Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le interazioni tra nanoparticelle fluorescenti e sottopopolazioni primarie di cellule immunitarie mediante citometria a flusso. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto le cellule di interesse con le nanoparticelle. Nel passaggio successivo, le cellule vengono marcate con un anticorpo contro marcatori superficiali specifici per le cellule e quindi analizzate mediante citometria a flusso.

Infine, è possibile misurare l'interazione delle nanoparticelle con singole popolazioni di cellule immunitarie. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia, è che con questo approccio è possibile quantificare le variazioni delle intensità di fluorescenza indotte dalle nanoparticelle in popolazioni cellulari non aderenti. Per l'internalizzazione delle nanoparticelle nei leucociti del sangue o in monociti purificati, iniziare seminando cinque volte 10 alla quinta delle cellule di interesse in un millilitro per pozzetto, in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Quindi aggiungere 10 microlitri di sospensione lavorativa appena preparata di nanoparticelle fluorescenti di biossido di silicio in ciascun pozzetto sperimentale, aggiungendo contemporaneamente un volume equivalente di mezzo completo nei pozzetti di controllo non trattati. Dopo un'ora di internalizzazione a 37 gradi Celsius, trasferire i campioni in singole provette polipropileniche da 1,5 millilitri, quindi centrifugare i campioni per tre minuti a 6.000 × g e a temperatura ambiente per colorare le cellule con CD14 mediante incubazione blu: incubare 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare con 10 microlitri dell'anticorpo umano in rapporto 1:11 in buffer di lavaggio per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato l'anticorpo non legato con un millilitro di buffer di lavaggio, risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer di lavaggio fresco per l'analisi mediante citometria a flusso.

Successivamente, per configurare la compensazione del riverbero spettrale, aprire la finestra delle impostazioni dello strumento nel software di citometria a flusso, quindi acquisire un campione privo di nanoparticelle e non marcato con anticorpi a bassa velocità fluidica. La regolazione delle impostazioni di compensazione in presenza di nanoparticelle fluorescenti rappresenta la parte più delicata della procedura, poiché le nanoparticelle possono interferire con lo scattering laterale; per garantire il successo, è necessario definire manualmente una finestra della popolazione cellulare di interesse. Regolare manualmente lo scattering anteriore e laterale agendo sui canali di voltaggio. Quindi tracciare una finestra adeguatamente ampia intorno alla popolazione cellulare desiderata.

Caricare un altro campione non marcato e aprire la scheda di compensazione nella finestra delle impostazioni dello strumento. Regolare il fattore di compensazione durante l'acquisizione finché l'intensità di fluorescenza nel canale di spillover non risulti approssimativamente uguale per le popolazioni positive e negative al fluorocromo. Infine, dopo aver regolato la compensazione per ciascun tubo di controllo marcato con un singolo fluorocromo, leggere i campioni trattati con nanoparticelle al fine di caratterizzare meglio il comportamento dei globuli bianchi in risposta alle nanoparticelle; sono stati quindi eseguiti saggi di internalizzazione come appena dimostrato.

Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, tre sottopopolazioni principali di leucociti del sangue sono state chiaramente identificate mediante dispersione della luce in avanti e laterale dopo l'isolamento dei PBMC. Inoltre, dopo il trattamento con biossido di silicio fz, linfociti, monociti e granulociti hanno mostrato tassi diversi di internalizzazione delle nanoparticelle, come indicato dalla loro intensità di fluorescenza. In queste immagini, l'internalizzazione delle nanoparticelle è dimostrata nei monociti primari positivi per CD14 purificati da PBMC.

Questi diagrammi a dispersione mostrano i monociti positivi per CD14 in presenza di nanoparticelle di biossido di silicio di fitz. L'istogramma illustra la quantificazione delle cellule positive a fitzy espresse come intensità di fluorescenza. Sono stati eseguiti esperimenti di internalizzazione simili con monociti TP1 trattati con concentrazioni crescenti di nanoparticelle di biossido di silicio di fitz, utilizzando cellule non trattate come controllo negativo.

I diagrammi a punti illustrano un aumento dipendente dalla dose nello scattering laterale con uno scattering anteriore invariato nella linea cellulare TP1 dopo l'internalizzazione delle nanoparticelle. I dati provenienti da questi grafici suggeriscono che il trattamento con nanoparticelle di biossido di silicio di Fitz induce un'internalizzazione dipendente dalla dose nei monociti, evidenziata dall'aumento della granulosità intracellulare. Per ottenere ulteriori informazioni sulle interazioni tra cellule immunitarie e nanoparticelle, le microglia sono state coltivate per sette giorni in vitro e incubate con le nanoparticelle per un'ora. La microscopia a fluorescenza ha indicato una coltura primaria mista di cellule gliali con un elevato numero di astrociti non aderenti GFP-negativi e alcune cellule GFP-positive.

In questo esperimento rappresentativo, tre sottopopolazioni gliali possono essere distinte mediante citometria a flusso utilizzando un singolo anticorpo anti-CD11B che marca CD11B, astrociti GFP negativi negativi per CD11B e altre cellule gliali, cellule microgliali CD11B positive e GFP negative, e una sottopopolazione CD11B positiva e GFP positiva. Le ultime due sottopopolazioni sono in grado di internalizzare nanoparticelle, con una leggera maggiore efficienza da parte della popolazione GFP positiva. L’internalizzazione delle nanoparticelle può essere ulteriormente verificata mediante microscopia confocale, come dimostrato in questa immagine che utilizza nanoparticelle di biossido di silicio a forma di bastoncello.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere i campioni al buio per evitare lo sbiancamento dei coloranti fluorescenti e di conservare i campioni a quattro gradi durante l'incubazione con l'anticorpo. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la microscopia confocale possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo la localizzazione intracellulare delle nanoparticelle.