Name: Proteine di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine solubili e insolubili In vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara un saggio di sovrapposizione proteica su membrana per studiare interazioni tra proteine solubili e insolubili in vitro. Questo metodo utilizza immunoblotting per rilevare legami specifici con proteine immobilizzate.

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Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto anche da finanziamenti del NIH, USDA Istituto Nazionale di Alimentazione e l&#39;Agricoltura, NSF, BARD, DOE, e BSF a VC

1. Espressione e l'estrazione delle proteine <ol><li> Differenziale tag le proteine ​​da testare per la loro rilevazione. Etichetta la proteina di essere immobilizzato sulla membrana (ProIM) con un tag di dimensioni più grandi (ad esempio, GST), e il tag non condensato può essere utilizzato come controllo negativo immobilizzato (ProIMnc). Etichetta la proteina da usare come una sonda solubile (ProSol) sia con un grande o un tag di piccole dimensioni. Fusibile lo stesso tag di una proteina solubile appropriato controllo negativo (ProSOLnc) e includono nel test di interazione per confermare la specificità del legame rilevato. </li><li> Scegliere il sistema di espressione proteica di esprimere proteine ​​tag, vale a dire, E. coli, baculovirus, ecc, a seconda delle necessità di eventuali modifiche dopo traduzionali e le rese delle proteine. </li><li> Estratto ProIM e ProIM nc dall'organismo di scelta (passo 1,2) con SDS-PAGE tampone di caricamento (20% glicerolo, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) contenente proteinasi cocktail di inibitori. Lascia la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 15 minuti, aggiungere 0,5% di 2-mercaptoetanolo e fate bollire per 5 minuti. </li><li> Estratto ProSol e ProSol nc dall'organismo di scelta (passo 1,2) utilizzando uno standard protocolli 16. Queste proteine ​​dovrebbero essere facilmente solubile nel buffer di legame (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% di BSA, 0.1% Tween 20) utilizzato nel passaggio 4.1. </li><li> Determinare la concentrazione delle proteine ​​ricombinanti utilizzando un metodo standard, come Bio-Rad kit di analisi delle proteine. come il Bio-Rad kit di analisi delle proteine. Se estratto grezzo, piuttosto che le proteine ​​purificate, viene utilizzato per l'analisi, stima la concentrazione della proteina di interesse in questo estratto attraverso la scansione densitometria della banda corrispondente su un SDS-poliacrilammide gel colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250 e l'utilizzo di note concentrazioni di BSA come riferimento. </li></ol> 2. Immobilizzazione di ProIM e ProIMnc sulla membrana <ol><li> Risolvere due serie di estratti, contenenti ciascuno 1 mg di ProIM e ProIM nc su un SDS-poliacrilammide gel secondo il protocollo standard 16. </li><li> Dopo l'elettroforesi, posto il trasferimento del gel in 100 ml di buffer di trasferimento (60 mM glicina, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) e incubare con leggera agitazione per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Electrotransfer le proteine ​​contenute nel gel ad una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard 16. </li></ol> 3. Re-piegatura di proteine ​​di membrana <ol><li> Dopo electrotransfer, incubare la membrana per 15 minuti in 15 ml di tampone A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0,05% Tween 20) e scuotendo con cautela per rimuovere residui di SDS. </li><li> Dopo aver svuotato con cura, trasferire la membrana a 25 ml di tampone di denaturazione (7 M guanidina, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione. (Nota: La membrana di nitrocellulosa diventa opaco quando incubati nel buffer di denaturazione). e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Trasferire la membrana di 25 ml di TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) e incubare con leggera agitazione per 5 min (Nota: durante questa fase, la membrana riacquista il suo originario colore bianco). </li><li> Trasferire la membrana a 25 ml di tampone vincolanti (vedi punto 1.2) e incubare a 4 ° C con agitazione per il pernottamento. </li></ol> 4. Sondaggio della ProIM da ProSol <ol><li> Tagliare la membrana in due strisce, entrambi contenenti ProIM e ProIM nc. </li><li> Rendere le soluzioni di ibridazione ProSol e ProSOLnc diluendo la preparazione con mcg 1-10 di entrambi ProSol o ProSOLnc in 10 ml di tampone fresco vincolanti. Trasferire ciascuna membrana nella soluzione di ibridazione ProSol o ProSOLnc e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. </li><li> Rimuovere