Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Per rilevare e isolare una coppia di specifiche proteine interagenti utilizzando la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, aggiungere una coppia di miscele di plasmidi di complementazione bimolecolare a fluorescenza-agente di trasfezione in una piastra di coltura contenente cellule di mammifero.

Un plasmide codifica una proteina interagente – la proteina esca – fusa in un frammento di proteina fluorescente reporter. L'altro plasmide codifica per l'altra proteina legante – la proteina preda – fusa al frammento complementare della proteina fluorescente.

incubare. L'agente di trasfezione facilita l'assorbimento cellulare del plasmide. Le cellule trasfettate con successo esprimono proteine localizzate nella membrana cellulare.

Le interazioni tra le proteine esca e preda avvicinano i frammenti proteici fluorescenti. Questo fa sì che i frammenti si fondano e si ripieghino, formando la proteina fluorescente funzionale, la cui fluorescenza può essere visualizzata al microscopio a fluorescenza.

Sostituire il terreno con un tampone di lisi contenente detergente non ionico per distruggere le membrane cellulari, rilasciando le proteine di fusione. Raccogliere il lisato c