Name: Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Scopri come rilevare l'interazione di nanoparticelle fluorescenti con sottopopolazioni di cellule immunitarie primarie mediante citometria di flusso. Questo metodo consente di quantificare l'internalizzazione in linfociti, monociti e granulociti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Gli autori vorrebbero riconoscere Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Germania) per la sponsorizzazione di questo manoscritto, Dott. Paolo Petrucciani (Dipartimento di Immuno-ematologia e Servizio Trasfusionale, Ospedale Lotti Pontedera, Pisa, Italia) per la fornitura di buffy coats umane e Prof. Massimo Pasqualetti (Dipartimento di Biologia - Unità di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Università di Pisa, Pisa, Italia) per l&#39;alloggiamento della colonia mouse.

DICHIARAZIONE ETICA Campioni umani e animali sono stati trattati seguendo le linee guida del Ministero della Salute italiano, la legge 116/92 e della Direttiva Comunità Europea del Consiglio 86/609/CEE. 1. Culture Monocita cellulari <ol><li> Cultura umana THP-1 in cellule T-75 beute contenenti terreno RPMI-1640 integrato con 10% di siero umano, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanolo a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Culture Split quando confluenti (ogni 3-5 giorni). </li></ol> 2. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da Buffy Coats <ol><li> Prima di iniziare il protocollo di isolamento, preparare una soluzione di tampone fosfato (PBS) pH 7,2, 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% di siero albumina bovina (BSA), aggiungendo 5 ml BSA Stock Solution a 95 ml di risciacquo tampone (1: 20 diluizione). Degassarla buffer e mantenerlo freddo (2-8° C). IMPORTANTE: la mancata Degas buffer può provocare in meno rispetto ottimali risultati perché bolle possono bloccare la colonna di isolamento (vedere il punto 3.2). Nota: anticoagulante citrato destrosio formula-A (ACD-A) o destrosio fosfato citrato (CPD) può essere utilizzato in alternativa. Al contrario, altre proteine ​​albumina o sieri ottenuti da altre specie possono sostituire BSA. Non usare tamponi contenenti Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Ottenere buffy coats da donatori sani (età 20-60 anni). </li><li> Preparare 50 ml provette coniche per la densità centrifugazione in gradiente. Determinare il numero di tubi necessari per l&#39;elaborazione del sangue (ogni tubo può elaborare 35 ml di sangue diluito) e aggiungere 15 ml di Ficoll-Paque a ciascuna provetta vuota. </li><li> Diluire 8 ml di sangue con 24 ml di PBS / BSA soluzione / EDTA (1:4 diluizione). </li><li> Strato accuratamente la soluzione diluita in cima Ficoll-Paque (densità = 1.077 g / ml) in ciascuna delle 50 ml provette coniche. Non mescolareil sangue e Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Per evitare la miscelazione del sangue e Ficoll-Paque, tenere il tubo ad angolo di 45 ° e sovrapporre la miscela sangue lentamente. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 min a 4 ° C. Le cellule mononucleate (MNC) rimarranno all&#39;interfaccia plasma Ficoll-Paque, considerando che i granulociti ed eritrociti sedimenti a causa della maggiore densità alla pressione osmotica del Ficoll-Paque. </li><li> Trasferire le cellule in interfase (Le cellule mononucleate del sangue, PBMC) in un tubo da 50 ml riempito con PBS / BSA / EDTA e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Lavare il pellet due volte con PBS / BSA / EDTA per rimuovere le piastrine. Spin a 200 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Cultura le cellule in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10% o procedi alla monociti depurazione. </li></ol> 3. Purificazione di primaria monociti da PBMC <ol><li> Isolare monociti da PBMC mediante separazione magnetica tallone utilizzando Humun Pan Kit di isolamento dei monociti: <ol><li> Passare cellule attraverso una maglia di 30 micron di nylon (filtri preseparazione, 30 micron) per rimuovere eventuali grumi di