Name: Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla In Situ Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Impara a rilevare aberrazioni cromosomiche stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati usando mFISH e SKY. Questa tecnica consente la visualizzazione guidata dei danni genetici indotti dalle radiazioni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è stato sostenuto da Arkansas spazio di Grant Consortium and Space Biomedical Istituto Nazionale di Ricerca attraverso National Aeronautics and Space Administration, concede NNX15AK32A (RP) e RE03701 (MH-J), e P20 GM109005 (MH-J), e gli Stati Uniti Veterans Administration ( MH-J). Ringraziamo Christopher Fettes, Coordinatore del Programma per il Dipartimento di Ambiente e Salute del Lavoro presso l&#39;Università di Arkansas per le scienze mediche, per l&#39;assistenza editoriale in preparazione del manoscritto.

Tutti gli studi sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo animale è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali della University of Arkansas per le scienze mediche. Tutti gli animali sono stati alloggiati sotto stabulario di aria condizionata di serie a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 cicli orarie di aria fresca e di libero accesso al cibo roditori standard ed acqua. All&#39;arrivo, i topi sono stati tenuti in quarantena per 1 settimana e fornito certificato Chow roditore. 1.Radiation esposizione e in vivo Arresto di cellule in metafase <ol><li> Esporre i topi non-anestetizzato a 2 Gy di radiazione di tutto il corpo in una camera di irradiazione. Durante l&#39;irradiazione, luogo topi in una camera di contenimento ben ventilata per assicurarsi che essi non si muovono liberamente e ricevono una dose uniforme. </li><li> Iniettare 100 ml di soluzione di colchicina 0,05% (cPolvere olchicine sciolto in calcio e magnesio libero PBS) per via intraperitoneale con un ago da 25 G allegato con 1 ml siringa monouso. Evitare l&#39;iniezione direttamente in qualsiasi organo. </li><li> Lasciare l&#39;animale nella gabbia per 2 h prima della raccolta di cellule di midollo osseo. Osservare l&#39;animale per eventuali segni di dolore o disagio. </li></ol> 2. midollo osseo cellule Raccolta e Isolamento di cellule del midollo osseo mononucleate dal gradiente di densità centrifugazione <ol><li> Eutanasia il mouse da CO 2 asfissia. </li><li> Spray etanolo al 70% sul dorsale e lato ventrale. </li><li> Effettuare una incisione 2 centimetri sulla cute addominale con forbici affilate. Afferrare la pelle su entrambi i lati dell&#39;incisione con pinzetta smussata e tirare delicatamente aprire i muscoli addominali. </li><li> Tagliare entrambe le zampe posteriori con le forbici e subito metterli in pre-refrigerata PBS con il 4% FBS. </li><li> Pulire accuratamente tutti i muscoli collegati al arto posteriore con un forte lametta e garza di cotone benda. </li><li> Separare la tibia dal femore. Tagliare entrambe le punte di ogni osso con una lametta. </li><li> Lavare il contenuto del midollo osseo con 3 ml di PBS (con 4% FBS) usando un ago 23 G attaccato ad una siringa da 3 mL e raccogliere il contenuto in una provetta da centrifuga 15. Passare la sospensione cellulare almeno 10 volte attraverso l&#39;ago per fare una sospensione di cellule singole. </li><li> sovrapporre cautela la sospensione cellulare in un uguale volume di mezzo di separazione dei linfociti (3 mL) senza disturbare l&#39;interfaccia tra la sospensione cellulare e mezzo di separazione dei linfociti. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere accuratamente il buffy coat senza disturbare gli altri livelli e il trasferimento in una nuova 15 mL provetta. </li></ol> 3. Preparazione del Metaphase spread cellulari <ol><li> Aggiungere 10 ml di PBS per il tubo contenente il buffy coat. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> rimuovere con attenzione il surnatante. Poi rompere tegli cella pellet con lievi colpetti e aggiungere 10 ml di PBS. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare, rompere il pellet, e aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio 0,075 M ipotonici pre-riscaldato. Aggiungere ipotonica goccia a goccia soluzione agitando delicatamente costante. </li><li> Incubare le cellule per 20 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 mL) di fissativo (metanolo: acido acetico glaciale, 3: 1 v / v) nel tubo 15 mL e mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. </li><li> Suddividere il pellet cellulare con intercettazioni seguito da dolce vortex per alcuni secondi e aggiungere 3 ml di fissativo goccia a goccia soluzione con costante agitazione. </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 400 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con gentLe intercettazioni, e aggiungere 3 ml di fissativo fresco. