Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

L'obiettivo generale di questo metodo è ottenere dati di microscopia elettronica e ottica correlativa, o CLEM, combinando le informazioni immunocitochimiche a fluorescenza con la morfologia ultrastrutturale della microscopia elettronica a trasmissione in un'unica immagine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunocitochimica e della patologia, come ad esempio a quale struttura subcellulare è associata una particolare proteina di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza la stessa sonda di nanoparticelle a punti quantici per ottenere sia il segnale di microscopia dal vivo dalla proteina bersaglio che la localizzazione strutturale al microscopio elettronico.

Dopo aver fissato, incorporato e sezionato il tessuto tumorale del somatostatinoma umano secondo il protocollo di testo, preparare una soluzione adesiva per sezioni inserendo 20 centimetri di nastro adesivo trasparente in un flacone da cinque millilitri contenente 2,0 millilitri di acetone e lasciarlo riposare per 10 minuti. Rimuovere il nastro adesivo e immergere una griglia di nichel nella soluzione, quindi rimuovere la griglia e lasciarla asciugare all'aria. Una volta asciutto, usa il lato opaco della griglia per raccogliere una sezione ultra sottile.

È fondamentale stabilire il tempo di mordenzatura corretto per la formulazione di resina scelta. 30 minuti funzionano bene per questa formulazione, ma potrebbe essere necessario ricalcolarlo per formulazioni più dure o più morbide. Preparare un millilitro di soluzione mordenzante di metaperiodato di sodio saturo fresco in acqua distillata e posizionare le goccioline della soluzione su una superficie di pellicola da laboratorio pulita.

Posizionare le griglie completamente asciutte con sezioni sulle goccioline e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, trasferire le griglie in goccioline di acqua distillata per 60 secondi per lavarle via. Per eseguire la marcatura di anticorpi e punti quantici, o QD, su una superficie di pellicola di laboratorio pulita, pipettare gocce di glicene molare 0,05 e PBS.

Posizionare le griglie sulle goccioline e incubare per 10 minuti per bloccare l'aldeide residua sulle sezioni. Per rimuovere il blocco di aldeidi, tamponare brevemente il bordo della griglia. Quindi posizionare la griglia su una gocciolina dell'uno per cento di siero di capra normale, o NGS, e dell'uno per cento di BSAC in PBS per 10 minuti.

Preparare un millilitro di soluzione bloccante aggiungendo 10 microlitri di NGS e 100 microlitri di BSAC a 890 microlitri di PBS. Quindi, condizionare le sezioni mettendole su una gocciolina di diluente anticorpale per 10 minuti. Quindi, utilizzare il diluente anticorpale per diluire l'anticorpo policlonale anti-somatostatina da uno a 10 e posizionare le griglie sulle goccioline della soluzione.

Incubare in camera umida a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere il reagente anticorpale tamponando il bordo della griglia. Quindi utilizzare il diluente anticorpale per lavare le sezioni due volte per cinque minuti ciascuna.

Dopo aver diluito l'anticorpo secondario da uno a 10 e aver preparato le gocce, incubare le griglie sulle goccioline a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare le sezioni due volte. Diluire i QD coniugati con streptavidina da uno a 10 e incubare i campioni su gocce della soluzione al buio, a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi utilizzare il diluente anticorpale per lavare le griglie due volte, ogni volta per cinque minuti, e tamponare il bordo delle griglie. Successivamente, lavare le griglie in acqua distillata per due minuti prima di asciugare i bordi. Posizionare la sezione della griglia immunocolorata in una goccia d'acqua su un vetrino di vetro e utilizzare un vetrino coprioggetti per coprirla.

Per eseguire la microscopia con luce a fluorescenza, inserire un cubo filtrante con le seguenti caratteristiche e utilizzare un'illuminazione LED a 365 nanometri. Posizionare la sezione immunocolorata sul tavolino del microscopio a immunofluorescenza. Utilizzare la microscopia ottica per valutare il modello di etichettatura, il livello di qualsiasi etichettatura non specifica e per stabilire che i controlli negativi siano chiari.

Successivamente, identifica i ROI in relazione alle barre della griglia. Quindi impostare una fotocamera digitale a colori su FL colore automatico e impostare il bilanciamento del bianco su 3, 200 K.Impostare la fotocamera sulla modalità di esposizione automatica con un'impostazione gamma compresa tra 0,45 e 1,00 per ottimizzare l'aspetto delle immagini e guadagno analogico impostato su uno X.Fare clic sull'icona della fotocamera nell'interfaccia grafica del software ZEN Two Light per vivere. Quindi mettere a fuoco l'immagine e fare clic su Snap nell'interfaccia grafica del software ZEN Two Light per acquisire l'immagine nel negozio di cornici.