cellule. </li><li> Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone PBS / EDTA / BSA per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 10 ml FcR Reagente Bloccante per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 10 ml di cocktail biotina-anticorpo per 10 7 cellule totali. </li><li> Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 2-8 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 20 ml di anti-biotina microsfere per 10 7 cellule totali. </li><li> Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 2-8 ° C. </li><li> Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li> SEPAR magneticazione <ol><li> Di conseguenza il numero totale delle cellule, scegliere una colonna MACS appropriato e MACS separatore (vedi MACS colonna datasheet). </li><li> Posizionare la colonna nel campo magnetico del separatore MACS. </li><li> Preparare colonna sciacquando con la giusta quantità di tampone PBS / EDTA / BSA (colonne MS: 500 microlitri; colonne LS: 3 ml). Nota: Le colonne sono &quot;Arresto flow&quot; e non funzionare a secco. </li><li> Applicare sospensione cellulare sulla colonna. Raccogliere flow-through contenente cellule senza etichetta, che rappresenta la frazione di monociti arricchito. </li><li> Lavare colonna 3x con tampone PBS / EDTA / BSA (500 microlitri per MS e 3 ml per LS a lavaggio). </li><li> Raccogliere le cellule senza etichetta che passano attraverso, in rappresentanza dei monociti arricchiti, e aggiungere al flusso continuo dalla sezione 3.2.4. Nota: Lavare la colonna con l&#39;aggiunta di PBS / EDTA / BSA aliquote tampone solo quando il serbatoio colonna è vuota. </li><li> (Facoltativo) Elimina colonna dalseparatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adatto. Pipettare il tampone nella colonna (colonne MS: 1 ml; colonne LS: 5 ml). Sciacquare immediatamente le cellule nonmonocyte marcate magneticamente saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna. </li><li> Culture purificato monociti in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10%. </li></ol></li></ol> 4. Purificazione di primaria monociti da sangue intero <ol><li> Purificare monociti dal sangue intero utilizzando intero kit di isolamento dei monociti di sangue seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Nanoparticelle internalizzazione nel sangue leucociti e purificata monociti <ol><li> Tavola 5 x 10 5 cellule / ml (1 ml / pozzetto) dei PBMC isolati o le purificati monociti CD14 positivi in un 12-pozzetti. </li><li> Vortex FITC-SiO soluzione stock 2 nanoparticelle e risospendere in mezzo completo ad una concentrazione di lavoro di 100 nm. </li><li> Aggiungere 10 ml di nanop lavoraresospensione articolo (100 nM) per i campioni trattati per raggiungere una nanoparticella concentrazione finale di 1 nm. Aggiungere lo stesso volume di terreno completo per controlli non trattati in ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 1 ora internalizzazione raccogliere i campioni in una provetta di polipropilene da 1,5 ml e si centrifuga per 3 min a 6000 xga RT. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di tampone di corsa 3 min a 6000 xga RT. </li><li> Risospendere il pellet in 200 ml di tampone di corsa. Le cellule sono ora pronti per la lettura mediante citometria di flusso. </li></ol> 6. Isolamento dei primari Culture gliali miste (Vedi Bertero et al. 7) 7. Replating una cultura cellule gliali Confluent misto <ol><li> Lavare un pallone T-75 una volta con 10 ml di PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), quindi aggiungere 10 ml di Versene e incubare a 37 ° C per 5-7 min. </li><li> Pipettare il supernatante su e giù diverse volte per staccare le cellule dalla superficie T-75 e sciogliereaggregati cellulari. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polipropilene da 15 ml. Raccogliere una piccola quantità di sospensione cellulare per contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Centrifugare la sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ad una concentrazione finale di 5 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura completo gliale. </li><li> Piatto 0,5 ml / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e lasciare che le cellule accontentarsi di 2-4 ore prima del trattamento delle nanoparticelle. </li></ol> 8. Nanoparticelle internalizzazione in Microglia <ol><li> Aggiungere 500 ml di mezzo completo di coltura gliale (per controlli non trattati) o 500 ml di una sospensione 2x rodamina-SiO 2 nanoparticelle in mezzo completo di coltura gliale (per campioni trattati) a ciascun pozzetto. </li><li> Pipettare le cellule per permettere il distacco delle cellule nonrapid-aderente ai punti di tempo prescelti e raccoglierli in tubi di polipropilene 2 ml. </li><li> Aggiungere 500 microlitridi Versene a ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 37 ° C per 5 min, quindi staccare la frazione di cellule rimanenti e raccogliere ogni campione con le corrispondenti cellule nonadhering del passo precedente. </li><li> Centrifugare i campioni per 3 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml di AutoMACS tampone di corsa. </li></ol> 9. Colorazione con CD11b-VioBlue <ol><li> Aggiungere 10 ml di VioBlue-CD11b anticorpo umano / mouse per 100 ml di sospensione cellulare (01:11 ratio) in tampone di corsa e incubare 10 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di corsa e miscelare la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare ogni campione per 3 min a 300 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100-150 ml di tampone di corsa. </li><li> Leggere i campioni al citometro (conservare i campioni a 4 ° C tra gli ultimi due passaggi). IMPORTANTE: prima di analizzare i campioni, procedere alla compensazione dei segnali sovrapposti iGli spettri di emissione n osservata tra i diversi fluorocromi (nanoparticelle o anticorpi fluorocromo coniugato). </li></ol> 10. Spill Spectral Oltre Compensation <ol><li> Aprire il dialogo &quot;Impostazioni dello strumento&quot; (presente in tutti i programmi software strumento). Nota: Se si utilizza uno strumento diverso da quello riportato nella tabella Materiale, fare riferimento al manuale specifico strumento per i particolari di acquisizione. </li><li> Acquisire campione non trattato (senza nanoparticelle) a bassa velocità fluido (se consentito dallo strumento). Durante l&#39;acquisizione, regolare manualmente l&#39;ora e la dispersione laterale (FSC e SSC, rispettivamente) regolando i canali di tensione. Nota: Modificare le scale degli assi SSC e FSC per visualizzare al meglio la popolazione cellulare completo nella trama. Una impostazione di template per ogni tipo di cellula di interesse strumento può essere creato, salvata e utilizzata per future acquisizioni. </li><li> Aprire la specificaScheda &quot;regione&quot; nel software. Disegnare una regione grande appropriata (&quot;gate&quot;) in giro per la popolazione desiderata. Nota: internalizzazione delle nanoparticelle induce uno spostamento SSC delle cellule. Se il cancello è troppo strettamente limitato intorno alla popolazione di cellule, i dati acquisiti saranno probabilmente perdere parte delle cellule da rilevare. </li><li> Utilizzare due campioni non colorati, uno per l&#39;uso come campione in bianco e una per risarcimento contro PI colorazione (opzionale), un campione unico tinto con il fluorocromo appropriata per ogni canale di fluorescenza di essere risarciti. Nota: utilizzare un diverso tubo campione 1,5 ml per ciascuna di anticorpi coniugati da utilizzare nell&#39;etichettatura esperimento. </li><li> Aprire la scheda &quot;compensazione&quot; nella casella &quot;Impostazioni strumento&quot;. Aumentare o diminuire il fattore di compensazione in sede di acquisizione fino a quando l&#39;intensità di fluorescenza nel canale spillover è più o meno lo stesso per la pos fluorocromoitive e la popolazione negativo. </li><li> Acquisire campioni di nanoparticelle trattati dopo la compensazione è stata regolata. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che Miltenyi Biotech GmbH ha sponsorizzato la presentazione di questo manoscritto. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) è una nanotecnologia spin off azienda nata da IIT.