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. Suddividere il pellet cellulare con dolce intercettazioni, e aggiungere fresco 3 ml di fissativo. </li><li> Ripetere il punto 3.12 altre due volte. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere 400 a 600 microlitri fissativo e miscelare bene con pipettaggio. </li><li> Calo del 30 microlitri cellule fissate su vetrini pre-puliti e bagnati inclinato ad un angolo di 45 ° e consentire le diapositive asciugare completamente durante la notte. </li></ol> 4. topo cromosoma Dipinto di mFISH <ol><li> cromosoma denaturazione <ol><li> Posizionare la diapositiva contenente spread cellulari metafase in 2x SSC per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Disidratare il vetrino mediante lavaggio etanolo seriale per 2 minuti ogni a 70%, 80% e 100%. Incubare per 60 min a 65 ° C. </li><li> Preriscaldare 40 ml soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min. Denaturare cromosomi incubando il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1-1,5 min. </li><li> Quench scorrere immediatamente ghiacciata etanolo al 70% per 2 minuti per fermare il processo di denaturazione, nonché per prevenire i cromosomi denaturati da re-ricottura. Poi disidratano mediante lavaggio con etanolo 80% per 2 min. Ripetere il lavaggio con etanolo 100% di etanolo per 2 min. Completamente asciugare il vetrino a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Denaturazione e ibridazione di sonda Miscela <ol><li> centrifugare brevemente la miscela di sonda in dotazione dal costruttore, trasferire 10 ml di miscela della sonda in un 500 microlitri scatto provetta tappo, e denaturate mediante incubazione a 80 ° C (± 2 ° C) in un bagno d&#39;acqua per 7 min. </li><li> Posizionare il tubo da centrifuga con miscela di sonda in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 10 min. </li><li> Applicare la miscela sonda denaturata sul vetrino con chromoso denaturatomes. </li><li> coprire con cura la zona con una x 18 mm copertura in vetro antiscivolo 18 mm e di eliminare eventuali bolle d&#39;aria visibili premendo molto delicatamente il vetrino a scivolare. Sigillare tutti i quattro lati del vetrino con cemento di gomma e incubare per 12 ore a 16 h al buio a 37 ° C in una camera umidificata per l&#39;ibridazione. </li></ol></li><li> Messaggio ibridazione di lavaggio e di rilevamento <ol><li> Rimuovere con cura il mastice e la polizza di copertura. </li><li> Porre il vetrino in pre-riscaldato 0.4x SSC a 74 ° C (± 2 ° C) per 5 min. </li><li> Lavare il vetrino in soluzione di lavaggio II (4x SSC / 0.1% Tween-20) per 2 min. </li><li> Mettere 20 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio con DAPI di contrasto (1,5 mg / ml) e coprire con un coprioggetto di vetro. Premere delicatamente sul vetrino con il tessuto di laboratorio per rimuovere le bolle d&#39;aria e soluzione di montaggio in eccesso. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto. </li><li> Vedi diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati. </li></ol></li&gt; </ol> 5. spettrale cariotipo (SKY) del mouse cromosomi <ol><li> Cromosoma e denaturazione della sonda <ol><li> Equilibrare diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per 2 minuti, senza agitare. </li><li> Disidratare presentazione in un serie di etanolo (70%, 80% e 100% etanolo) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Far asciugare il vetrino per rimuovere completamente l&#39;etanolo. </li><li> Warm 40 mL di soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min. </li><li> Incubare il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1 a 1,5 min. </li><li> immergere immediatamente il vetrino in ghiacciata etanolo al 70% per 2 min per arrestare il processo di denaturazione e per evitare che i cromosomi denaturati da re-ricottura. </li><li> Disidratare il vetrino mettendolo in 80% etanolo per 2 minuti e poi in 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Denaturare la sonda SKY (vial # 1 fornito dal produttore) in un bagnomaria regolato a 80 ° C (± 2 ° C)per 7 minuti, e poi immediatamente posto in una diversa bagnomaria a 37 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> sonda ibridazione <ol><li> Aggiungere 10 ml di sonda SKY denaturato sui cromosomi denaturati. </li><li> Posizionare con cura un vetrino di vetro 