Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla In Situ Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati
January 11th, 2017
Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.
L'obiettivo generale di questo metodo citogenico molecolare è osservare aberrazioni intercromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo di topi esposti all'irradiazione totale del corpo. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della biologia delle radiazioni, come il rischio di indurre aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo dei topi esposti a radiazioni corporee totali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione guidata dei danni genetici stabili indotti dalle radiazioni nelle cellule del midollo osseo dei topi che possono essere propagati attraverso molte generazioni cellulari.
Dopo aver isolato il midollo osseo dalle ossa del femore e della tibia di topo e aver effettuato una sospensione a singola cellula secondo il protocollo di testo, sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare su un volume uguale di mezzo di separazione cellulare mononucleata del midollo osseo. Centrifugare il gradiente a 400 volte G a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, raccogliere con cura il buffy coat senza disturbare gli strati rimanenti e trasferire la soluzione in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Per preparare le creme cellulari in metafase, aggiungere 10 millilitri di PBS alla provetta contenente il buffy coat. Quindi centrifugare la provetta a 400 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere con cautela il surnatante e picchiettare delicatamente il tubo per rompere il pellet cellulare.
Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS e centrifugare nuovamente la sospensione. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Rompere il pellet e aggiungere goccia a goccia quattro millilitri di soluzione ipotonica di cloruro di potassio 0,075 molare preriscaldata con agitazione delicata e costante.
Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 20 minuti a bagnomaria. Quindi, aggiungere un volume uguale di fissativo al tubo e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. Centrifugare la provetta e rimuovere il surnatante.
Quindi, rompere il pellet cellulare e aggiungere un nuovo fissativo. Ripetere la filatura e l'aggiunta del fissativo altre cinque volte. Dopo aver risospeso le cellule in 400-600 microlitri di fissativo, far cadere 30 microlitri di cellule fissate su vetrini prepuliti e bagnati inclinati di un angolo di 45 gradi e lasciare asciugare completamente i vetrini all'aria durante la notte.
Per eseguire la pittura cromosomica del topo con mFISH, posizionare il vetrino contenente le divaricazioni cellulari in 2X SSC per due minuti a temperatura ambiente. Quindi, disidratare il vetrino mediante lavaggio seriale con etanolo al 70% 80% e etanolo al 100% per due minuti in ogni lavaggio. Preriscaldare 40 millilitri di soluzione di denaturazione in un barattolo di vetro coplin a 70 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi trasferire il vetrino nella soluzione preriscaldata e incubare il campione per uno o 1 minuto e mezzo per denaturare i cromosomi. Utilizzare immediatamente etanolo ghiacciato al 70% per spegnere il vetrino per due minuti per fermare il processo di denaturazione e prevenire la ricottura dei cromosomi denaturati. Quindi disidratare il vetrino utilizzando una serie di etanolo iniziando con l'80% di etanolo per due minuti.
Quindi, posizionare il vetrino in etanolo al 100% per due minuti. Quindi asciugare completamente il vetrino a temperatura ambiente. Per denaturare la sonda, centrifugare brevemente la miscela di sonde fornita dal produttore, quindi trasferire 10 microlitri in una provetta da centrifuga con tappo a scatto da 500 microlitri e incubare la provetta in un bagno d'acqua a 80 gradi Celsius per sette minuti.
Posizionare ora il tubo contenente la sonda denaturata in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi applicare la miscela di sonde su un vetrino con cromosomi denaturati. Coprire accuratamente l'area con un vetrino coprioggetti da 18 millimetri per 18 millimetri ed eliminare eventuali bolle d'aria visibili premendo molto delicatamente il vetrino coprioggetti sul vetrino.
Utilizzare del cemento di gomma per sigillare tutti e quattro i lati del vetrino coprioggetti. E incubare il vetrino al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Dopo l'ibridazione, rimuovere con cura il cemento di gomma e il vetrino coprioggetti e posizionare il vetrino in SSC 0,4X preriscaldato a 74 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi trasferire il vetrino nella soluzione di lavaggio tre per due minuti. Aggiungere 20 microlitri di terreno di montaggio antisbiadimento con colorante DAPI sul vetrino e coprirlo con un vetrino coprioggetti. Utilizzare carta velina da laboratorio per premere delicatamente sul vetrino coprioggetti per rimuovere eventuali bolle d'aria e soluzione di montaggio in eccesso.