Il protocollo sperimentale presenta punti molto importanti da prendere in considerazione. E &#39;molto importante lavorare a 4 ° C (su ghiaccio) e possibilmente al buio durante tutte le fasi di colorazione, in quanto temperature più elevate e le luci possono influenzare negativamente la resa colorazione. Le nanoparticelle potrebbero essere sonicati essere meglio risospeso prima dell&#39;uso. Una corretta analisi di citometria a flusso richiede una corretta calibrazione dei diversi canali. La calibrazione dello strumento deve essere eseguita prima di ogni sessione sperimentale. Oltre a problemi tecnici con la strumentazione, ci possono essere anche problemi con l&#39;etichettatura degli anticorpi. È obbligatorio utilizzare l&#39;anticorpo in una concentrazione appropriata. Se la concentrazione è troppo alta o troppo bassa, intensità di segnale insoddisfacenti possono essere la conseguenza. Gli svantaggi di questa tecnica riguardano la necessità di lavorare con campioni monodispersi, l&#39;impossibilità di localizzare ilsito di origine del segnale (cioè differenti compartimenti cellulari). Ci sono anche alcuni limiti nella scelta di fluorocromi da utilizzare in combinazione: la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e le bande di emissione deve essere separato misura sufficiente a consentire la loro misurazione appropriata. Se gli spettri anticorpo utilizzato sovrappongono, è necessaria una corretta compensazione. La citometria a flusso è un metodo efficace per l&#39;analisi di cellule in presenza o assenza di nanoparticelle. Questa tecnica permette uno studio multiparametrica di una cella, un elevato numero di eventi esaminati, rapidità di analisi (cellule oltre 1.000 / sec), riproducibilità e letture statistici. I campioni possono essere trattati senza perdere la vitalità cellulare. Utilizzando nanoparticelle fluorescente è possibile qualificare e quantificare la loro internalizzazione in sottopopolazioni di cellule, che sono identificati dai marcatori specifici esposti sulla membrana cellulare. Parametri di cella possono cambiare in presenza di s<html> nanoparticelle specifici applicabili. A seconda dello scopo della ricerca, queste variazioni possono essere usate per identificare un fenomeno specifico, come dispersione laterale di cellule che aumenta proporzionalmente con l&#39;aumentare tasso internalizzazione delle nanoparticelle. Modifiche nanoparticelle indotta di superficie cellulare possono anche rappresentare una limitazione della tecnica. Per questo motivo, recettori di membrana fatturato deve essere sempre preso in considerazione ed eventualmente noto in anticipo per caratterizzare con precisione la popolazione di cellule. Menomazioni estreme di membrana ad osmosi in campioni di nanoparticelle sovraccarico può portare alla morte delle cellule. Nanomateriale tossicità dose-dipendente deve essere empiricamente testato per ciascuna popolazione cellulare. Le cellule morte chiaramente definite devono essere esclusi dalla quantificazione della fluorescenza. Per esempio, annessina V / PI colorazione è uno dei diversi metodi generalmente utilizzati per rilevare le cellule sia necrotiche e apoptotici. &quot;&gt; Cellule primarie-GFP che esprimono sono anche un potente strumento per selezionare una determinata sottopopolazione di cellule e raccogliere dati senza prelabeling. L&#39;abbinamento con nanoparticelle fluorescenti complementari permette una quantificazione molto veloce e preciso di interazione cellule-nanoparticelle. Consegna della droga o il gene è pensato per essere migliorata in futuro mediante l&#39;applicazione di nanoparticelle in grado di rilasciare un carico specifico farmaco nei tessuti selezionati. Impiego di nanoparticelle come modulatori specifici vettori di consegna e / o del sistema immunitario per la farmaceutica richiede la conoscenza del contesto biologico (ad esempio attraverso citometria a flusso) per studiare le interazioni cellula-nanoparticelle.