le membrane dalle soluzioni ibridazione e lavare tre volte per 15 minuti ciascuno in TBS. </li></ol> 5. Visualizzazione interazione proteina-proteina mediante immunoblotting <ol><li> Blocco della membrana con 2,5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo primario (anti-strepII anticorpo policlonale di coniglio) in 0,5% di latte scremato in TBST alla concentrazione consigliata dal produttore. </li><li> Posizionare le membrane bloccato nella soluzione di anticorpi, e incubate per 1 ora a temperatura ambiente o per la notte a 4 ° C con agitazione. </li><li> Sciacquare le membrane in 20 TBST ml per 15 minuti, e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Diluire l'anticorpo secondario (anti-IgG di coniglio) coniugati con perossidasi di rafano (HRP) in 0,5% di latte scremato in TBST alla concentrazione consigliata dal produttore. Posizionare le membrane in anticorpo secondariosoluzione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. </li><li> Sciacquare le membrane in 20 TBST ml per 15 minuti, e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Dopo l'ultimo risciacquo con TBS, visualizzare le interazioni proteina-proteina utilizzando un substrato chemiluminescenza HRP (ad esempio, Millipore Immobilon occidentale chemiluminescente substrato HRP). </li><li> Sonda le membrane stesse con l'anticorpo primario per il tag fusa ProIM, seguita da l'anticorpo secondario appropriato, come descritto nei passaggi 5,1-5,4. Visualizza ProIM e ProIMnc come descritto al punto 5.5 per convalidare l'identità delle bande ottenute nel test di sovrapposizione proteina di membrana (punto 5.5). Nella maggior parte dei casi, stripping non è necessario, perché il segnale ottenuto da questo passaggio è molto più forte segnale di residui ottenuti a partire dal punto 5.5. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: L'ANK-MP interazione è stata osservata da BiFC nelle cellule epidermiche tabacco (Figura 1A). Poiché MP è una proteina altamente insolubile se espresso in batteri o nelle piante, analisi delle proteine ​​della membrana sovrapposizione è stato adottato per convalidare questa interazione in vitro (Figura 1B). Estratti proteici contenenti 1 mg di GST-MP (ProIM) o non condensato GST (ProIM nc) sono stati risolti mediante SDS-poliacrilammide gel elettroforesi, seguita da electrotransfer una membrana di nitrocellulosa. Quando questi sono stati sondati ProIMs solubile ANK-strepII (ProSol), GST-MP, ma non non condensato GST, esposti vincolante (Figura 1B, corsie 1, 2, confrontare corsie 5, 6). Inoltre, quando lo stesso insieme di ProIMs sono stati sondati con un ProSOLnc non correlate, cioè, Arabidopsis chinasi NADH citoplasmatico tag strepII (NADH3-strepII), non vincolante, non è stato osservato, dimostrando ulteriormente la specificità del ANK-MP interazione (Figura 1B, corsie 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Legame specifico di tabacco ANK a TMV MP in vivo e in vitro. (A) ANK-MP interazione in vivo le cellule epidermiche tabacco come rilevato dal BiFC. Forte segnale YFP è stato ricostruito quando MP e ANK, fusa al C-terminale e N-terminale metà del YFP, rispettivamente, sono stati coespressi nell'epidermide tabacco seguenti microbombardment dei loro geni codifica. Questo segnale BiFC accumulata nel puncta alla periferia delle cellule, che sono diagnostici di plasmodesmi 15. (B) ANK-MP interazione in vitro, come rilevato dal test di sovrapposizione della membrana proteica. Estratti proteici contenenti 1 mg di GST-MP (ProIM) o non condensato GST (ProIMnc) sono stati risolti in un 15% di SDS-poliacrilammide gel, seguita da electrotransfer su una membrana di nitrocellulosa. Il GST-MPProIM e GSTProIMnc sono stati incubati con 0,5 mg / ml di ANK-strepII (ProSol), e ANK legame è stato rilevato dal sondaggio della membrana con anticorpi anti-strepII anticorpo policlonale di coniglio, seguita da anti-coniglio di anticorpi IgG + M secondario coniugato a HRP (corsie 1 e 2). Né GST-MPProIM né GSTProIMnc interagito con una proteina non correlate, Arabidopsis chinasi citoplasmatica NADH, fusa al tag strepII (ProSOLnc, corsie 3 e 4). L'identità della band osservato in questa analisi è stata confermata dal sondaggio la membrana con anticorpi anti-GST (corsie 5 e 6). Quando la membrana è stata trattata con tampone di denaturazione senza essere lavati con tampone A, il legame della GST-MP per ANK è perso, mentre le proteine ​​non identificate contenute nel GST-MP e gli estratti proteici GST contining reagito con ANK-strepII, dimostrando l'importanza del passo 3,1 prima del processo di denaturazione (corsie 7 e 8).