18 millimetri x 18 mm sulla sonda SKY in modo che non bolle d&#39;aria intrappolate sotto il vetrino. </li><li> Sigillare i bordi del vetrino con mastice. </li><li> Posizionare il vetrino in una camera a tenuta di luce umidificata e incubare al buio a 37 ° C per 24 ore a 36 h. </li></ol></li><li> Post-ibridazione Lavaggio e rivelazione a fluorescenza <ol><li> Rimuovere il cemento di gomma con molta attenzione senza disturbare il vetrino. </li><li> Posizionare la diapositiva in pre-riscaldato soluzione di lavaggio rapido (0.4x SSC) a 72 ° C (± 2 ° C) per 5 minuti con costante agitazione. Immergere vetrino nella soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare per 1 min agitando. </li><li> Opzionale: Aggiungere 80 ml di reagente di bloccaggio(Fiala # 2 fornito dal produttore) sulla zona di ibridazione, posizionare 24 mm coprioggetto plastica x 60 mm, e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti in una camera umidificata. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino di plastica e lavare la slitta con pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III per 5 min. </li><li> Applicare 80 ml di Cy5 colorazione reagente (vial # 3 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata. </li><li> Immergere il vetrino in un barattolo di vetro Coplin contenente pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare a 45 ° C in un bagno d&#39;acqua per 2 minuti con agitazione. Ripetere questa operazione di lavaggio per 3 volte. </li><li> Applicare 80 ml di Cy5.5 colorazione reagente (vial # 4 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata. </li><li> Lavare il vetrino 3 volte con pre-riscaldato (45 ºC) soluzione di lavaggio III. </li><li> Tenere il vetrino in posizione inclinata contro un tovagliolo di carta per drenare i liquidi in eccesso. Aggiungere 20 ml anti-sbiadimento DAPI reagente (vial # 5 fornito dal produttore) e con attenzione inserire un vetrino di vetro 24 millimetri x 60 mm senza introdurre bolle d&#39;aria. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto e osservare con un microscopio a epifluorescenza dotato per catturare le immagini SKY. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kodama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+chromosome+aberrations+in+atomic+bomb+survivors%3A+results+from+25+years+of+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation.</a> Radiat Res. 156, 337-346 (2001).</li>
<li>Lucas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+signature+for+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic signature for ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).</li>
<li>Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+radiation-induced+aberrations+in+patients+with+Hodgkin%27s+disease.+Possible+correlation+with+second+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Boll.+Ist.+Sieroter.+Milan%22%5BJournal%5D)">Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy?</a> Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).</li>
<li>Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+and+limitations+of+chromosome+banding+in+pre-+and+postnatal+service+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics.</a> Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+chromosome+aberrations+persist+in+individuals+many+years+after+occupational+exposure+to+densely+ionizing+radiation%3A+an+mFISH+study%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study.</a> Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Hopman, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-color+detection+of+two+target+DNAs+by+non-radioactive+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization.</a> Histochemistry. 85, 1-4 (1986).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+fluorescence+in+situ+hybridization+for+the+simultaneous+detection+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences.</a> Cytometry. 10, 20-27 (1989).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Multiple fluorescence in situ hybridization.</a> Cytometry. 11, 126-131 (1990).</li>
<li>Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+spectral+karyotyping+%28SKY%29+in+biodosimetry+for+the+triage+situation+following+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation.</a> Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).</li>
<li>Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+analysis+by+the+FISH-painting+method+for+retrospective+dose+reconstruction+in+individuals+exposed+to+ionizing+radiation+10+years+after+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure.</a> Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+%27Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).</li>
