Utilizzando Nanoplasmon-diffusione migliorata e imaging del microscopio a basso ingrandimento per quantificare gli esosomi derivati dal tumore

Lo scattering potenziato dal nanoplasmone, o nPES, è un'alternativa semplice e non invasiva alla biopsia chirurgica che può saltare passaggi di purificazione esosoma dispendiosi in termini di tempo e lavoro, espandendo l'applicazione dell'analisi esosoma alle impostazioni cliniche. Questo test nPES è una procedura rapida per analizzare biomarcatori specifici sulla membrana esterna di esosomi che non richiedono passaggi separati di isolamento e purificazione. Abbiamo solo bisogno di un campione clinico molto piccolo per questo test.

Pertanto, questo metodo può espandere l'uso di nPES per studiare modelli di mouse geneticamente modificati o PDX. Ci sono alcuni passaggi in questo protocollo che potrebbero sembrare scoraggianti. Tuttavia, con alcune corse di pratica, tutti coloro che hanno abilità di laboratorio bagnato di base possono imparare a eseguire con successo nPES.

Per iniziare la procedura, combinare 40 microlitri di una sospensione di nanorodi d'oro funzionalizzati con NeutrAvidin con 200 microlitri di soluzione salina fredda, pH sette tamponati da fosfati. Centrifugare la miscela a 8500 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti e rimuovere il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte, quindi rimorsi le nanorodi in 40 microlitri di PBS freddo.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di PBS freddo e 10 microlitri di una soluzione da 0,5 milligrammi per millilitro degli anticorpi biotinilati appropriati alla sospensione. Mescolare a quattro gradi Celsius per due ore per ottenere nanorod d'oro coniugati con anticorpi. Lavare le nanorodi tre volte per centrifugazione in porzioni di 200 microliter di PBS freddo a 6500 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti ciascuna.

Successivamente, resostipendare le nanorodi coniugate con anticorpi lavati in 200 microlitri di PBS freddo e conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore. Per iniziare a preparare la diapositiva, diluire gli anticorpi di cattura esosoma desiderati a 025 milligrammi per millilitro nel PBS. Pipettare un microlitro di questa soluzione in ogni pozzo di un vetrino trattato con A/G proteico supportato da vetro di qualità ottica.

Quindi, trasferire lo scivolo in una scatola umidificante per assicurarsi che i pozzi non si asciughino durante l'incubazione. Incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius per un'ora per immobilizzare gli anticorpi di cattura. Quindi, aspirare la soluzione rimanente per rimuovere gli anticorpi non vincolati.

Lavare i pozzi aggiungendo e aspirando un microlitro di PBS tre volte. Quindi, caricare rapidamente ogni pozzo con un microlitro di tampone di blocco basato su PBS e incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per due ore. Quando si eseguono circa 15 campioni, è necessario utilizzare una pipetta a canale singolo per caricare il buffer di blocco su 120 pozzi in meno di cinque minuti per evitare l'evaporazione dell'agente bloccante.

Inizia a preparare una soluzione di nanorod d'oro coniugati con anticorpi durante il blocco dello scivolo. Circa 30 minuti prima di bloccare le finiture, scongelare rapidamente campioni di plasma o siero in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Vortice i campioni scongelati per 30 secondi per garantire che le sospensioni siano omogenee.

Quindi, centrifugare i campioni a 500 volte g per 15 minuti per far precipitare aggregati proteici e altri detriti. Trasferire aliquote da 10 microliter del supernatante a tubi freschi e effettuare diluizioni uno-a-uno con PBS. Mescolare i campioni diluiti con vortici delicati o inversione a caso.

Al termine del blocco dello scorrimento, aspirare il tampone di blocco e lavare i pozzi tre volte con porzioni di un microlitro di PBS. Caricare immediatamente i campioni nei pozzi con un microlitro per pozzo e otto repliche per campione. Caricare gli standard esosomi nei pozzi appropriati allo stesso modo.

Incubare lo scivolo per 12-18 ore in frigorifero a quattro gradi Celsius. Quindi, aspirare i pozzi e lavare ogni bene una volta con un microlitro di PBS. Caricare un microlitro della sospensione di nanorod d'oro coniugato con anticorpi in ogni pozzo e incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius per due ore.

