tr> <tr><td>cellulare FaDu</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a basso ancoraggio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose carcinoma sottopopolazione avere stem cell caratteristiche

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Nonostante i progressi nella comprensione della testa e del collo progressione carcinomi a cellule squamose (HNSCC), il tasso di sopravvivenza a cinque anni rimane basso a causa di recidive locali e metastasi a distanza. Una ipotesi per spiegare questo recidiva è la presenza di cellule staminali simil-tumorali (CSC) che presentano chemio intrinseca e radio-resistenza. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, è necessario disporre di modelli sperimentali che convalidano l&#39;efficacia dei trattamenti mirati e quindi avere metodi affidabili per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento di CSC. A tal fine, presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento di CSC da linee cellulari umane HNSCC che si basa sulla combinazione di due cernite successive cellulari eseguite da cellule attivate a fluorescenza (FACS). Il primo si basa sulla proprietà di CSC per overexpress ATP-binding cassette (ABC) proteine ​​di trasporto e quindi di escludere, tra gli altri, i coloranti DNA vitali come Hoechst 33342. Le celle ordinate con °è il metodo sono identificati come &quot;popolazione side&quot; (SP). Come le cellule SP rappresentano una bassa percentuale (&lt;5%) di cellule parentali, una fase di crescita è necessaria al fine di aumentare il loro numero prima della seconda separazione delle cellule. Il passaggio successivo consente la selezione di cellule che possiedono due altre caratteristiche di cellule staminali HNSCC esempio alto livello di espressione del marcatore di superficie cellulare CD44 (CD44 alto) e la sovraespressione di aldeide deidrogenasi (ALDH alto). Poiché l&#39;uso di un singolo marcatore ha numerose limitazioni e trappole per l&#39;isolamento del CSC, la combinazione di SP, CD44 e marcatori ALDH fornirà uno strumento utile per isolare CSC di ulteriori test analitici e funzionali richiedono cellule vitali. Le caratteristiche staminali-come CSC è stato finalmente validati in vitro dalla formazione di tumorispheres e l&#39;espressione di β-catenina.

L&#39;isolamento di CSC da linee cellulari HNSCC richiesto due successive di smistamento a causa della bassissima percentuale di CSC nella linea cellulare dei genitori. La prima cernita era basato sulla capacità di CSC di escludere il colorante Hoechst causa di trasportatori di efflusso droga. Ciò ha comportato l&#39;acquisizione del 1-5% della popolazione totale di cellule filtrate (Figura 1). Durante il colorante Hoechst ordinamento cellulare negativa, controllare la d...

Comprendere il ruolo delle cellule staminali tumorali nella recidiva del tumore e nella resistenza alle terapie è diventato un argomento di grande interesse nell'ultimo decennio. Questo articolo descrive l'isolamento e la caratterizzazione della sottopopolazione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma squamoso della testa e del collo (HNSCC).

Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, o HNSCC. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trattamento del cancro riguardo al modo in cui utilizzare la chemioterapia per superare la radioresistenza tumorale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza una combinazione di marcatori per ottenere un'elevata specificità nelle cellule staminali tumorali provenienti da linee cellulari HNSCC.La procedura sarà dimostrata da Prescillia Battiston-Montagne, la nostra tecnica, e da Marion Gilormini, un dottoranda del mio laboratorio. Per selezionare una popolazione laterale di cellule staminali tumorali mediante saggio di efflusso del colorante Hoechst, etichettare innanzitutto un tubo conico come Hoechst e un altro come Hoechst e Verapamil. Successivamente, lavare una coltura cellulare di HNSCC con PBS sterile, seguito dall'aggiunta di un millilitro di tripsina EDTA.Dopo tre minuti a 37 gradi Celsius, fermare la reazione con mezzo fresco di coltura cellulare e contare le cellule. Diluire la coltura fino a 1 × 10⁷ cellule per millilitro e completare con il mezzo della linea cellulare parentale. Quindi aggiungere 100 microlitri al tubo contenente Hoechst e Verapamil e quattro millilitri di cellule al tubo contenente Hoechst.Successivamente, mescolare delicatamente 10 microlitri di soluzione di cloridrato di verapamil a cinque millimolari nel campione di Hoechst e verapamil, seguiti da cinque microlitri di Hoechst per un milione di cellule in entrambi i tubi. Quindi coprire i campioni con stagnola d’alluminio e posizionarli a 37 gradi Celsius. Dopo 90 minuti, con mescolamento delicato ogni 15 minuti, centrifugare i tubi e risospendere i pellet in due millilitri di PBS.Dopo una centrifugazione centrale, risospendere il pellet di Hoechst e Verapamil in 500 microlitri di ioduro di propidio in PBS e il pellet di Hoechst in quattro millilitri della stessa soluzione. Filtrare ora i campioni attraverso filtri cellulari da 70 micron in provette FACS per rimuovere eventuali aggregati e posizionare i campioni sul ghiaccio, protetti dalla luce. Successivamente, caricare il campione di Hoechst sul citometro a flusso e aprire la finestra del foglio di lavoro globale nel software del citometro a flusso.Fare clic su Grafico a dispersione per creare un grafico nel Foglio di lavoro globale e fare clic con il tasto destro per selezionare i parametri di scattering laterale e anterogrado. Creare un grafico a dispersione di scattering laterale in funzione dell'altezza dello scattering laterale nello stesso modo, quindi fare clic su Selezione poligonale per creare una regione P1 nel secondo grafico al fine di selezionare le cellule singole e discriminare i doppietti. Successivamente, creare un grafico a dispersione dell'area del rosso Hoechst in funzione dell'area del blu Hoechst e fare clic con il tasto destro sulle cellule per evidenziare la popolazione P1.Creare quindi una regione P2 per selezionare la popolazione laterale di cellule negative al colorante Hoechst, che appare come un'estensione laterale a sinistra della popolazione principale di cellule, e raccogliere 10.000 eventi del campione Hoechst. Per confermare che la finestra P2 che rappresenta la popolazione laterale sia posizionata correttamente, raccogliere anche 10.000 eventi del campione Hoechst e Verapamil. La popolazione laterale dovrebbe scomparire.Quindi, separare la popolazione laterale di cellule negative al colorante Hoechst in un tubo conico da 15 millilitri contenente un millilitro di mezzo completo per cellule staminali tumorali. Al termine della separazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet della popolazione laterale in un millilitro di mezzo completo fresco per cellule staminali tumorali. Successivamente, contare le cellule e seminarle in un nuovo flacone per coltura cellulare nel numero appropriato.Per selezionare il sottoinsieme CD44-alto/ALDH-alto dalle cellule della popolazione laterale ordinate, etichettare innanzitutto sette provette coniche sterili da 15 millilitri come indicato. Successivamente, diluire le cellule ordinate a un milione di cellule per millilitro in mezzo per cellule staminali e suddividere 100 microlitri di cellule nelle provette non colorate CD44-APC e IGG1-APC e quattro millilitri di cellule nella provetta ALDH e CD44-APC, mantenendo tutto sul ghiaccio. Centrifugare le cellule e risospendere i pellet non colorati CD44-APC e IGG1-APC in 100 microlitri di buffer uno del kit ALDEFLUOR.Quindi aggiungere cinque microlitri dell'inibitore ALDH DEAB ai tubi ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Risospendere le cellule nel tubo ALDH e CD44-APC in quattro millilitri di reagente C contenente quattro millilitri di buffer uno e 20 microlitri del reagente del kit e trasferire immediatamente 100 microlitri di queste cellule nei tubi ALDH, ALDH e DEAB, e ALDH DEAB e CD44-APC. Successivamente, posizionare tutti i tubi in un bagno termico a 37 gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce, mescolando i campioni dopo 15 minuti mediante vortex delicato.Al termine dell'incubazione, centrifugare tutti i campioni e scartare i soprannatanti. Quindi posizionare tutte le provette sul ghiaccio e risospendere il pellet di ALDH e CD44-APC in quattro millilitri di tampone A, i pellet di CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC in 100 microlitri dello stesso. Risospendere il pellet di IGG1-APC in 100 microlitri di tampone B e le provette non colorate di ALDH e ALDH e DEAB in 100 microlitri di tampone uno.Dopo 10 minuti, centrifugare nuovamente tutti i campioni, seguito da un lavaggio con 1 millilitro di tampone uno per tutti i campioni tranne il campione ALDH e CD44-APC, che viene lavato con quattro millilitri di tampone uno. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere tutti i pellet in un millilitro di tampone uno fresco, tranne il campione ALDH e CD44-APC, che viene risospeso in quattro millilitri di tampone uno. A questo punto, caricare il tubo di ALDH e CD44-APC nel citometro a flusso e creare un grafico a dispersione APC rispetto a fitsy per visualizzare la popolazione doppiamente marcata.Successivamente, caricare il tubo ALDH per creare un gate per le cellule ALDH-positive. Le cellule positive dovrebbero scomparire quando viene caricato il tubo ALDH e DEAB. Nello stesso grafico, creare un secondo gate utilizzando i tubi CD44-APC e IGG1-APC per selezionare le cellule CD44-positive.Le cellule positive scompariranno quando il tubo IGG1-APC viene caricato. Successivamente, caricare i tubi ALDH e CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC per creare una terza finestra che includa le cellule CD44-alte/ALDH-alte. Utilizzare il tubo di doppia colorazione ALDH-CD44 per posizionare l'ultima finestra sulle cellule doppio-positive.Quindi, separare le cellule CD44-alto/ALDH-alto in un tubo conico da 15 millilitri contenente un millilitro di mezzo completo per cellule staminali tumorali, raccogliendo le cellule CD44-basso/ALDH-basso in un millilitro di mezzo completo per colture cellulari, secondo necessità. Dopo il secondo frazionamento, seminare le cellule CD44-alto/ALDH-alto in un’adeguata fiasca per colture cellulari con mezzo completo per cellule staminali tumorali, ponendola nell’incubatrice per colture cellulari per 18-24 ore. Quando le cellule si saranno attaccate al fondo della fiasca, sostituire il mezzo di coltura e reinserire la fiasca nell’incubatrice.Per confermare il potenziale tumorale delle cellule CD44-alto/ALDH-alto, trattare con tripsina il monostrato di cellule staminali tumorali come illustrato per ottenere una sospensione monocellulare e trasferire un milione di cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in mezzo con basso contenuto di siero integrato con fattore di crescita epidermico umano ricombinante, eparina e B27 e incubare le cellule in una piastra di Petri a basso ancoraggio nell'incubatore per colture cellulari fino a quando non si osservano sfere tumorali mediante microscopia ottica. Quando il sorting viene eseguito per la prima volta su una nuova linea cellulare, è necessario confermare il potenziale tumorale della linea cellulare, dimostrato dalla sua capacità di formare sfere tumorali in vitro in mezzo privo di siero.Inoltre, la QPCR dovrebbe dimostrare un'elevata espressione di beta-catenina e di altri marcatori delle cellule con fenotipo stamminale nelle cellule CD44-high/ALDH-high. Le cellule CD44-high/ALDH-high dovrebbero inoltre essere in grado di formare tumori in situ quando iniettate in basse quantità rispetto alle cellule CD44-low/ALDH-low. Una volta acquisite le competenze necessarie, ogni analisi cellulare dovrebbe poter essere completata in cinque ore se eseguita correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di proteggere i campioni marcati con fluorocromo dall'esposizione diretta alla luce. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come saggi di migrazione e invasione, per rispondere ad ulteriori domande sul coinvolgimento delle cellule staminali tumorali nel processo metastatico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro per esplorare i meccanismi di fuga tumorale nel cancro del capo e del collo (HNSCC).Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma del capo e del collo (HNSCC) mediante analisi multiparametrica con citometria a flusso e separazione cellulare. Non dimenticare che lavorare con cellule tumorali e agenti intercalanti del DNA può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare camice da laboratorio e guanti, durante l'esecuzione di questa procedura.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Dispositivo compartimentazione microfluidi staminali per studiare la migrazione delle cellule tumorali è descritto. Questa nuova piattaforma crea un microambiente vitale cellulare e consente la visualizzazione microscopica di locomozione cellule vive. Altamente mobili le cellule tumorali sono isolate per lo studio dei meccanismi molecolari di infiltrazione aggressivi, che possono portare a terapie più efficaci in futuro.