<li>Bauchinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).</li>
<li>Hieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangements+in+post-Chernobyl+papillary+thyroid+carcinomas%3A+evaluation+by+spectral+karyotyping+and+automated+interphase+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH.</a> J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).</li>
<li>Cohen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+of+chromosome+rearrangements+in+two+cases+of+tMDS+with+a+complex+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype.</a> Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).</li>
<li>Pathak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vitamin+E+Analog+Gamma-Tocotrienol+%28GT3%29+Suppresses+Radiation-Induced+Cytogenetic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage.</a> Pharm Res. , (2016).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).</li>
<li>Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+improving+metaphase+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new method for improving metaphase chromosome spreading.</a> Cytometry A. 51, 46-51 (2003).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+exposure+to+densely+ionizing+radiation+leaves+a+unique+permanent+signature+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome.</a> Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).</li>
<li>Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+long-term+effects+of+ionizing+radiation+through+measurement+of+current+sister+chromatid+exchange+%28SCE%29+rates+in+radiology+technologists%2C+compared+with+previous+SCE+values%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values.</a> Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+chromosome+painting+using+the+peroxidase%2Fdiaminobenzidine+%28DAB%29+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction.</a> Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).</li>
<li>Kakazu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spectral+colour+banding+in+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis.</a> Lancet. 357, 529-530 (2001).</li>
<li>Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mFISH+analysis+of+chromosomal+damage+in+bone+marrow+cells+collected+from+CBA%2FCaJ+mice+following+whole+body+exposure+to+heavy+ions+%2856Fe+ions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Environ+Biophys%22%5BJournal%5D)">mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions).</a> Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).</li>
<li>Abrahams, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+FISHing+of+transgenic+mice+recommended%3A+FISH+and+SKY+define+BAC-mediated+balanced+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation.</a> Genesis. 36, 134-141 (2003).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+scoring+of+FISH-%26%2334%3Bpainted%26%2334%3B+chromosome-type+exchange+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the scoring of FISH-&#34;painted&#34; chromosome-type exchange aberrations.</a> Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+%22painting%22+patterns+resulting+from+complex+exchanges%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges.</a> Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).</li>
<li>Tucker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAINT%3A+a+proposed+nomenclature+for+structural+aberrations+detected+by+whole+chromosome+painting%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting.</a> Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).</li>
<li>Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-based+analysis+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+using+different+nomenclature+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems.</a> Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).</li>
<li>Lucas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li>
<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Diversi passaggi critici determinano il successo di mFISH e SKY. Il primo e più importante passo è quello di ottimizzare il trattamento colchicina per l&#39;arresto in vivo mitotico delle cellule mononucleate del midollo osseo. Il tempo di concentrazione di colchicina e il trattamento individualmente o in concerto determinare l&#39;indice mitotico e condensazione cromosomica-due importanti presupposti per un efficace pittura cromosoma. Un tempo di trattamento ad alta concentrazione di colchicina o più porta a c...

