Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell'espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto del knockdown di ACF uno o SNF due H sulla morte cellulare indotta da E quattro o quattro. Ciò si ottiene mediante la generazione di linee cellulari in cui l'espressione dello srna H ACF uno o SNF due è attivata condizionatamente dall'aggiunta di doxiciclina, con conseguente riduzione dei livelli di proteina H ACF uno o SNF due come secondo passaggio. Le cellule delle linee cellulari ottenute vengono trattate con doxiciclina per ridurre l'espressione di ACF uno o SNF due H o non vengono trattate.

Successivamente, E quattro o quattro è espresso nelle cellule con o senza S-H-R-N-A resistente ACF uno o SNF due H.In al fine di studiare l'effetto di ACF uno o SNF due H su E si ottengono risultati di morte cellulare indotta quattro o quattro che mostrano l'impatto di ACF uno o SNF due livelli di H su E quattro o quattro tossicità basati sul conteggio del nucleo con morfologia apoptotica utilizzando il saggio JY. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la trasfezione transitoria degli RNA, è che tutte le cellule esprimono il S-H-R-N-A e la percentuale di cellule che co-esprimono insieme al plasmide tradizionale è più alta. Questo metodo fornisce informazioni sui meccanismi alla base della morte cellulare indotta dal 4 0 4, ma può anche essere applicato allo studio di altre proteine protiche.

Oltre ad Ana Lafe, una ricercatrice del mio laboratorio dimostrerà parti di questa procedura: per iniziare la procedura per la generazione di linee cellulari inducibili, piastra T-Rex 2, 9, 3 cellule a una densità di circa cinque volte 10 alle sei cellule per 10 centimetri, piastra in otto millilitri di DMEM contenente siero senza tetraciclina e con cinque microgrammi millilitro di blaster da parte, incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Sostituire il terreno con otto millilitri di terreno fresco prima della trasfezione. Il plasmide per la trasfezione è il plasmide P superiore neo plus GFP codificante ACF uno o SNF due H-S-H-R-N-A, guidato da un promotore H uno inducibile dalla tetraciclina, così come il gene di resistenza alla neomicina fuso con la GFP e guidato da un promotore costitutivo di PGK.

Aggiungere 10 microgrammi di DNA plasmidico a 500 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari e vortex. Quindi aggiungere il reagente jet PY a due microlitri per microgrammo di DNA in un'altra provetta con 500 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari e vortex. Aggiungere la soluzione di jet pie al DNA e mescolare bene a vortici.

Incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, pipettare delicatamente i complessi di DNA sulle piastre da 10 centimetri contenenti il 70-80% di confluenza. T-Rex 2 9 3 celle una miscela il giorno successivo.

In questo esempio DMEM, sostituire il mezzo con un mezzo selettivo come in precedenza, contenente 500 microgrammi per millilitro di G quattro 18. Per le prossime due settimane, monitorare le cellule. Sostituisci il terreno selettivo con un terreno fresco simile ogni tre o quattro giorni fino alla comparsa delle colonie.

Identifica le colonie a occhio e segna la loro posizione nella parte inferiore della piastra usando un pennarello colorato. Verificare al microscopio che le colonie siano ben separate. Le colonie possono essere isolate una volta che sono abbastanza grandi da essere visualizzate senza un microscopio.

Per il successo di questa procedura, è importante scegliere colonie ben separate durante l'isolamento della colonia. In una cappa sterile, aspirare il terreno dalla piastra. Risciacquare delicatamente con PBS e aspirare bene tutto il liquido rimasto.

Aggiungere tre microlitri di viaggi allo 0,25% in EDTA a una colonia sulla piastra accarezzando ripetutamente i viaggi fino a quando le cellule non si staccano dalla piastra. Trasferire le cellule in un pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Ripeti l'operazione per diverse altre colonie sul piatto.

Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica fino a riempire il pozzo. Quindi dividere le cellule di ciascuna colonia originale in tre pozzetti, ciascuno in una piastra separata da 12 pozzetti, e incubare durante la notte del giorno successivo. Sostituire il terreno in una piastra con un terreno contenente un microgrammo per millilitro di doxiciclina da una soluzione madre preparata in acqua distillata doppia.

Sostituire il terreno in una piastra di controllo con un terreno senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 72 ore. Le cellule di un pozzetto trattato e di uno non trattato vengono quindi raccolte per l'analisi del western blot per determinare l'efficienza di ACF uno o SNF due H abbattuti, un risultato rappresentativo è mostrato qui.

Questo blot è stato colorato con anticorpi contro SNF due H e alfa tubulina. Quest'ultimo serve come controllo di caricamento di due dei cloni. Il numero quattro e il numero cinque hanno mostrato una forte riduzione di SNF due H dopo l'induzione della doxiciclina e sono quindi stati scelti per l'uso nell'esperimento di knockdown, che sarà dimostrato nel prossimo segmento.

Le cellule non trattate nella terza piastra saranno utilizzate per espandere la linea cellulare selezionata e le aliquote di tali cellule saranno successivamente congelate. Per un ulteriore utilizzo per indurre l'abbattimento di cellule per piastre ACF uno o SNF due H in terreno selettivo in piastre da 10 centimetri, aggiungere doxiciclina a un microgrammo per millilitro a metà delle piastre e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48-72 ore. Ogni gruppo di piastre deve fornire le celle per 12 piastre da sei centimetri, inclusi due duplicati per il test DPI per ogni punto, nonché una piastra per l'analisi del western blot di ciascun campione.

