Quantificazione basata su nanoparticelle coniugate con anticorpi mediante microscopia a campo scuro: una procedura per catturare e quantificare esosomi specifici dai fluidi corporei

Gli esosomi sono piccole strutture racchiuse nella membrana che vengono secrete dalle cellule nello spazio extracellulare. Gli esosomi sono abbondantemente presenti nei biofluidi.

Per identificare e catturare esosomi specifici dai fluidi corporei, iniziare prelevando un vetrino immunologico a più pozzetti. Questo vetrino è funzionalizzato con proteine che agiscono come antigeni e si legano ad anticorpi specifici.

Integrare il vetrino con la soluzione di anticorpi primari desiderata e incubare. Questi anticorpi si legano agli antigeni pre-rivestiti sulla superficie del vetrino.

Aspirare la soluzione rimanente per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Ora, aggiungi un tampone bloccante che blocca gli antigeni liberi, impedendo così il legame aspecifico degli esosomi.

Quindi, rimuovere il tampone bloccante, caricare gli esosomi contenenti la sospensione di siero sul vetrino e incubare. Ciò consente il legame esclusivo di esosomi specifici del bersaglio agli anticorpi primari catturati.

Quindi, caricare una sospensione di anticorpi secondari coniugati con nanoparticelle d'oro sulla superficie del vetrino. Questi anticorpi si attaccano agli esosomi pre-legati e formano un complesso di rilevamento.

Infine, utilizzando una pipetta, scartare eventuali anticorpi secondari non legati. Visualizzare i vetrini al microscopio a campo scuro. Le nanoparticelle d'oro presenti sulla superficie degli esosomi diffondono la luce e appaiono come punti luminosi sullo sfondo scuro.

Per iniziare a preparare il vetrino, diluire gli anticorpi di cattura dell'esosoma desiderati a 0,025 milligrammi per millilitro in PBS. Pipettare 1 microlitro della soluzione in ciascun pozzetto di un vetrino trattato con proteina A/G supportato da vetro di grado ottico. Quindi, trasferire il vetrino in una scatola umidificante per assicurarsi che i pozzetti non si asciughino durante l'incubazione.

Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 1 ora per immobilizzare gli anticorpi di cattura. Quindi, aspirare la soluzione rimanente per rimuovere gli anticorpi non legati. Lavare i pozzetti aggiungendo e aspirando 1 microlitro di PBS per tre volte. Quindi, caricare rapidamente ogni pozzetto con 1 microlitro di tampone bloccante a base di PBS e incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 2 ore.

Quando si eseguono circa 15 campioni, è necessario utilizzare una pipetta a canale singolo per caricare il tampone di lavoro su 120 pozzetti in meno di 5 minuti per evitare l'evaporazione dell'agente bloccante.

Iniziare a preparare una soluzione di nanobarre d'oro coniugate con anticorpi durante il blocco dei vetrini. Circa 30 minuti prima della fine del blocco, scongelare rapidamente i campioni di plasma o siero in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Agitare i campioni scongelati per 30 secondi per assicurarsi che le sospensioni siano omogenee. Quindi, centrifugare i campioni a 500 x g per 15 minuti per far precipitare gli aggregati proteici e altri detriti.

Trasferire 10 aliquote da microlitro dei surnatanti in provette fresche ed effettuare diluizioni uno a uno con PBS. Miscelare i campioni diluiti mediante vortice delicato o inversione, a seconda dei casi. Al termine del blocco dei vetrini, aspirare il tampone di blocco e lavare i pozzetti tre volte con porzioni da 1 microlitro di PBS. Caricare immediatamente i campioni nei pozzetti con 1 microlitro per pozzetto e 8 repliche per campione.

Caricare gli standard degli esosomi nei pozzetti appropriati allo stesso modo. Incubare il vetrino per 12-18 ore in frigorifero a 4 gradi Celsius. Quindi, aspirare i pozzetti e lavare ogni pozzetto una volta con 1 microlitro di PBS. Caricare 1 microlitro della sospensione di nanobarre d'oro coniugate con anticorpi in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 2 ore.

Successivamente, aspirare la sospensione di nanorod e lavare il vetrino in PBS integrato con polisorbato-20 allo 0,01% per 10 minuti utilizzando un miscelatore. Quindi, aspirare i pozzetti e lavare il vetrino in acqua deionizzata per 10 minuti su un miscelatore rotante. Rimuovere l'acqua e lasciare asciugare il vetrino all'aria in una capsula di Petri pulita prima di portare il vetrino al microscopio a campo scuro.