I due metodi più affidabili per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche indotte dalle radiazioni sono l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH), che consente la verniciatura di due o più cromosomi contemporaneamente, e il cariotipo spettrale (SKY), che conferisce un colore distinto a ciascuna coppia di cromosomi omologhi nel genoma. A differenza delle aberrazioni instabili, le aberrazioni stabili sono di natura persistente e possono essere propagate per diverse generazioni nelle popolazioni irradiate1, e sono considerate come "firme" molecolari critiche delle lesioni citogenetiche indotte da radiazioni2. Studi condotti da vari gruppi hanno dimostrato che le aberrazioni stabili sono associate alla patogenesi e allo sviluppo di una serie di malattie, tra cui il cancro3. Prima dell'era della pittura cromosomica (nota anche come citogenetica molecolare), la tecnica convenzionale del G-banding era l'unico metodo per rilevare aberrazioni cromosomiche stabili. Tuttavia, il banding cromosomico è una sfida per i citogenetisti perché la risoluzione è limitata, la riproducibilità è incerta, è una procedura laboriosa e richiede citogenetisti altamente qualificati ed esperti per un'interpretazione affidabile dei dati4. Inoltre, la tecnica classica del banding non consente di rilevare riarrangiamenti cromosomici complessi, che comportano l'interazione di tre o più rotture distribuite tra due o più cromosomi, esito comune del danno da radiazioni. Le aberrazioni complesse possono persistere negli individui molti anni dopo l'esposizione alle radiazioni, rendendole utili per la biodosimetria retrospettiva5. Pertanto, era necessario un approccio alternativo per superare i limiti delle tecniche convenzionali di banding per rilevare riarrangiamenti cromosomici stabili. 
Alla fine degli anni '60, il lavoro pionieristico di Gall e Pardue (1969) sull'ibridazione molecolare utilizzando sonde di acido nucleico marcate con materiale radioattivo ha dato inizio a una nuova era nel campo della citogenetica, che ha permesso il rilevamento di una specifica sequenza di DNA sui cromosomi6. Tuttavia, l'uso di sonde radioattive per l'ibridazione molecolare presentava diversi inconvenienti: le sonde radioattive sono relativamente instabili, l'attività della sonda dipende dal decadimento radioattivo dell'isotopo utilizzato, l'ibridazione richiede un tempo più lungo, la risoluzione è limitata, le sonde sono relativamente costose e i materiali radioattivi sono pericolosi per la salute. Pertanto, si rese necessario sviluppare e progettare sonde non radioattive. L'introduzione di sonde di acido nucleico marcate in fluorescenza negli anni '80 e '90 ha superato i limiti delle sonde radioattive e ha notevolmente migliorato la sicurezza, la sensibilità e la specificità della tecnica di ibridazione7-10. Le sonde fluorescenti danno origine a segnali estremamente luminosi quando osservate al microscopio a fluorescenza dotato di appropriati filtri di eccitazione ed emissione. Qualsiasi perdita, guadagno o riarrangiamento di cromosomi marcati fluorescenti o di una parte del cromosoma è facilmente identificabile con questa tecnica FISH.
L'analisi delle aberrazioni cromosomiche mediante pittura FISH ha portato a notevoli progressi nella ricerca citogenetica nel corso degli anni. La progettazione di sonde marcate con fluorescenza per applicazioni specifiche che vanno dalle sonde locus-specific alle sonde di verniciatura dell'intero cromosoma ha fatto progredire il campo in modo significativo; Ciò ha anche facilitato l'individuazione di un riarrangiamento submicroscopico ("criptico"), che non era possibile con il banding cromosomico convenzionale. La pittura cromosomica di mFISH e SKY si è dimostrata uno strumento prezioso per l'identificazione di riarrangiamenti intercromosomici semplici e complessi. I principi di base per entrambe le tecniche sono simili, ma il metodo di rilevamento e discriminazione del segnale fluorescente dopo l'ibridazione in situ e il processo di acquisizione dell'immagine sono diversi. Nella mFISH, vengono catturate immagini separate di ciascuno dei quattro fluorocromi utilizzando filtri per microscopio passa-banda stretta; Viene poi utilizzato un software dedicato per combinare le immagini. Mentre in SKY, l'acquisizione delle immagini si basa su una combinazione di microscopia a epifluorescenza, imaging con dispositivo ad accoppiamento di carica e spettroscopia di Fourier, che consente la misurazione dell'intero spettro di emissione con una singola esposizione in tutti i punti dell'immagine. Sia in mFISH che in SKY, le immagini monocromatiche vengono catturate in modo indipendente, quindi unite e, infine, pseudo-colori unici vengono assegnati ai cromosomi in immagini monocromatiche in base al colorante specifico attaccato a ciascuna sonda fluorocromatica.
Il contributo dell'analisi mFISH e SKY nel campo della biologia delle radiazioni è notevole, in particolare per la stima retrospettiva della dose dell'esposizione umana a IR (biodosimetria da radiazioni)11-14, la valutazione del rischio di carcinogenesi da radiazioni15, nonché il rilevamento e la stima del rischio di cancro secondario correlato alla radioterapia16. Un recente studio sui topi ha dimostrato che una tecnica di pittura cromosomica basata su FISH è anche uno strumento importante per valutare l'efficacia della contromisura delle radiazioni17. Nel presente studio, l'effetto dell'esposizione totale alle radiazioni del corpo sull'induzione di aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo dei topi è stato dimostrato utilizzando tecniche mFISH e SKY.