Da 48 a 72 ore dopo l'induzione, la tripsina naso le cellule di ciascun gruppo di cellule e, dopo averle contate, lastra 1,5 volte 10 per la piastra di sei cellule per sei centimetri nello stesso mezzo con o senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte del giorno successivo, trasfettare le cellule. Come indicato.

Sia le cellule non trattate che quelle trattate con doxiciclina vengono trasfettate in triplicato in quattro modi. Uno con un plasmide vuoto e un plasmide che esprime GFP, due con il plasmide vuoto, così come un vettore che esprime SHRA resistente, ACF, uno GFP o SNF, due HGFP, tre con un plasmide codificante E, quattro o quattro e un plasmide che esprime GFP, e con il plasmide che codifica E, quattro, tutti e quattro. E il vettore che esprime SHRA resistente ACF uno GFP o SNF due HGFP dopo la trasfezione incuba tutte le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte.

Il giorno successivo alla trasfezione delle cellule, estrarre le proteine da una piastra per campione per l'analisi Western blot per determinare che ACF uno o SNF due H sono stati abbattuti in modo efficiente e che E quattro o quattro sono stati espressi in modo uniforme nei diversi campioni. Le restanti 16 piastre saranno utilizzate per il test DPI. Aspirare il terreno dalle piastre destinate al test DPI e lavare delicatamente le cellule con PBS in una cappa chimica.

Aggiungere un millilitro di para formaldeide al 4% preparata in PBS per coprire le cellule, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Aspirare la para formaldeide e lavare con PBS agitando a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi dopo il terzo lavaggio PBS all'80% di etanolo mantenuto a meno 20 gradi Celsius e incubare a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora.

Aspirare l'etanolo e lavare le cellule due volte con PBS, agitando a temperatura ambiente per cinque minuti ogni volta, dopodiché, lavare una volta per cinque minuti a temperatura ambiente con PBS contenente lo 0,5% di BSA e lo 0,05% tra 20 o P-B-S-B-T. Anche con agitazione per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Bloccare le cellule in un millilitro di tampone P-B-S-B-T contenente il 10% di siero di capra per 20 minuti agitando a temperatura ambiente.

Quindi lavare le celle due volte in P-B-S-B-T cinque minuti per ogni lavaggio. Incubare le cellule con l'anticorpo primario, un anticorpo specifico E, quattro o quattro, in questo caso in un millilitro di P-B-S-B-T per un'ora, agitando a temperatura ambiente. Quindi lavare due volte in P-B-S-B-T e una volta in PBS contenente lo 0,1% di BSA per cinque minuti ogni lavaggio.

Successivamente, aggiungere alle cellule un millilitro di PBS 0,1% BSA contenente l'anticorpo secondario marcato in fluorescenza appropriato e 0,5 microgrammi per millilitro. Concentrazione finale di DPI: incubare per 40 minuti agitando a temperatura ambiente al buio. Infine, lavare con PBS per cinque minuti.

Asciugare il pozzetto mediante aspirazione e tenere le piastre capovolte per un'altra ora o durante la notte per ottenere un'asciugatura completa e coprire con un foglio di alluminio le guide di copertura sulle celle utilizzando la soluzione flora Mount G. Tenete i piatti a quattro gradi Celsius al buio fino al momento di contare. Le cellule dei nuclei apoptotici che hanno subito i vari trattamenti descritti nel protocollo sono state fissate e colorate con E, quattro o quattro anticorpi specifici e DPI per visualizzare i nuclei delle cellule trasfettate.

Questa figura mostra un esempio di cellule che esprimono E quattro o quattro e il pannello GFP A mostra solo l'espressione della proteina GFP di controllo, e il pannello B mostra E quattro o quattro nuclei di colorazione DAPI di espressione sono mostrati nel pannello C e le immagini unite sono mostrate nel pannello D.Le frecce bianche contrassegnano, GFP ed E.Quattro o quattro cellule trasfettate contenenti nuclei con morfologia apoptotica. Le frecce rosse contrassegnano i nuclei con forme irregolari che non vengono conteggiati come nuclei apoptotici, l'asterisco contrassegna i nuclei mitotici o i nuclei che hanno appena diviso il numero di nuclei condensati o frammentati visualizzati da DAPI. La colorazione è stata contata per calcolare la percentuale di nuclei con morfologia apoptotica all'interno della popolazione cellulare trasfettata per mantenere l'obiettività ottimale del test.

Il conteggio del nucleo apoptotico nei vari campioni è stato eseguito in modo cieco in cui la persona che contava non era a conoscenza dell'identità del campione. Percentuali più elevate di anomalie nucleari sono state osservate nelle cellule E quattro o quattro che esprimono la conferma che T quattro o quattro induce la morte cellulare. La più alta percentuale di anomalie nucleari è stata osservata nelle cellule E quattro o quattro che esprimono cellule in cui i livelli di ACF uno sono stati ridotti da SHR e un knockdown mediato indica che ACF one knockdown aumenta E quattro o quattro La morte delle cellule Inge ha aumentato la tossicità di E quattro o quattro nelle cellule.

L'espressione di bassi livelli di ACF 1 non è il risultato di un aumento di E quattro o quattro livelli come si è visto nel Western blot. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di facilitare un conteggio consigliato dello stent del nucleo apoptotico con DPI e di applicare criteri rigorosi per l'identificazione di questo nucleo. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi clongenici, per convalidare i risultati del DA pse Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come i saggi di coimmunoprecipitazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, se esiste un'interazione fisica tra le proteine studiate.