Salva le immagini come file tf per evitare compressione e pixelizzazione. Preparare una stampa che mostri la posizione del ROI in relazione alle barre della griglia o ad altri punti di riferimento significativi dei tessuti. Quindi rimuovere la griglia dal vetrino, lavarla in acqua distillata e asciugare delicatamente i bordi.

Per eseguire la microscopia elettronica a trasmissione, trasferire la griglia al microscopio per l'esame utilizzando una tensione di accelerazione di 100 kilovolt. Inizia con un basso ingrandimento di circa 1.400X per navigare intorno alla griglia e trovare i ROI con quelli trovati con la microscopia ottica. Osservare i singoli QD con un ingrandimento di 70.000X o superiore.

Appariranno come strutture cristalline irregolari con una moderata densità elettronica. Quindi, utilizzando una fotocamera digitale con un sensore monocromatico da 1,392 x 1,040 pixel nell'interfaccia grafica del software di imaging, fare clic sull'icona della fotocamera per attivare e acquisire le immagini. Spostare l'icona della fotocamera in posizione off per memorizzare l'immagine nel negozio di cornici.

Per eseguire l'imaging CLEM, utilizzare una stampa dell'imaging al microscopio ottico per individuare le ROI corrispondenti in base alla TEM. Le caratteristiche architettoniche dei tessuti sono utili per la navigazione all'interno della sezione. Cattura un'immagine del ROI corrispondente tramite TEM.

Successivamente, per preparare un'immagine CLEM, assicurarsi che l'immagine TEM sia orientata correttamente e ingrandita alla stessa dimensione e risoluzione dell'immagine del microscopio ottico, in questo caso 300 pixel per pollice. Estendi le dimensioni dell'immagine dell'immagine al microscopio ottico per raddoppiarne le dimensioni. Quindi copia e incolla l'immagine TEM accanto all'immagine a fluorescenza.

Per creare una sovrapposizione di fluorescenza in Photoshop CS2, fai clic sullo strumento di selezione rettangolare, seleziona l'immagine fluorescente e crea un livello duplicato da essa. Regolate le opzioni di fusione dello stile di livello su una trasparenza compresa tra il 30 e il 40%. Quindi fare clic sullo strumento di spostamento e trascinare il livello di sovrapposizione della fluorescenza sull'immagine TEM corrispondente e allineare le immagini.

Dopo aver allineato le immagini, appiattisci l'immagine per produrre la sovrapposizione finale. Quindi usa lo strumento selezione rettangolare per selezionare la nuova immagine di sovrapposizione e copiarla su una nuova tela. Infine, salva l'immagine come file tf.

In questa immagine al microscopio a fluorescenza, le singole cellule tumorali del somatostatinoma contengono abbondanti granuli secretori e sono state marcate positivamente per l'ormone somatostatina. I nuclei apparivano come buchi scuri e, a basso ingrandimento, nel citoplasma è stata osservata una fluorescenza QD granulare arancione variabile e intensa. Il ROI scelto dalla microscopia ottica è stato riconosciuto e visualizzato utilizzando TEM facendo riferimento a un'immagine di microscopia ottica 20X come indicato qui.

A un ingrandimento più elevato, la cellula dimostra una fluorescenza brillante e un'intensa marcatura QD nei granuli citoplasmatici. La sovrapposizione dei dati di fluorescenza sulle immagini TEM, come in questo esempio, suggerisce che una forte marcatura positiva corrisponde a granuli contenenti materiale moderatamente denso di elettroni all'interno della membrana limitante della vescicola. Infine, come si vede qui a un ingrandimento più elevato, i granuli moderatamente densi di elettroni hanno mostrato un'intensa immunomarcatura dei nanocristalli QD.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le griglie con cura, solo per i bordi. Toccando la sezione mentre si solleva la griglia, la sezione può staccarsi dalla griglia.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunomarcatura multiplex per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se la proteina di interesse si co-localizza con un'altra proteina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della patologia per esplorare la localizzazione delle proteine nel processo di archiviazione dei tessuti umani per la microscopia elettronica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare le informazioni immunocitochimiche della microscopia ottica a fluorescenza con l'ultrastruttura della microscopia elettronica a trasmissione.

Non dimenticare che lavorare con il tetrossido di osmio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come indossare dispositivi di protezione, lavorare in una cappa aspirante e smaltire correttamente i rifiuti.