<table><tbody><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Tampone 20&volte; Concentrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY Reagente da Laboratorio per Imaging</td><td>Spettrale Applicato</td> al Topo <td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Kit di Rilevamento Anticorpi Concentrato</td><td>Imaging Spettrale Applicato</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>Vernici Singole Personalizzate - 3 Colori; Cromosoma 1 del topo: Rosso, Cromosoma 2 del topo: Verde, Cromosoma 3 del topo: Aqua</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 37%, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piatti per la colorazione del vetro Fisherbrand con tappo a vite</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Soluzione di cloruro di potassio</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid in polvere</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, modello 25 137Cs irradiatore</td><td>J. L. Shepherd & Associates</td><td>Modello 484B</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, 200 Proof</td><td>Fisher Scientific MEX02761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), senza calcio e magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione di inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione (mfish) e spettrale cariotipo (sky) in topi irradiati

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono numerose aberrazioni cromosomiche stabili e instabili. Le aberrazioni instabili, in cui la morfologia cromosomica è sostanzialmente compromessa, possono essere facilmente identificate con le tecniche convenzionali di colorazione cromosomica. Tuttavia, il rilevamento di aberrazioni stabili, che comportano lo scambio o la traslocazione di materiale genetico senza modifiche considerevoli nella morfologia cromosomica, richiede sofisticate tecniche di pittura cromosomica che si basano sull'ibridazione in situ di sonde di DNA marcate in fluorescenza, una tecnica di pittura cromosomica popolarmente nota come fluorescenza in situ ibridazione (FISH). Le sonde FISH possono essere specifiche per interi cromosomi o per sottoregioni precise su cromosomi. Il metodo non solo consente la visualizzazione di aberrazioni stabili, ma può anche consentire il rilevamento del/i cromosoma/i o della/e sequenza/e di DNA specifica coinvolta in una particolare formazione di aberrazione. Una varietà di tecniche di pittura cromosomica sono disponibili in citogenetica; qui vengono discussi due metodi altamente sensibili, l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e il cariotipo spettrale (SKY), per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche che si formano nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale. Sebbene entrambe le tecniche si basino su sonde di DNA marcate con fluorescenza, il metodo di rilevamento e il processo di acquisizione delle immagini dei segnali fluorescenti sono diversi. Queste due tecniche sono state utilizzate in varie aree di ricerca, come la biologia delle radiazioni, la citogenetica del cancro, la biodosimetria retrospettiva delle radiazioni, la citogenetica clinica, la citogenetica evolutiva e la citogenetica comparativa.

