Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le interazioni delle nanoparticelle fluorescenti con le sottopopolazioni di cellule immunitarie primarie mediante citometria a flusso. Ciò si ottiene trattando prima le cellule di interesse con le nanoparticelle. Nella fase successiva, le cellule vengono marcate con anticorpi contro i marcatori di superficie specifici della cellula e quindi analizzate mediante citometria a flusso.

In definitiva, è possibile misurare l'interazione delle nanoparticelle con le singole popolazioni di cellule immunitarie. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia è che con questa tecnica, le variazioni di intensità di fluorescenza indotte dalle nanoparticelle possono essere quantificate in popolazioni cellulari non aderenti Per l'internalizzazione delle nanoparticelle nei leucociti del sangue, o nei monociti purificati, inizia con la placcatura da cinque volte 10 a un quinto delle cellule di interesse in un millilitro per pozzetto. In ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Quindi aggiungere 10 microlitri di sospensione di nanoparticelle di biossido di silicio fluorescente appena preparata a ciascun pozzetto sperimentale, aggiungendo un volume uguale di terreno completo ai pozzetti di controllo non trattati anche in questo momento. Dopo un'internalizzazione di un'ora a 37 gradi Celsius, trasferire i campioni in singole provette di polipropilene da 1,5 millilitri, quindi centrifugare i campioni per tre minuti a 6.000 volte G e temperatura ambiente per colorare le cellule con CD 14 via blu Incubare 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare in 10 microlitri di anticorpo umano in un rapporto di uno a 11 in tampone in esecuzione per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato via l'anticorpo non legato in un millilitro di tampone in esecuzione, risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone in esecuzione fresco per l'analisi citofluorimetrica.

Successivamente, per impostare la compensazione spettrale dello spillover, aprire la casella delle impostazioni dello strumento nel software di citometria a flusso, quindi acquisire un campione privo di nanoparticelle non marcate a bassa velocità fluidica. La regolazione delle impostazioni di compensazione in presenza di nanoparticelle fluorescenti è la parte più complicata della procedura in quanto le nanoparticelle possono interferire con la dispersione laterale per garantire il successo, è necessario definire un gate della popolazione cellulare di interesse Regolare manualmente la dispersione diretta e laterale regolando i canali di tensione. Quindi disegna un cancello adeguatamente grande attorno alla popolazione cellulare desiderata.

Caricare un altro campione senza etichetta e aprire la scheda di compensazione nella casella delle impostazioni dello strumento. Regolare il fattore di compensazione durante l'acquisizione fino a quando l'intensità della fluorescenza nel canale di spillover è all'incirca la stessa per le popolazioni fluorocromo positive e negative. Infine, dopo aver regolato la compensazione per ogni singola provetta di controllo in fluorocromo colorata, letto i campioni trattati con nanoparticelle nel tentativo di caratterizzare meglio il comportamento dei globuli bianchi in risposta alle nanoparticelle, sono stati eseguiti saggi di internalizzazione come appena dimostrato.

Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, tre principali sottopopolazioni di leucociti del sangue sono state chiaramente identificate mediante scattering diretto e laterale dopo l'isolamento di PBMC. Inoltre, dopo il trattamento con biossido di silicio fz, i linfociti, i monociti e i granulociti hanno mostrato diversi tassi di internalizzazione delle nanoparticelle, come indicato dalla loro intensità di fluorescenza. In queste immagini, l'internalizzazione delle nanoparticelle è dimostrata in monociti primari CD 14 positivi purificati da pbmc.

Questi grafici a dispersione mostrano monociti positivi CD 14 in presenza di nanoparticelle di biossido di silicio di Fitz. L'istogramma illustra la quantificazione delle cellule fitzy positive espresse come intensità di fluorescenza. Esperimenti di internalizzazione simili sono stati eseguiti con monociti TP one trattati con concentrazioni crescenti di nanoparticelle di biossido di silicio di Fitz con cellule non trattate come controllo negativo.

I dot plot illustrano l'aumento dose-dipendente dello scattering laterale con uno scattering diretto invariato nella linea cellulare TP one dopo l'internalizzazione delle nanoparticelle. I dati di questi grafici suggeriscono che il trattamento con le nanoparticelle di biossido di silicio di Fitz induce un'internalizzazione dose-dipendente nei monociti, evidenziata dal miglioramento della granularità intracellulare per ottenere ulteriori informazioni sulle interazioni tra cellule immunitarie e nanoparticelle, le microglia sono state coltivate per sette giorni in vitro e incubate con nanoparticelle per un'ora. La microscopia a fluorescenza ha indicato una coltura mista di cellule gliali primarie con un gran numero di astrociti GFP negativi non aderenti e alcune cellule GFP positive.

In questo esperimento rappresentativo, tre sottopopolazioni gliali possono essere distinte mediante citometria a flusso, con una singola colorazione anticorpale CD 11 B, CD 11 B, astrociti negativi GFP negativi e altre cellule gliali, cellule microgliali CD 11 B positive GFP negative e una sottopopolazione CD 11 B positiva per GFP. Le ultime due sottopopolazioni sono in grado di internalizzare nanoparticelle con un deficit leggermente aumentato dalla popolazione GFP positiva. L'internalizzazione delle nanoparticelle può essere ulteriormente verificata mediante microscopia confocale, come dimostrato in questa immagine utilizzando nanoparticelle di biossido di silicio a bastoncino domine.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere i campioni al buio per evitare lo sbiancamento dei coloranti fluorescenti e di mantenere i campioni a quattro gradi durante l'incubazione degli anticorpi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia confocale per rispondere a ulteriori domande sulla localizzazione intracellulare delle nanoparticelle.