Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Per rilevare e isolare una coppia di specifiche proteine interagenti utilizzando la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, aggiungere una coppia di miscele di plasmidi di complementazione bimolecolare a fluorescenza-agente di trasfezione in una piastra di coltura contenente cellule di mammifero.

Un plasmide codifica una proteina interagente – la proteina esca – fusa in un frammento di proteina fluorescente reporter. L'altro plasmide codifica per l'altra proteina legante – la proteina preda – fusa al frammento complementare della proteina fluorescente.

incubare. L'agente di trasfezione facilita l'assorbimento cellulare del plasmide. Le cellule trasfettate con successo esprimono proteine localizzate nella membrana cellulare.

Le interazioni tra le proteine esca e preda avvicinano i frammenti proteici fluorescenti. Questo fa sì che i frammenti si fondano e si ripieghino, formando la proteina fluorescente funzionale, la cui fluorescenza può essere visualizzata al microscopio a fluorescenza.

Sostituire il terreno con un tampone di lisi contenente detergente non ionico per distruggere le membrane cellulari, rilasciando le proteine di fusione. Raccogliere il lisato cellulare in una provetta. Centrifuga.

Trasferire il surnatante contenente proteine di fusione in una provetta nuova. Aggiungere perle di agarosio coniugate con l'anticorpo fluorescente a dominio singolo mirato alla proteina, nanobody, che riconosce e si lega a un epitopo tridimensionale sulla proteina fluorescente ripiegata.

centrifuga. Risospendere le perle di agarosio legate alla proteina di fusione in un tampone. Calore per dissociare le proteine di fusione dalle perle di agarosio. Eseguire SDS-PAGE per separare le singole proteine, seguito da western blotting con anticorpi specifici per i frammenti proteici fluorescenti.

Vengono rilevate solo proteine interagenti marcate con frammenti fluorescenti, confermando il loro isolamento.

Innanzitutto, semina HEK293T cellule in piatti di 10 centimetri contenenti 10 millilitri di DMEM. Quindi, diluire 2,5 microgrammi di ciascun vettore di complementazione di fluorescenza bimolecolare in 500 microlitri di tampone di trasfezione.

Aggiungere 10 microlitri di reagente di trasfezione e agitare la miscela per 10 secondi. Quindi, centrifugare brevemente i campioni e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, aggiungi la miscela di trasfezione del DNA goccia a goccia nel piatto. Quindi, incubare i campioni per 8-24 ore.

Preparare il tampone di lisi cellulare e il tampone di lisi cellulare integrato come indicato nel protocollo di testo. Quindi, lavare due volte le celle con PBS ghiacciato. Aspirare il PBS e aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi cellulare integrato con ghiaccio freddo.

Quindi, metti il piatto sul ghiaccio e incuba per cinque minuti. Quindi, utilizzare un raschietto per rimuovere le cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga refrigerata. Centrifugare la provetta a 18.000 volte la gravità per cinque minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, trasferire il surnatante trasparente in una nuova provetta da microcentrifuga.

Lavare un volume appropriato di perle di agarosio in 1 millilitro di PBS. Quindi, centrifugare le perle a 300 volte la gravità e rimuovere con cura il surnatante. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di perle di agarosio a ciascun campione e incubare a 4 gradi Celsius per due ore con rotazione end-to-end.

Centrifugare le perle a 300 volte la gravità e lavarle tre volte nel tampone di lisi cellulare. Quindi, risospendere le perle lavate in 50 microlitri di tampone per campioni diluito. Infine, riscalda i campioni a 95 gradi Celsius per due o tre minuti.