Irradiazione corporea totale induce numerose aberrazioni cromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati. L&#39;attuale protocollo è ottimizzato per l&#39;arresto mitotico in vivo di cellule del midollo osseo dopo l&#39;esposizione alle radiazioni, la raccolta di cellule del midollo osseo dalle zampe posteriori di topi irradiati, isolamento di cellule del midollo osseo mononucleari mediante centrifugazione in gradiente di densità, la preparazione degli spread cell...

Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

L'obiettivo generale di questo metodo di citogenetica molecolare è osservare aberrazioni cromosomiche stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi esposti a irradiazione corporea totale. Questo metodo può contribuire a rispondere alla domanda fondamentale nel campo della biologia della radiazione, quale il rischio di indurre aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo di topi esposti a radiazioni corporee totali. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di visualizzare in modo mirato i danni genetici stabili indotti dalle radiazioni nelle cellule del midollo osseo di topi, che possono essere trasmessi attraverso numerose generazioni cellulari.Dopo aver isolato il midollo osseo dalle ossa femorali e tibiali di topo ed aver preparato una sospensione di singole cellule secondo il protocollo descritto, sovrapporre con attenzione la sospensione cellulare su un volume uguale di mezzo di separazione per cellule mononucleate del midollo osseo. Centrifugare il gradiente a 400 volte G a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, raccogliere con cura il buffy coat senza disturbare i restanti strati e trasferire la soluzione in un nuovo tubo da centrifuga da 15 millilitri.Per preparare vetrini con cellule in metafase, aggiungere 10 millilitri di PBS al tubo contenente il buffy coat. Quindi centrifugare il tubo a 400 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere con attenzione il soprannatante e battere delicatamente il tubo per disperdere il pellet cellulare.Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS e centrifugare nuovamente la sospensione. Rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Disaggregare il pellet e aggiungere goccia a goccia quattro millilitri di soluzione ipotonica di cloruro di potassio 0,075 molare preriscaldata, agitando delicatamente e costantemente.Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 20 minuti in un bagno a temperatura controllata. Quindi, aggiungere un volume uguale di fissativo al tubo e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. Centrifugare il tubo ed eliminare il soprannuato.Quindi, sospendere il pellet cellulare e aggiungere fissativo fresco. Ripetere la centrifugazione e l'aggiunta di fissativo altre cinque volte. Dopo aver risospeso le cellule in 400-600 microlitri di fissativo, depositare 30 microlitri di cellule fissate su vetrini precleanati e bagnati, inclinati a un angolo di 45 gradi, e lasciare asciugare i vetrini completamente all'aria durante la notte.Per eseguire la colorazione cromosomica murina mediante mFISH, posizionare il vetrino contenente gli strati di cellule in metafase in 2X SSC per due minuti a temperatura ambiente. Successivamente, disidratare il vetrino mediante lavaggi seriali in etanolo al 70%, 80% e 100% per due minuti in ciascun lavaggio. Riscaldare in anticipo 40 millilitri di soluzione di denaturazione in un barattolo di vetro tipo Coplin a 70 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi trasferire il vetrino nella soluzione preriscaldata e incubare il campione per uno-due minuti per denaturare i cromosomi. Immediatamente, utilizzare etanolo al 70% freddo di ghiaccio per arrestare la denaturazione per due minuti, interrompendo così il processo e impedendo ai cromosomi denaturati di riappaiarsi. Successivamente, disidratare il vetrino mediante una serie alcolica, partendo dall’etanolo al 80% per due minuti.Successivamente, posizionare il vetrino in etanolo al 100% per due minuti. Quindi asciugare completamente il vetrino a temperatura ambiente. Per denaturare la sonda, centrifugare brevemente la miscela di sonde fornita dal produttore, quindi trasferire 10 microlitri in un tubo da centrifuga con tappo a vite da 500 microlitri e incubare il tubo in un bagno termostatico a 80 gradi Celsius per sette minuti.Ora posizionare il tubo contenente la sonda denaturata in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, applicare la miscela di sonda su un vetrino con cromosomi denaturati. Coprire accuratamente l'area con un coprioggetto di vetro da 18 millimetri per 18 millimetri ed eliminare eventuali bolle d'aria visibili premendo molto delicatamente il coprioggetto sul vetrino.Usare cemento di gomma per sigillare tutti e quattro i lati del vetrino coprioggetto. Incubare quindi il vetrino al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Dopo l'ibridazione, rimuovere con attenzione il cemento di gomma e il vetrino coprioggetto e immergere il vetrino in SSC 0,4X preriscaldata a 74 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi trasferire il vetrino nella soluzione di lavaggio tre per