Imaging in immunofluorescenza a montaggio intero: una tecnica di fissazione e colorazione per valutare organoidi intatti

Gli organoidi prostatici costituiscono principalmente uno strato esterno di cellule epiteliali basali e strati interni di cellule epiteliali luminali disposte attorno a un lume centrale.

L'imaging a montaggio intero consente lo studio di organoidi 3D intatti mantenendone la morfologia e l'eterogeneità. Per iniziare la colorazione, trattare gli organoidi con un fissativo adatto per bloccare i loro componenti cellulari in posizione, preservandoli. Lavare il campione per rimuovere i fissativi in eccesso.

Incubare con un cocktail di soluzione bloccante e colorante per la colorazione del DNA. Le proteine nella soluzione bloccante si legano passivamente a siti non specifici delle cellule e riducono qualsiasi colorazione di fondo. Allo stesso tempo, il colorante che colora il DNA colora i nuclei delle cellule.

Aggiungere due serie di anticorpi primari mirati ad antigeni specifici espressi dalle due popolazioni cellulari costituenti. Incubare con due diversi anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente che si legano agli anticorpi primari. Lavare il campione per rimuovere eventuali anticorpi non legati.

Immergere gli organoidi colorati in sequenza in concentrazioni crescenti di soluzioni di zucchero contenenti tensioattivi per migliorare la trasparenza dei tessuti senza compromettere l'architettura dell'organoide. Questo trattamento migliora la profondità di imaging del campione.

Monta gli organoidi su un vetrino da microscopio che porta distanziatori per preservarne la morfologia 3D durante l'imaging. Utilizzare un microscopio confocale per osservare le emissioni di fluorescenza dalle popolazioni di cellule basali e luminali disposte attorno al lume centrale.

Per eseguire la colorazione in immunofluorescenza a montaggio intero degli organoidi prostatici, in primo luogo, aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare gli organoidi per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente. Dopo aver lavato il pellet come descritto nel protocollo di testo, aggiungere 1 microgrammo per millilitro di colorante DAPI in soluzione bloccante e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Proteggere il campione dalla luce durante l'incubazione da questo passaggio in avanti. Dopo la centrifugazione degli organoidi come in precedenza, aggiungere l'anticorpo primario e la soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 gradi Celsius agitando delicatamente.

Pellettare nuovamente gli organoidi e lavare il pellet con 1 millilitro di PBS per 15 minuti agitando delicatamente. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. Quindi, aggiungere l'anticorpo secondario e la soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 gradi Celsius agitando delicatamente. Dopo l'incubazione, pellettare gli organoidi e lavare il pellet per altre due volte. Aggiungere 1 millilitro di saccarosio al 30% in PBS con Triton X-100 all'1% agli organoidi pellettati. Quindi, incubare per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Dopo aver pellettato nuovamente gli organoidi, aggiungere 1 millilitro di saccarosio al 45% in PBS con Triton X-100 all'1% e agitare delicatamente per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi, ripetere la procedura tranne aggiungere 1 millilitro di saccarosio al 60% in PBS con Triton X-100 all'1%. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il 95% del surnatante. Osservare il pellet sotto la luce UV per confermare che non sia andato perso durante la rimozione del surnatante. Il pellet si allenta man mano che la concentrazione di saccarosio aumenta. Trasferire da 10 a 20 microlitri della sospensione rimanente in un vetrino coprioggetti a camera e procedere alla microscopia confocale.