Successivamente, aspirare le sospensioni nanorod e lavare lo scivolo in PBS integrato con 1%polysorbate 20 per 10 minuti utilizzando un mixer. Quindi, aspirare i pozzi e lavare lo scivolo in acqua deionizzata per 10 minuti su un miscelatore rotante. Rimuovere l'acqua e lasciare asciugare all'aria lo scivolo in una piastra di Petri pulita prima di portare lo scivolo al microscopio a campo scuro.

Impostare un microscopio invertito dotato di condensatore ad immersione dell'olio a campo scuro, un obiettivo 4x e uno stadio motorizzato. Collegare il microscopio a un computer tramite una fotocamera digitale e aprire il software di imaging. Quindi, posizionare lo scivolo del campione capovolto sullo stadio del microscopio e applicare una piccola goccia di olio ad immersione in cui l'obiettivo del condensatore contatta lo scivolo.

Visualizzare la vista attraverso il microscopio nel software di imaging. Regolare bene il tempo di esposizione rispetto a uno standard ad alta concentrazione per garantire che l'immagine non sia satura. Quindi, apri lo strumento per la scansione di immagini di grandi dimensioni e imposta l'ingrandimento obiettivo su 10x.

Scegliere di chiudere l'otturatore attivo durante il movimento del palco e attendere 20 millisecondi prima di ogni acquisizione. Impostare la sovrapposizione delle cuciture sul 20% e selezionare le cuciture tramite il percorso ottimale. Scegliere di creare un'immagine di grandi dimensioni dall'analisi.

Impostare la fotocamera in modo che si concentri manualmente all'inizio della scansione e abilitare la messa a fuoco automatica passo dopo passo ogni 20 campi. Quindi, scegliere di impostare i limiti sinistro, destro, superiore e inferiore per il campo di scansione di destinazione e definire l'area di scansione spostando lo stadio del microscopio su ciascuno dei limiti desiderati. Quindi, regola la messa a fuoco, il condensatore e l'illuminazione dell'area per ottenere un'immagine chiara e ben illuminata.

Assegnare al file di immagine il nome da creare e avviare l'analisi. Al termine, apri l'immagine e salvala in scala 1/8. Aprire il software di analisi delle immagini.

Quindi, aprite il menu Plugin, fate clic su Scansione DSM (DSM Scan), definite il numero di colonne e righe, impostate la percentuale di ridimensionamento su 25, impostate il diametro spot, in pixel, su 190 a 200, impostate l'intervallo di diametro su 32 e impostate il diametro dell'incremento, in pixel, su otto. Impostare i limiti DSM bassi e alti su zero e 62, la distanza adiacente su 100 e la distorsione di sottrazione su zero. Eseguire l'algoritmo DSM e salvare i dati risultanti.

La tecnica di analisi DSM ha mostrato una buona riproducibilità su campioni esosomi PANC-1 diluiti in serie che vanno da 0,24 a 1,2 microgrammi per microlitro. È stata osservata una forte correlazione lineare tra la risposta di dispersione dalle nanorode d'oro e la concentrazione di proteine esosomiche. È stata osservata una differenza significativa nell'abbondanza di esosomi sieri che esprimono il biomarcatore associato al cancro EphA2 tra pazienti con cancro al pancreas e pazienti sani.

Dall'aggiunta dell'agente bloccante in poi, una pipettazione rapida e accurata è fondamentale per evitare l'evaporazione dei campioni, introducendo la contaminazione incrociata e graffiando la superficie dello scivolo. Seguendo questa procedura, eseguiamo analisi statistiche per indagare qualsiasi correlazione tra l'espressione del biomarcatore esosomiale di interesse e la diversa fase della malattia che viene studiata. Dopo aver stabilito questa tecnologia, e siamo in grado di trovare biomarcatori esosomi per i tumori al pancreas in fase iniziale.

Attualmente, stiamo espandendo questa scoperta ad altri tipi di tumori e malattie infettive. Di solito, i campioni trattati in questo saggio sono campioni di pazienti o campioni esosomi purificati dalle linee cellulari tumorali, che richiedono uno speciale addestramento alla sicurezza.