due minuti. Aggiungere 20 microlitri di mezzo di montaggio antifade con controcolorazione DAPI sul vetrino e coprirlo con un'immersione di vetro. Utilizzare carta da laboratorio per premere delicatamente sull'immersione ed eliminare eventuali bolle d'aria e l'eccesso di soluzione di montaggio.Quindi utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino. Osservare i vetrini mediante un microscopio a fluorescenza dotato dei filtri appropriati. Per la cariotipizzazione spettrale dei cromosomi murini, dopo che le sonde sono state ibridate sui cromosomi denaturati e i campioni sono stati lavati secondo il protocollo indicato nel testo, applicare 80 microlitri del reagente di colorazione SY5 sul vetrino.Posizionare un coprioggetto in plastica di 24 per 60 millimetri sopra il campione e incubarlo al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Immergere il vetrino in un barattolo Coplin di vetro contenente soluzione di lavaggio preriscaldata per tre volte e incubarlo in un bagno termico a 45 gradi Celsius con agitazione per due minuti. Ripetere il lavaggio tre volte.Applicare 80 microlitri di reagente colorante SY5.5 al campione, coprirlo con un coperchio in plastica da 24 per 60 millimetri e incubare al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Utilizzare la soluzione di lavaggio preriscaldata tre per lavare il vetrino tre volte, quindi tenere il vetrino in posizione inclinata contro un tovagliolo di carta per far defluire il liquido in eccesso. Aggiungere 20 microlitri di reagente antifade DAPI al campione e posizionare con attenzione un coperchio in vetro sopra senza introdurre bolle d'aria.Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi e osservare il campione con un microscopio a epifluorescenza dotato di attrezzatura per acquisire immagini del cielo. Questa figura mostra allargamenti rappresentativi di cellule in metafase con coppie normali e aberranti di cromosomi murini uno, due e tre. Qui è presente un'aberrazione stabile che coinvolge il cromosoma uno, in cui una parte del cromosoma uno è stata integrata in un cromosoma DAPI non colorato, mentre un'altra parte ha formato un frammento acromatico.In questo esempio, una parte del cromosoma due è stata integrata in un cromosoma non colorato. Questa aberrazione stabile coinvolge il cromosoma tre. Aberrazioni stabili che coinvolgono tutti e tre i cromosomi colorati sono visibili in questa preparazione di metafase.Qui è mostrato un esempio di cariotipo spettrale di un topo femmina normale. Questo pannello rappresenta un'aberrazione stabile che coinvolge i cromosomi quattro e 12. Infine, l'aberrazione cromosomica stabile in questo pannello coinvolge il cromosoma sette e 10.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un periodo compreso tra 48 e 72 ore, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devono essere utilizzate solo cellule in proliferazione. Seguendo questa procedura e altri metodi come quello in banda, è possibile rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se siano presenti aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule irradiate.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della citogenetica molecolare per esplorare l'associazione tra aberrazioni genetiche e le diverse malattie. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea più chiara su come determinare le aberrazioni stabili intercromosomiche. Non dimenticate che lavorare con la colchicina può essere estremamente pericoloso poiché è cancerogena, e precauzioni come l'uso di guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questo esperimento.

detection-inter-chromosomal-stable-aberrations-multiple-fluorescence

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica avanzata citogenetica per individuare aberrazioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosomiche pittura, che permettono la classificazione di tutti i cromosomi. SKY può anche identificare aberrazioni cromosomiche complesse e difetti segregazione nei topi e nell'uomo con varie patologie, tra cui la malattia del rene policistico.

Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Emersione di resistenza genetica contro terapia con inibitori della chinasi pone sfida importante per la terapia del cancro efficace. Identificazione e caratterizzazione di mutazioni resistenti contro un farmaco di nuova concezione contribuisce a una migliore gestione clinica e di progettazione di farmaci di nuova generazione. Qui, descriviamo il nostro protocollo per lo screening e la validazione di mutazioni resistenti in vitro.

Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato  Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.

Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

Impara a rilevare aberrazioni cromosomiche stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati usando mFISH e SKY. Questa tecnica consente la visualizzazione guidata dei danni genetici indotti dalle radiazioni.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla In Situ Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati (Video) | JoVE Journal

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla

Esplora altri video