Nanomateriali ingegnerizzati sono oggi ispirano l&#39;interesse degli scienziati di vita per le potenziali applicazioni alla biomedicina 1. Un&#39;ampia varietà di materiali inorganici e organici può essere usato per produrre nanostrutture con differenti forme, fisiche e le caratteristiche chimiche. Tra queste strutture, le nanoparticelle ingegnerizzate di forma sferica hanno dimostrato un grande potenziale per la diagnostica e la medicina traslazionale 2. Il loro core e disegno di superficie sono guidati da una possibile applicazione ed implica un profondo studio delle risposte delle cellule bersaglio in seguito a contatto delle nanoparticelle e l&#39;interazione. Nanoparticelle che si pensa siano deliberatamente somministrato a soggetti umani entreranno in contatto diretto con diversi tipi di cellule immunitarie. La loro responsabilità di mantenere l&#39;integrità del corpo li un tema cruciale di ricerca in nanomedicina 3 fa. La parte cellulare del sistema immunitario innato è rappresentato principalmente da phagociti. Tra questi, il lignaggio monociti / macrofagi cellule derivate, comprese le microglia residenti del sistema nervoso centrale, gioca un ruolo chiave nella difesa immunitaria 4,5. Essi sono in grado di attivare risposte protettive entro poche ore dopo l&#39;incontro con corpi estranei. Inoltre, coordinare le cellule monociti e istruiscono la risposta immunitaria adattativa attraverso il rilascio di citochine. Tutti questi eventi si verificano anche in presenza di materiali ingegnerizzati, ampiamente percepite come &quot;non-sé&quot; dal sistema immunitario 6. Tra i metodi storicamente utilizzati in immunologia per l&#39;analisi cellulare, citometria a flusso rappresenta uno degli strumenti più potenti. Inoltre, la disponibilità di tecnologie per l&#39;identificazione o purificazione di una sottopopolazione immunitaria specifica (spesso sfruttando l&#39;esclusione o la presenza di una proteina di membrana singola) consente un&#39;indagine precisa degli effetti di una certa nanoparticella su quel particolare ce primarioTipo ll 7. Tuttavia, le cellule possono presentare alterazioni fisiologiche e morfologiche dopo l&#39;esposizione alle nanoparticelle. Così, le nanoparticelle possono interferire con parametri ottici specifici, come l&#39;assorbimento o di emissione di luce a lunghezze d&#39;onda definite, influenzando i risultati ottenuti 8. Quindi, devono essere considerati i limiti di impiego e di eventuali adattamenti di classici saggi immunologici per lo studio di nuovi materiali. Questo lavoro riguarda la rilevazione delle interazioni delle nanoparticelle con cellule immunitarie primarie di citometria a flusso. Per risolvere questo problema, 50 nm FITC-SiO 2 nanoparticelle sono stati impiegati come modello nanomateriale per descrivere il metodo. Particelle di silice possono essere prodotti in modo molto preciso nella scala nanometrica. Dimensione, forma, superficie e proprietà, come carica o idrofobia, possono essere finemente sintonizzati per aumentare la loro biocompatibilità 9. Molte caratteristiche di SiO 2 nanoparticelle consentono loro di essere utilizzati comemodello per la consegna della droga particelle 10. Inoltre, tinture fluorescenti o punti quantici possono essere intrappolati o legati a queste particelle che offrono utili nano-strumenti per scopi di imaging 11.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (ATCC modificato)</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina,</td><td>liquido Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo (lotto n&deg; 1131917)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Siero aggregato umano</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue umano e topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-336</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di risciacquo autoMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Tampone da corsa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-747</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Tampone da corsa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento per monociti Human Pan&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>Kit colonna di sangue intero</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-545</td><td></td></tr><tr><td>Sangue intero CD14 MicroBeads, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-879</td><td></td></tr><tr><td>Colonna MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per lisi dei globuli rossi&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di preseparazione 30 &; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer citometro a flusso</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Calibration Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>GEH17544202</td><td></td></tr><tr><td>FITC-SiO2 nanoparticelle (50 nm, +45 mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle di rodamina-SiO2 (50 nm, +45 mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di nanoparticelle fluorescenti interazioni con primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Nanoparticelle ingegnerizzate sono dotate di proprietà molto promettenti per fini terapeutici e diagnostici. Questo lavoro descrive un metodo veloce e affidabile di analisi mediante citometria a flusso per studiare l&#39;interazione delle nanoparticelle con cellule immunitarie. Cellule immunitarie primarie possono essere facilmente purificati da tessuti umani o di topo da isolamento magnetico mediata da anticorpi. In primo luogo, le varie popolazioni cellulari che funzionano in un citometro di flusso possono essere distinti dalla luce avanti sparsi (FSC), che è proporzionale alla dimensione della cella, e la luce laterale diffusa (SSC), in relazione alla cella complessità interna. Inoltre, fluorescente anticorpi contro specifici recettori di superficie consentono l&#39;identificazione di diverse sottopopolazioni all&#39;interno dello stesso campione. Spesso, tutte queste caratteristiche variano a quando le cellule sono potenziati da stimoli esterni che cambiano il loro stato fisiologico e morfologica. Qui, 50 nm FITC-SiO 2 nanoparticelle sono usati come modello per identificare the internalizzazione dei materiali nanostrutturati nelle cellule immunitarie del sangue umano. La fluorescenza delle cellule e l&#39;aumento della luce laterale dispersa dopo incubazione con nanoparticelle ha permesso di definire il tempo e la dipendenza dalla concentrazione di interazione nanoparticelle-cell. Inoltre, tale protocollo può essere esteso per indagare rodamina-SiO 2 nanoparticella interazione con microglia primaria, le cellule nervoso centrale residenti sistema immunitario, isolati da topi mutanti che specificamente esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) nel lignaggio monociti / macrofagi. Infine, citofluorimetria dati relativi a nanoparticelle internalizzazione nelle cellule sono state confermate mediante microscopia confocale.