Quindi usa lo smalto per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti. Visualizzare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di appositi filtri. Per la cariotipizzazione spettrale dei cromosomi di topo, dopo che le sonde sono state ibridate sui cromosomi denaturati e i campioni sono stati lavati secondo il protocollo di testo, applicare 80 microlitri di reagente di colorazione SY5 sul vetrino.
Posizionare un vetrino coprioggetti di plastica da 24 x 60 millimetri sopra il campione e incubarlo al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Immergere il vetrino in un barattolo di vetro contenente la soluzione di lavaggio preriscaldata tre e incubarlo a bagnomaria a 45 gradi Celsius agitando per due minuti. Ripetere il lavaggio tre volte.
Applicare 80 microlitri di reagente colorante SY5.5 sul campione, coprirlo con un vetrino coprioggetti di plastica da 24 x 60 millimetri e incubarlo al buio in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Utilizzare una soluzione di lavaggio preriscaldata tre volte per lavare il vetrino, quindi tenere il vetrino in posizione inclinata contro un tovagliolo di carta per drenare il liquido in eccesso. Aggiungere 20 microlitri di reagente DAPI antisbiadimento al campione e posizionare con cura un vetrino coprioggetti senza introdurre bolle d'aria.
Usa lo smalto per sigillare i bordi e osserva il campione con un microscopio a epifluorescenza attrezzato per catturare immagini del cielo. Questa figura mostra le diffuse rappresentative delle cellule in metafase con coppie di cromosomi normali e aberranti di topo uno, due e tre. Qui c'è un'aberrazione stabile che coinvolge il cromosoma uno in cui una parte del cromosoma uno è stata integrata in un cromosoma DAPI non dipinto mentre un'altra parte ha formato un frammento acentrico.
In questo esempio, una parte del cromosoma due è stata integrata in un cromosoma non dipinto. Questa aberrazione stabile coinvolge il cromosoma tre. In questa metafase si osservano aberrazioni stabili che coinvolgono tutti e tre i cromosomi dipinti.
Qui è mostrato un esempio di spettro-cariotipo di un normale topo femmina. Questo pannello rappresenta un'aberrazione stabile che coinvolge i cromosomi quattro e 12. Infine, l'aberrazione cromosomica stabile in questo pannello coinvolge i cromosomi sette e 10.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro 48-72 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devono essere utilizzate solo cellule proliferanti. Seguendo questa procedura e altri metodi, come l'in, si può rispondere a ulteriori domande, come la presenza di aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule irradiate.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della citogenetica molecolare per esplorare l'associazione tra le aberrazioni genetiche con le varie malattie. Dopo aver visto questo video dovresti avere un'idea più chiara su come determinare le aberrazioni stabili intercromosomiche. Non dimenticare che lavorare con la colchicina può essere estremamente pericoloso perché è cancerogeno e precauzioni come indossare i guanti dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questo esperimento.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'applicazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) per identificare le aberrazioni intercromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'irradiazione del corpo intero. Questo metodo è significativo per comprendere gli impatti genetici dell'esposizione alle radiazioni.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia delle radiazioni
- Citogenetica
- Biologia molecolare
Sfondo
- Le aberrazioni cromosomiche stabili possono essere indotte dall'esposizione alle radiazioni.
- Le cellule del midollo osseo sono cruciali per studiare il danno genetico.
- Comprendere queste aberrazioni aiuta a valutare i rischi delle radiazioni.
- mFISH e SKY sono tecniche avanzate per visualizzare i cambiamenti genetici.
Obiettivo dello studio
- Osservare le aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo.
- Valutare il rischio di danni cromosomici stabili dall'irradiazione del corpo intero.
- Fornire un metodo per la visualizzazione guidata del danno genetico.
Metodi utilizzati
- Isolamento del midollo osseo dal femore e dalla tibia del topo.