Valutazione della migrazione delle cellule staminali del cancro mediante compartimentazione dispositivi microfluidici e Live Cell Imaging

In questo video, descriviamo l'isolamento di una sottopopolazione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma squamoso della testa e del collo utilizzando un selezionatore di cellule attivato dalla fluorescenza o FACS. La popolazione laterale isolata di cellule può essere utilizzata per ulteriori analisi a valle.

Saggio di discriminazione della popolazione sul lato del cancro: un metodo per isolare le cellule staminali tumorali utilizzando il saggio di efflusso del colorante Hoechst

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come...

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

L'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC) direttamente da tessuti umani è necessaria per la loro caratterizzazione biologica. Questo manoscritto descrive una metodologia per l'isolamento di CSC prostata da tessuti umani, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei problemi passi difficili.

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Le cellule staminali del cancro del pancreas (CSC) possono essere espanse in vitro utilizzando la tecnica di coltura della sfera indipendente dall'ancoraggio, che rappresenta un potente strumento per studiare la biologia delle CSC e può servire come primo passo per sviluppare nuove terapie mirate alle CSC. Qui viene fornita la metodologia per l'espansione, l'analisi e il targeting delle CSC pancreatiche.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) in sarcomi ossei è stato recentemente collegato a loro patogenesi. In questo articolo, vi presentiamo l'isolamento di CSC da colture cellulari primarie ottenute da biopsie umane di osteosarcoma convenzionale (OS) con la capacità di CSC di crescere in condizioni non aderenti.

Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.

Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Impara a isolare cellule staminali tumorali dal carcinoma squamoso testa-collo usando citometria a flusso multiparametrica. Questo metodo identifica popolazioni CD44-alte/ALDH-alte per studiare resistenza alle terapie.

Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche (Video) | JoVE Journal

Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

Esplora altri video