Citometria a flusso è uno strumento utile per identificare e caratterizzare cellule differenti ed è la tecnica di scelta per identificare le cellule immunitarie specifiche, come monociti, granulociti, cellule T, cellule B, natural killer (NK), cellule dendritiche (DC), e altre sottopopolazioni di leucociti. Nel tentativo di meglio caratterizzare il comportamento globuli bianchi in risposta alle nanoparticelle, abbiamo effettuato saggi di internalizzazione con leucociti primari isolati dal sangue di donatori sani (Figure 1 e 2) e con la linea cellulare di monociti umani (cellule THP-1, Figura 3) . Come riportato in Figura 1, le tre principali sottopopolazioni di leucociti nel sangue sono stati chiaramente identificati da avanti e dispersione laterale dopo l&#39;isolamento PBMC. Inoltre, dopo FITC-SiO 2 trattamento, i linfociti (grigio), monociti (blu) e granulociti (rossi) hanno un diverso nanoparticle tasso di internalizzazione come dimostrato da verde intensità di fluorescenza (Figura 1B). Il protocollo descritto consente la purificazione di CD14 primarie monociti positivi da PBMC. Figura 2A riporta la citometria a flusso dot plot di monociti CD14 + in presenza di FITC-SiO 2. Figura 2B mostra FITC-SiO 2 internalizzazione quantificato nelle stesse cellule ed espressa in istogramma scala logaritmica. Esperimenti di internalizzazione simili sono stati eseguiti su THP-1 monociti trattate con concentrazioni crescenti di FITC-SiO 2 nanoparticelle. Cellule non trattate sono state usate come controllo negativo. Figura 3A mostra un aumento dose-dipendente della dispersione laterale con una dispersione in avanti invariato THP-1 linea cellulare. Nella Figura 3B, insieme con gli istogrammi di SSC e FSC per ogni FITC-SiO 2 nanoparticella concentrazione testata, intensità media di fluorescenza (MFI) quantificazione è presentato. Questi dati suggeriscono che il trattamento con FITC-SiO 2 nanoparticelle induce una interiorizzazione dose-dipendente in monociti evidenziati dalla valorizzazione di granularità intracellulare (scattering laterale) e fluorescenza (canale verde). Per ottenere ulteriori approfondimenti nel tipo di interazione tra cellule immunitarie e nanoparticelle, colture gliali miste primarie sono stati isolati e microglia, le cellule nervoso centrale residenti del sistema immunitario, è stato purificato. L&#39;uso di un modello di topo transgenico che esprime microglia fluorescente verde permette la visualizzazione di diversi meccanismi neuro-infiammatoria. Il topo transgenico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J utilizzata in questo lavoro esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore CX3CR1 12. Dopo 7 giorni in vitro (DIV), microscopia a fluorescenza mostra una cultura gliale primario mescolato con un gran numero di astrociti (GFP cellule aderenti negativos) e alcune cellule verdi (GFP positive, Figura 5A). In questo modello di topo, tre sottopopolazioni gliali possono distinguere mediante citometria a flusso con una sola colorazione CD11b-anticorpo: il primo CD11b - GFP - (astrociti e altre cellule gliali), un secondo gruppo distinto di cellule microgliali CD11b + + GFP, e un terzo CD11b + GFP - sottopopolazione (Figura 4A). Questi ultimi due sottopopolazioni sono entrambi in grado di interiorizzare le nanoparticelle con un lieve aumento di efficienza della GFP + di popolazione (che rappresenta il pattugliamento microglia immaturo per la trascrizione di CX3CR1 promotore), come dimostrato da analisi di citometria a flusso (Figura 4B). L&#39;internalizzazione verificato può essere ulteriormente verificata mediante microscopia confocale utilizzando la stessa concentrazione finale di rodamina-SiO 2 nanoparticelle come illustrato nella Figura 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figura 1. FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in isolati leucociti del sangue. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) contro la dispersione laterale (SSC) citometria a flusso dot plot di Ficoll-Paque isolati leucociti del sangue. B) Fluorescenza verde sovrapposizione istogramma trama dei tre principali leucociti del sangue sottopopolazioni cellulari in presenza di 1 nM FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in CD14 + monociti purificati. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) contro la dispersione laterale (SSC) citometria a flusso dot plot di purificate monociti CD14 positivi. B) Verde fluorescenza istogramma trama della sottopopolazione di monociti purificato in presenza di 1nM FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figura 3. Effetti di FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione su cellule THP-1. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) rispetto scatterin latog (SSC) citometria a flusso dot plot di THP-1 linea di cellule monociti, dopo 1 ora di esposizione di FITC-SiO 2 nanoparticelle crescente concentrazione. B) Variazione concentrazione-dipendente della dispersione laterale (SSC), avanti di scattering (FSC) e verde fluorescenza in presenza di FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figura 4. Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in microglia primaria isolato dal B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J topi. A) Verde proteina fluorescente (GFP) rispetto CD11b-VioBlue citometria a flusso dot plot di primary glia mista isolato da B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J topi. CD11b + GFP + e CD11b + GFP - le popolazioni sono riportati in alto a destra e inferiore quadranti di destra, rispettivamente, B) fluorescenza rossa sovrapposizione istogramma terreno di sottopopolazioni microglia in presenza di 1 nm Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per il 30. min (istogramma rosso) rispetto al controllo (istogramma grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figura 5. Visualizzazione della GFP +-microglia. (A) microscopia a fluorescenza a 7 DIV e (B) Microscopia confocaledi Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione (frecce rosse) in GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Analisi delle interazioni delle nanoparticelle con sottopopolazioni di cellule immunitarie definite mediante citometria di flusso.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le interazioni tra nanoparticelle fluorescenti e sottopopolazioni primarie di cellule immunitarie mediante citometria a flusso. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto le cellule di interesse con le nanoparticelle. Nel passaggio successivo, le cellule vengono marcate con un anticorpo contro marcatori superficiali specifici per le cellule e quindi analizzate mediante citometria a flusso.Infine, è possibile misurare l'interazione delle nanoparticelle con singole popolazioni di cellule immunitarie. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia, è che con questo approccio è possibile quantificare le variazioni delle intensità di fluorescenza indotte dalle nanoparticelle in popolazioni cellulari non aderenti. Per l'internalizzazione delle nanoparticelle nei leucociti del sangue o in monociti purificati, iniziare seminando cinque volte 10 alla quinta delle cellule di interesse in un millilitro per pozzetto, in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.Quindi aggiungere 10 microlitri di sospensione lavorativa appena preparata di nanoparticelle fluorescenti di biossido di silicio in ciascun pozzetto sperimentale, aggiungendo contemporaneamente un volume equivalente di mezzo completo nei pozzetti di controllo non trattati. Dopo un'ora di internalizzazione a 37 gradi Celsius, trasferire i campioni in singole provette polipropileniche da 1,5 millilitri, quindi centrifugare i campioni per tre minuti a 6.000 × g e a temperatura ambiente per colorare le cellule con CD14 mediante incubazione blu: incubare 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare con 10 microlitri dell'anticorpo umano in rapporto 1:11 in buffer di lavaggio per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato l'anticorpo non legato con un millilitro di buffer di lavaggio, risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer di lavaggio fresco per l'analisi mediante citometria a flusso.Successivamente, per configurare la compensazione del riverbero spettrale, aprire la finestra delle impostazioni dello strumento nel software di citometria a flusso, quindi acquisire un campione privo di nanoparticelle e non marcato con anticorpi a bassa velocità