Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro

Test delle proteine. L'interazione proteica è indispensabile per la dissezione della funzionalità proteica. Questo video presenta un saggio in vitro di legame proteico-proteico per testare l'interazione tra una membrana e una proteina immobilizzata con una proteina solubile.

In primo luogo, le proteine di fusione vengono clonate, espresse ed estratte. La proteina insolubile marcata viene immobilizzata su una membrana di nitrocellulosa e trattata per essere ripiegata fino alla sua conferma nativa. La membrana viene quindi sondata con proteine solubili marcate e viene eseguito l'immunoblotting per rilevare le proteine.

Se le proteine marcate interagiscono, vengono catturate dalla proteina immobilizzata sulla membrana e si osserverà il segnale dell'immunoblotting. Pertanto, questo test fornisce un metodo affidabile per testare l'interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai vasi esistenti come il pull down GST, è che è possibile valutare in modo affidabile il legame tra proteina insolubile e proteina solubile in vitro.

Il primo passo di questa procedura consiste nel generare proteine geneticamente marcate per il rilevamento. Inizia clonando la proteina che verrà immobilizzata sulla membrana. Riferirsi qui come pro Im per proteina immobilizzata in un vettore di espressione, codificando un tag di grandi dimensioni come GST, il vettore di espressione vuoto, che codifica solo per il tag verrà utilizzato come un controllo negativo della proteina immobilizzata, ed è indicato come pro IM nc.

Successivamente, clonare la proteina che verrà utilizzata come sonda solubile in un vettore di espressione, codificando un tag diverso come streptococco due. Questo sarà indicato come prosol per proteina solubile come un controllo negativo, clone, una proteina solubile di controllo negativo nello stesso vettore di espressione. Questo sarà indicato come Prosol NC per il controllo negativo delle proteine solubili.

Successivamente, utilizzare un sistema di espressione proteica come un virus coli o balo per esprimere le proteine marcate che il sistema di espressione utilizzato dovrebbe essere scelto con cura in base alla necessità di modifiche post-traduzionali. Estrarre le proteine espresse dall'organismo di scelta. Per pro IM e pro I mnc Resus.

Sospendere le cellule nel tampone di caricamento della pagina SDS contenente il cocktail di inibitori della proteasi. Quindi far bollire le cellule per cinque minuti, quindi centrifugarle per rimuovere il precipitato per estrarre Prosol e prosol NC. Utilizzare le procedure standard. Il pro IMS può essere estratto in condizioni di denaturazione perché le proteine verranno ripiegate dopo essere state immobilizzate nella membrana di nitrocellulosa.

Tuttavia, il prosolo dovrebbe essere estratto per dare una conferma nativa perché verrà aggiunto al tampone di legame una volta che le proteine marcate sono state estratte. Determinare la concentrazione delle proteine ricombinanti utilizzando un metodo standard come il kit di analisi delle proteine BioRad. Se per il test verrà utilizzato estratto grezzo piuttosto che proteine purificate.

Stimare la concentrazione della proteina di interesse mediante densitometria a scansione della banda corrispondente su un gel di poliacrilammide SDS colorato con kumasi. Utilizzando come riferimento le concentrazioni note di BSA. Quindi tracciare la curva standard in base alle intensità del segnale misurate dalla densitometria a scansione del BSA e calcolare la quantità di proteina contenuta nell'estratto grezzo.

Il passo successivo della procedura consiste nell'immobilizzare pro Iam e pro IAM NC sulla membrana. Inizia caricando un microgrammo, ciascuno degli estratti pro Iam e pro IAM NC in duplicato su un gel di poliacrilammide SDS. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dalle piastre di vetro e metterlo in 100 millilitri di tampone di trasferimento, quindi incubare con leggera agitazione per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, eseguire un western blot per trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa dopo il trasferimento per consentire alle proteine legate alla membrana di ripiegarsi. Posizionare la membrana in 15 millilitri di tampone A e incubarla con leggera agitazione. Per rimuovere le SDS residue, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.

Dopo l'incubazione, rimuovere con cura la membrana dal tampone. Quindi posizionare la membrana in 25 millilitri di tampone di denaturazione. Incubare per due ore a temperatura ambiente con leggera agitazione.

Durante l'incubazione, la membrana di nitrocellulosa diventerà opaca. Successivamente, utilizzando una pinza, trasferire la membrana a 25 millilitri di TBS e incubare con leggera agitazione per cinque minuti. Durante questa fase, la membrana ritorna al suo colore bianco originale.

Quindi, trasferire la membrana in 25 millilitri di tampone legante. Incubare a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione per tutta la notte. Successivamente, la proteina solubile verrà utilizzata per sondare la membrana per la proteina immobilizzata.

Innanzitutto, preparare i tamponi di ibridazione, diluire da uno a 10 microgrammi di prosol e prosol NC in provette separate contenenti 10 millilitri di tampone legante fresco. Quindi trasferire il tampone in una sacca di ibridazione. Successivamente, tagliare la membrana in due strisce, entrambe contenenti pro IM e pro IAM nc.

Queste membrane saranno poste nel tampone di ibridazione. Trasferire ciascuna membrana nel prosol o nella soluzione di ibridazione prosol NC e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Rimuovere le membrane dalle soluzioni di ibridazione e risciacquare tre volte per 15 minuti in TBS.

Per visualizzare le interazioni proteina-proteina, bloccare la membrana con il 2,5% di latte scremato in TBST per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare le membrane ostruite nella soluzione di anticorpi primari. Qui viene utilizzato l'anticorpo policlonale di coniglio antis streptococco due.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione dopo l'incubazione. Sciacquare le membrane in 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Quindi posizionare le membrane nella soluzione di anticorpi secondari coniugati HRP Qui, viene utilizzato un anticorpo IgG anti coniglio coniugato a HRP.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente con leggera agitazione. Sciacquare le membrane in 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione come prima, dopo il risciacquo finale in TBS, visualizzare l'interazione proteina-proteina utilizzando un substrato chemiluminescente HRP Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescente.

Il substrato HRP viene utilizzato dopo l'immunoblotting del prosolo. Sciacquare la membrana e il TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi risonare le membrane con l'anticorpo primario per il tag a pro.

Im seguito dall'anticorpo secondario appropriato. Visualizzare PRO I e pro Im NNC rilevando la chemiluminescenza per convalidare l'identità delle bande ottenute nel saggio di overlay della membrana proteica. L'interazione tra le proteine A e K e YFP e MP CYFP è stata valutata in cellule epidermiche di tabacco utilizzando il metodo descritto in questo video, come mostrato qui.

Quando è stata valutata la complementazione a fluorescenza biomolecolare, è stato ricostruito un forte segnale YFP. Questo segnale BFC si è accumulato in Punta alla periferia della cellula, che sono diagnostici di plasma de perché MP è una proteina altamente insolubile. Quando espresso nei batteri o nelle piante, il saggio di sovrapposizione della membrana proteica è stato adottato per convalidare questa interazione.

Gli estratti proteici in vitro contenenti un microgrammo di GST MP o GST non fuso sono stati risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS seguita da elettrotrasferimento su una membrana di nitrocellulosa. Quando questi pro iam sono stati sondati con uno streptococco nnk solubile due GST mp, ma non non non fusi, la GST ha mostrato un legame. Inoltre, quando lo stesso set di pro IMS è stato sondato con un pro saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH chinasi marcato strep two, non è stato osservato alcun legame dimostrando ulteriormente la specificità dell'interazione A NK MP Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di riempire correttamente le proteine immobilizzate seguendo il protocollo presentato.