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<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo approccio è adatto per testare interazioni proteina-proteina tra le combinazioni di proteine, quando almeno uno dei quali le proteine ​​è facilmente solubile nel buffer vincolante, ed è stato applicato con successo ad altra combinazione di proteine ​​17,18. Il iInteractions tra le proteine ​​che sono sia insolubile in queste condizioni non possono essere testati da questo protocollo. Inoltre, il successo di ripiegamento ProIM è fondamentale per l&#39;analisi. Risciacquo del...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Proteine ​​test kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi cocktail </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Semi-secco western blotting SD electrotransfer sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> Anti-IgG di coniglio coniugato con perossidasi di rafano </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST coniglio anticorpo policlonale </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> Biotrace, NT nitrocellulosa membrana trasferimento </td><td> Pall scientifico </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon occidentale HRP substrato chemiluminescente </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

proteine ​​di membrana overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili in vitro</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Convalida interazioni tra proteine ​​diverse è fondamentale per l&#39;esame delle loro funzioni biologiche a livello molecolare. Ci sono diversi metodi, sia in vitro che in vivo, per valutare legame con le proteine, e almeno due metodi che integrano le carenze di ogni altro dovrebbe essere condotta di acquisire le conoscenze affidabili. Per un test in vivo, la complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC) saggio rappresenta l&#39;approccio più popolare e meno invasivo che permette di rilevare l&#39;interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule viventi, così come individuare la localizzazione intracellulare del 1,2 interagendo proteine. In questo saggio, non fluorescente metà N-e C-terminale della GFP o di sue varianti si fondono alle proteine ​​testate, e quando le due proteine ​​di fusione sono riuniti a causa delle interazioni delle proteine ​​testate &#39;, il segnale fluorescente viene ricostituito 3-6 . Perché il suo segnale è facilmente rilevabile mediante microscopia in epifluorescenza e confocale, BiFC è emersa come un potente strumento di scelta tra i biologi cellulari per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi 3. Questo test, tuttavia, possono a volte produrre risultati falsi positivi. Per esempio, il segnale fluorescente può essere ricostituito da due frammenti GFP disposte, per quanto 7 nm l&#39;una dall&#39;altra a causa di chiudere imballaggio in un piccolo vano subcellulare, piuttosto che a causa di interazioni specifiche 7. A causa di queste limitazioni, i risultati ottenuti dalle tecnologie di imaging cellulare dal vivo deve essere confermata da un approccio indipendente, basato su un principio diverso per rilevare le interazioni delle proteine. Co-immunoprecipitazione (Co-IP) o glutatione transferasi (GST) pull-down test rappresentano tali metodi alternativi che sono comunemente utilizzati per analizzare interazioni proteina-proteina in vitro. Tuttavia, iIn questi test, però, le proteine ​​testato deve essere facilmente solubile nel buffer che supportsused per la reazione di legame. Pertanto, le interazioni specifiche che coinvolgono una proteina insolubile che non può essere valutata da queste tecniche. Qui, ci illustrano il protocollo per il saggio sovrapposizione proteina di membrana vincolante, che aggira questa difficoltà. In questa tecnica, l&#39;interazione tra proteine ​​solubili e insolubili in modo attendibile testato perché una delle proteine ​​è immobilizzato su una matrice di membrana. Questo metodo, in combinazione con esperimenti in vivo, come BiFC, fornisce un approccio affidabile per studiare e caratterizzare le interazioni tra fedelmente proteine ​​solubili e insolubili. In questo articolo, vincolante tra virus del mosaico del tabacco (TMV) proteina movimento (MP), che esercita funzioni multiple durante virale cellula-cellula trasporto 8-14, e un impianto di Interactor recentemente identificato cellulari, tabacco ankyrin ripetuta contenenti proteine ​​(ANK ) 15, si dimostra con questa tecnica.