- Preparazione di una sospensione di cellule singole.
- Utilizzo di un mezzo di separazione delle cellule mononucleate del midollo osseo.
- Centrifugazione per raccogliere il buffy coat per l'analisi.
Risultati principali
- Identificazione di aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule irradiate.
- Dimostrazione dell'efficacia delle tecniche mFISH e SKY.
- Insiemi sulle propagazione del danno genetico attraverso le generazioni cellulari.
- Contributo alla comprensione dei rischi genetici indotti dalle radiazioni.
Conclusioni
- mFISH e SKY sono strumenti preziosi per studiare gli effetti delle radiazioni.
- Le aberrazioni stabili possono essere tracciate attraverso molteplici divisioni cellulari.
- Questa ricerca aiuta a valutare gli impatti a lungo termine dell'esposizione alle radiazioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Detection of stable chromosomal aberrations in irradiated bone marrow cells provides critical data for assessing long-term genetic risks in preclinical radiation safety studies. The mFISH and SKY techniques enable visualization of inter-chromosomal translocations that persist across cell generations, supporting mechanistic de-risking in target validation pipelines. This approach enhances predictive confidence by linking radiation exposure to stable genomic alterations relevant to carcinogenesis and therapeutic response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation-induced genomic instability as a biomarker for DNA repair pathway efficacy.
- Operational Value: Provides a reproducible method to detect stable aberrations that may correlate with oncogenic transformation risk.
- Predictive Value: Supports assessment of compound-induced genotoxicity by visualizing chromosomal translocations in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of stable aberration frequency per cell, enabling dose-response modeling.
- Operational Value: Standardized chromosome painting protocols allow inter-laboratory comparability in genotoxicity screening.
- Scalability: Metaphase spread preparation and hybridization steps can be adapted for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks propagation of stable aberrations through multiple cell divisions, informing clonal evolution models.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of genetic damage in bone marrow-derived cell populations.
- Translational Continuity: Aberration patterns observed in mice can inform human-relevant radiation biodosimetry frameworks.
Pipeline & Workflow Integration
The mFISH and SKY methods integrate into preclinical safety assessment workflows following in vivo irradiation studies, bridging phenotypic observation with molecular cytogenetic analysis. These techniques are positioned post-exposure and pre-analytical validation to confirm genomic integrity of bone marrow-derived cells used in downstream functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding radiation-induced chromosomal rearrangements and their persistence in stem/progenitor cell compartments.
- Screening: Delivers assay-ready metaphase spreads with quantifiable aberration counts for compound library profiling.
- Analytics: Generates karyotype-specific imaging data and DAPI counterstained images enabling automated translocation scoring.
- Translational Research: Connects murine cytogenetic endpoints to human-relevant biomarkers of genomic instability in radiation-exposed tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytogenetic platform for evaluating genotoxic potential across radiation modifiers, radioprotectors, and DNA damage response inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing stable inter-chromosomal exchanges undetectable by conventional staining.
- Operational Value: Enables standardization of chromosome preparation, hybridization, and imaging across multiple sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing evidence of chromosomal translocations that may indicate leukemogenic risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on low-aberration profiles in irradiated bone marrow models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome spreading, fluorescence microscopy, and spectral imaging analysis.
- Dependent on access to mFISH/SKY probe sets, epifluorescence or spectral microscopy systems, and antifade mounting reagents.
- Necessitates standardization of bone marrow isolation, metaphase arrest, and slide preparation across user groups.
- Adaptation to alternative tissue types (e.g., spleen, lymph nodes) may require optimization of hypotonic treatment and fixation steps.
- Limited to proliferating cells; quiescent or non-dividing populations require alternative methods to assess stable aberrations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Isolation of Bone Marrow Mononuclear Cells by Density Gradient Centrifugation and Preparation of Metaphase Cell Spreads
3:04
Mouse Chromosome Painting by mFISH
6:07
Spectral Karyotyping of Mouse Chromosomes
7:45
Results: Inter-chromosomal Stable Aberration Analysis by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization and Spectral Karyotyping
9:02
Conclusion
