Screening della morte cellulare mediante colorazione DAPI: un metodo per lo screening rapido della morte cellulare clonogenica indotta da IR in linee cellulari cancerose

L'esposizione a radiazioni ionizzanti come i raggi X può causare danni al DNA, portando infine alla morte cellulare. Per esaminare l'effetto delle radiazioni ionizzanti sui profili di morte cellulare, iniziare prendendo una piastra di coltura contenente cellule tumorali aderenti posizionate sulla superficie di un vetrino coprioggetti.

Irradiare la piastra di coltura con raggi X per la durata desiderata. Questo trattamento provoca danni al DNA all'interno delle cellule. Quindi, aspirare il terreno esaurito dal piatto di coltura e aggiungere un fissativo adatto. Questa soluzione permea le cellule e blocca i componenti cellulari in posizione durante le successive fasi di colorazione.

Scartare la soluzione fissativa. Rimuovere il vetrino coprioggetti contenente le cellule trattate con raggi X dal piatto di coltura. Capovolgere il vetrino coprioggetti e posizionarlo sulla superficie di un vetrino con sopra una goccia di colorante DAPI in modo che le cellule siano a diretto contatto con il DAPI.

Le molecole DAPI entrano nei nuclei e si legano ai siti ricchi di A e T del DNA. Ora, visualizza le cellule sotto un microscopio a fluorescenza. I nuclei appaiono blu e mostrano morfologie distinte.

Le cellule che mostrano nuclei condensati e frammentati sono indicative di apoptosi, morte cellulare programmata. Altri che mostrano nuclei a più lobi rappresentano che le cellule stanno vivendo una catastrofe mitotica. Quelli con nuclei appiattiti che mostrano più punti luminosi sono indicativi di cellule in senescenza.

Prelevare le cellule dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura dalla piastra di coltura. Tagliare la punta di una micropipetta da 1.000 microlitri a circa 5 millimetri dall'estremità usando le forbici e usarla per aggiungere 1 millilitro di soluzione di fissazione al piatto di coltura.

Applicare la soluzione di fissazione lungo le pareti del piatto di coltura per ridurre al minimo i danni alle cellule. Quindi, trasferisci questo piatto di coltura in un piatto di coltura quadrato e agitalo delicatamente per distribuire uniformemente la soluzione di fissazione sul vetrino coprioggetti. Successivamente, incubare il piatto per 10 minuti a temperatura ambiente.

Aspirare la soluzione di fissaggio dal piatto. Ora, aggiungi 2 millilitri di PBS lungo le pareti del piatto e poi aspira il PBS. Per prepararsi alla colorazione DAPI, aggiungere 5 microlitri di reagente per colorazione DAPI su un vetrino. Quindi, rimuovere il vetrino coprioggetti dal piatto utilizzando un bisturi e scolare il PBS in eccesso sul vetrino coprioggetti toccando il bordo del vetrino coprioggetti con un tovagliolo di carta.

A questo punto, montare il vetrino coprioggetti capovolto sulla goccia di reagente colorante DAPI sul vetrino in modo che le cellule siano esposte al reagente colorante DAPI. Infine, esaminare le cellule colorate con un microscopio a fluorescenza dotato di filtro DAPI.