Test interazione proteina-proteina è indispensabile per la dissezione di funzionalità delle proteine. Qui, introdurre un<em&gt; In vitro</em&gt; Proteina-proteina saggio vincolante per sondare una membrana-proteina immobilizzato con una proteina solubile. Questa analisi fornisce un metodo affidabile per verificare l&#39;interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione.

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

La convalida delle interazioni tra diverse proteine è fondamentale per l'indagine delle loro funzioni biologiche a livello molecolare. Esistono diversi...

Test della proteina. L'interazione tra proteine è indispensabile per l'analisi della funzionalità proteica. Questo video presenta un saggio in vitro di legame tra proteine per verificare l'interazione tra una proteina di membrana immobilizzata e una proteina solubile.Prima di tutto, le proteine di fusione vengono clonate, espresse ed estratte. La proteina insolubile marcate viene immobilizzata su una membrana di nitrocellulosa e trattata per essere ripiegata nella sua conformazione nativa. Successivamente, la membrana viene sottoposta a sonda con proteine solubili marcate e viene eseguita una immunodot-blot per rilevare le proteine.Se le proteine marcate interagiscono, vengono catturate dalla proteina immobilizzata sulla membrana e il segnale derivante dal blot immunochemiluminescente sarà osservato. Pertanto, questo saggio fornisce un metodo affidabile per verificare l'interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di pull-down con GST, è che consente di valutare in modo affidabile il legame tra una proteina insolubile e una proteina solubile in vitro.Il primo passaggio di questa procedura consiste nel generare proteine marcate geneticamente per il rilevamento. Iniziare clonando la proteina che verrà immobilizzata sulla membrana. Tale proteina, indicata di seguito come pro Im (proteina immobilizzata), va inserita in un vettore di espressione che codifica per un marcatore di grandi dimensioni, come GST; il vettore di espressione vuoto, che codifica soltanto per il marcatore, verrà utilizzato come controllo negativo per la proteina immobilizzata ed è indicato come pro IM nc.Successivamente, clonare la proteina che verrà utilizzata come sonda solubile in un vettore di espressione, codificante un marcatore diverso come strep due. Questa verrà indicata come prosol per proteina solubile in quanto controllo negativo; clonare una proteina solubile di controllo negativo nello stesso vettore di espressione. Questa verrà indicata come Prosol NC per proteina solubile di controllo negativo.Successivamente, utilizzare un sistema di espressione proteica come *E. coli* o virus baculovirale per esprimere le proteine marcate; il sistema di espressione impiegato deve essere scelto attentamente in base alla necessità di modifiche post-traduzionali. Estrarre le proteine espresse dall'organismo di interesse. Per pro IM e pro I mnc Resus.Sospendere le cellule in buffer di caricamento per elettroforesi SDS-PAGE contenente un cocktail di inibitori della proteasi. Successivamente, far bollire le cellule per cinque minuti, quindi centrifugarle per rimuovere il precipitato ed estrarre Prosol e prosol NC. Utilizzare procedure standard. Il pro IMS può essere estratto in condizioni denaturanti poiché le proteine verranno ripiegate dopo essere state immobilizzate sulla membrana di nitrocellulosa.Tuttavia, il prosol dovrebbe essere estratto per ottenere una conformazione nativa, poiché verrà aggiunto al buffer di legame una volta che le proteine marcate sono state estratte. Determinare la concentrazione delle proteine ricombinanti utilizzando un metodo standard, come il kit per saggio proteico BioRad. Se per il saggio verrà utilizzato un estratto grezzo anziché una proteina purificata.Stimare la concentrazione della proteina di interesse mediante densitometria di scansione della banda corrispondente su un gel di poliacrilammide SDS colorato con kumasi, utilizzando concentrazioni note di BSA come riferimento. Quindi tracciare la curva standard in base alle intensità del segnale misurate mediante densitometria di scansione della BSA e calcolare la quantità di proteina contenuta nell'estratto grezzo.Il passo successivo della procedura consiste nell'immobilizzare pro Iam e pro IAM NC sulla membrana. Caricare un microgrammo, ciascuno, di estratti di pro Iam e pro IAM NC in duplicato su un gel di poliacrilammide SDS. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dalle lastre di vetro e posizionarlo in 100 millilitri di buffer di trasferimento, quindi incubare con agitazione delicata per 20 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, eseguire un'analisi mediante western blot per trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa; dopo il trasferimento, consentire alle proteine legate alla membrana di ripiegarsi. Posizionare la membrana in 15 millilitri di tampone A e incubare con agitazione delicata. Per rimuovere l'SDS residuo, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata.Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione la membrana dal buffer. Quindi posizionare la membrana in 25 millilitri di buffer di denaturazione. Incubare per due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata.Durante l'incubazione, la membrana di nitrocellulosa diventerà opaca. Successivamente, utilizzando pinzette, trasferire la membrana in 25 millilitri di TBS e incubare con agitazione delicata per cinque minuti. Durante questo passaggio, la membrana riprende il suo colore bianco originale.Successivamente, trasferire la membrana in 25 millilitri di tampone di legame. Incubare a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per tutta la notte. Successivamente, la proteina solubile verrà utilizzata per sonda la membrana alla ricerca della proteina immobilizzata.Per prima cosa, preparare i tamponi di ibridazione diluendo da uno a 10 microgrammi di prosol e prosol NC in provette separate contenenti 10 millilitri di tampone di legame fresco. Successivamente, trasferire il tampone in un sacchetto per ibridazione. Poi, tagliare la membrana in due strisce, entrambe contenenti pro IM e pro IAM nc.Queste membrane verranno collocate nel buffer di ibridazione. Trasferire ogni membrana nella soluzione di ibridazione prosol o prosol NC e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere le membrane dalle soluzioni di ibridazione e risciacquare tre volte per 15 minuti in TBS.Per visualizzare le interazioni proteina-proteina, bloccare la membrana con latte scremato al 2,5% in TBST per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare le membrane bloccate nella soluzione di anticorpo primario. In questo caso viene utilizzato l'anticorpo policlonale da coniglio anti-strep due.Incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata dopo l'incubazione. Risciacquare le membrane in 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, posizionare le membrane nella soluzione di anticorpo secondario coniugato con HRP. In questo caso, viene utilizzato un anticorpo anti IgG da coniglio coniugato con HRP.Incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Lavare le membrane con 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata come in precedenza; dopo l'ultimo risciacquo in TBS, visualizzare l'interazione proteina-proteina utilizzando un substrato chemiluminescente HRP da Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.Il substrato per la HRP viene utilizzato dopo il blotting immuno del prosol. Lavare la membrana con TBST per 15 minuti e quindi due volte per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, riutilizzare le membrane con l'anticorpo primario per il marcatore da pro.Incubare con l'anticorpo secondario appropriato. Visualizzare PRO I e pro Im NNC rilevando la chemiluminescenza per convalidare l'identità delle bande ottenute nel saggio di sovrapposizione su membrana proteica. L'interazione tra le proteine A e K e YFP e MP CYFP è stata valutata in cellule epidermiche di tabacco utilizzando il metodo descritto in questo video, come mostrato qui.Quando è stata valutata la complementazione della fluorescenza biomolecolare, è stato ricostruito un forte segnale YFP. Questo segnale BFC si è accumulato nei punti periferici della cellula, caratteristici del plasma de poiché MP è una proteina altamente insolubile. Quando espressa in batteri o in piante, è stato adottato il saggio di sovrapposizione della membrana proteica per convalidare questa interazione.Estratti proteici in vitro contenenti un microgrammo di GST MP o di GST non fuso sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS, seguita da trasferimento elettroforetico su membrana di nitrocellulosa. Quando questi profili proteici sono stati sottoposti a sonda con a nnk solubile strep due GST mp, solo il GST MP, e non il GST non fuso, ha mostrato capacità di legame. Inoltre, quando lo stesso insieme di profili proteici è stato sottoposto a sonda con una proteina non correlata, la chinasi del NADH citoplasmica di Arabidopsis etichettata con strep due, non è stato osservato alcun legame, dimostrando ulteriormente la specificità dell'interazione tra A NK MP. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rigenerare correttamente le proteine immobilizzate seguendo il protocollo presentato.

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