fluidica. La regolazione delle impostazioni di compensazione in presenza di nanoparticelle fluorescenti rappresenta la parte più delicata della procedura, poiché le nanoparticelle possono interferire con lo scattering laterale; per garantire il successo, è necessario definire manualmente una finestra della popolazione cellulare di interesse. Regolare manualmente lo scattering anteriore e laterale agendo sui canali di voltaggio. Quindi tracciare una finestra adeguatamente ampia intorno alla popolazione cellulare desiderata.Caricare un altro campione non marcato e aprire la scheda di compensazione nella finestra delle impostazioni dello strumento. Regolare il fattore di compensazione durante l'acquisizione finché l'intensità di fluorescenza nel canale di spillover non risulti approssimativamente uguale per le popolazioni positive e negative al fluorocromo. Infine, dopo aver regolato la compensazione per ciascun tubo di controllo marcato con un singolo fluorocromo, leggere i campioni trattati con nanoparticelle al fine di caratterizzare meglio il comportamento dei globuli bianchi in risposta alle nanoparticelle; sono stati quindi eseguiti saggi di internalizzazione come appena dimostrato.Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, tre sottopopolazioni principali di leucociti del sangue sono state chiaramente identificate mediante dispersione della luce in avanti e laterale dopo l'isolamento dei PBMC. Inoltre, dopo il trattamento con biossido di silicio fz, linfociti, monociti e granulociti hanno mostrato tassi diversi di internalizzazione delle nanoparticelle, come indicato dalla loro intensità di fluorescenza. In queste immagini, l'internalizzazione delle nanoparticelle è dimostrata nei monociti primari positivi per CD14 purificati da PBMC.Questi diagrammi a dispersione mostrano i monociti positivi per CD14 in presenza di nanoparticelle di biossido di silicio di fitz. L'istogramma illustra la quantificazione delle cellule positive a fitzy espresse come intensità di fluorescenza. Sono stati eseguiti esperimenti di internalizzazione simili con monociti TP1 trattati con concentrazioni crescenti di nanoparticelle di biossido di silicio di fitz, utilizzando cellule non trattate come controllo negativo.I diagrammi a punti illustrano un aumento dipendente dalla dose nello scattering laterale con uno scattering anteriore invariato nella linea cellulare TP1 dopo l'internalizzazione delle nanoparticelle. I dati provenienti da questi grafici suggeriscono che il trattamento con nanoparticelle di biossido di silicio di Fitz induce un'internalizzazione dipendente dalla dose nei monociti, evidenziata dall'aumento della granulosità intracellulare. Per ottenere ulteriori informazioni sulle interazioni tra cellule immunitarie e nanoparticelle, le microglia sono state coltivate per sette giorni in vitro e incubate con le nanoparticelle per un'ora. La microscopia a fluorescenza ha indicato una coltura primaria mista di cellule gliali con un elevato numero di astrociti non aderenti GFP-negativi e alcune cellule GFP-positive.In questo esperimento rappresentativo, tre sottopopolazioni gliali possono essere distinte mediante citometria a flusso utilizzando un singolo anticorpo anti-CD11B che marca CD11B, astrociti GFP negativi negativi per CD11B e altre cellule gliali, cellule microgliali CD11B positive e GFP negative, e una sottopopolazione CD11B positiva e GFP positiva. Le ultime due sottopopolazioni sono in grado di internalizzare nanoparticelle, con una leggera maggiore efficienza da parte della popolazione GFP positiva. L’internalizzazione delle nanoparticelle può essere ulteriormente verificata mediante microscopia confocale, come dimostrato in questa immagine che utilizza nanoparticelle di biossido di silicio a forma di bastoncello.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere i campioni al buio per evitare lo sbiancamento dei coloranti fluorescenti e di conservare i campioni a quattro gradi durante l'incubazione con l'anticorpo. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la microscopia confocale possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo la localizzazione intracellulare delle nanoparticelle.

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