Name: Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri un metodo semi-automatizzato per isolare e quantificare esosomi dal sangue umano mediante analisi NTA. Questa tecnica ottimizzata consente misurazioni precise delle dimensioni e della concentrazione delle vescicole.

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Gli autori ringraziano Christina Ballázs, Hug Aubin e Jörn Hülsmann per la lettura critica del manoscritto e l'eccellente assistenza editoriale. Inoltre, gli autori ringraziano Gisela Mueller per l'assistenza tecnica. Gli autori ringraziano Particle Metrix GmbH per aver fornito i fondi che coprono i costi di pubblicazione.

NOTA: Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati approvati dal Consiglio etico istituzionale dell&#39;Università di Dusseldorf. 1. Exosome Preparazione <ol><li> Raccogliere il sangue intero in 3 tubi citrato via venipuntura (totale di 9 ml). Versare il sangue in una provetta Falcon 15 ml. </li><li> Centrifugare il campione a 1500 xg per 20 min a 4 ° C per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferire il surnatante in una nuova provetta falco 15 ml. </li><li> Centrifugare il campione a 2.800 xg per 20 min a 4 ° C per rimuovere tutte le cellule dal plasma (plasma privo di cellule; CFP). Trasferire il PCP ai tubi ultracentrifugazione, 1 ml per provetta. </li><li> Centrifugare a 100.000 xg per 90 min a 4 ° C per esaurire esosomi. Togliere 900 ml di surnatante. Risospendere il pellet in restanti 100 microlitri nel tubo ultracentrifugazione. Aggiungere 900 microlitri PBS. </li><li> Centrifugare nuovamente a 100.000 xg per 30 min a 4 ° C. Togliere 900 ml di supernatant. Risospendere il pellet con i restanti 100 ml. </li><li> Trasferimento 5 a 20 ml di risospensione in 40 ml di acqua distillata. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 450 nm per separare exosomes da particelle più grandi. Con tale sospensione finale di misura delle particelle. </li></ol> 2. Procedura di avvio del Particle strumento di monitoraggio <ol><li> Avviare il programma facendo doppio clic sul software-icon. Clicca sulle varie schede software (&quot;Cell Check&quot;, &quot;misura&quot;, &quot;Analisi&quot;) per passare tra di loro in tutto il protocollo. </li><li> Seguire le istruzioni sullo schermo per un&#39;implementazione automatica della procedura di avvio. Selezionare le caselle di controllo, sia per la qualità delle cellule e l&#39;allineamento automatico. NOTA: Uno di questi passaggi può essere ripetuta a parte, se necessario, il tasto (A) o (B) Premendo la linguetta &quot;Controllo delle celle&quot;. </li><li> Aprire l&#39;ingresso e la porta di uscita dello strumento NTA e iniettare 10 ml acqua distillata dalla siringa nel canale della cella attraverso la porta di ingresso. Chiudere la luce di uscita come ultima quantità di acqua viene iniettata. Collocare un bicchiere sotto la luce di uscita per raccogliere soluzione di scarto. Assicurarsi che la cella di misura è priva di bolle d&#39;aria e non siringa bolle d&#39;aria nel sistema. Chiudere immediatamente la porta di ingresso. </li><li> Eseguire il controllo di qualità cella facendo clic su &quot;OK&quot;. Il software visualizza i risultati qualitativi cella dopo pochi secondi. </li><li> Se le particelle sono ancora visualizzati nella schermata live-view del software o se il risultato del controllo qualità è solo buona o cattiva, ripetere il punto 2.3 fino a quando le particelle rimanenti vengono rimossi dalla cella di misura. Ripetere anche il punto 2.3 dopo ogni misura per evitare l&#39;accumulo di particelle. Se ripetendo l&#39;iniezione di acqua distillata e controllo delle cellule non produce un risultato &quot;buono&quot;, procedere alla 2.9. </li><li> Preparare una sospensione di controllo contenente uniforme 200 pol nm dimensioniparticelle ystyrene da utilizzare per allineare i fuochi del laser e microscopio. Aggiungere una goccia della sospensione concentrata, fornita dal costruttore dello strumento, a 500 ml di acqua distillata per ottenere la concentrazione richiesta tale che 600 ± 100 particelle vengono visualizzati per schermo nel live-view. </li><li> Iniettare la sospensione allineamento nello strumento NTA come descritto al punto 2.3. Premere &quot;OK&quot; per avviare l&#39;allineamento automatico, una routine automatizzata attraverso il quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi. </li><li> Quando viene visualizzato un prompt che indica il sistema ora è pronto per esperimenti, fate clic su OK per avviare la misurazione. </li><li> Occasionalmente, pulire il canale della cella manualmente tra esperimenti svuotando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software viene visualizzato un rapporto di errore automatica. </li></ol> 3. Misurazione del campione <ol><li> Lavare il canale con acqua distillata prima eamisurazione del campione ch (come descritto nel passaggio 2.3). </li><li> Iniettare la sospensione exosome (preparata al punto 1) per canale, come descritto al punto 2.3. </li><li> Regolare i seguenti parametri principali del software in base alle esigenze: <ol><li> Sensibilità. Al fine di trovare la gamma di sensibilità ottimale, fare clic sul pulsante &quot;numero di particelle vs Sensitivity&quot; per visualizzare una curva per particelle misurate per schermo per diversi livelli di sensibilità. Abbiamo scelto un livello di sensibilità prima della massima pendenza della curva. Un livello maggiore sensibilità permette la visualizzazione di particelle più piccole, ma aumenta anche le questioni relative al rumore di fondo. </li><li> Luminosità minima. Abbiamo scelto una luminosità iniziale di 20 per la misura exosome utilizzare questa funzione come filtro. Regolare questo parametro fino a vuoto con forza le particelle di luce-dispersione. Regolare il basso per amplificare debolmente dispersione artefatti. Variare la luminosità secondo necessità durante l&#39;esperimento. NOTA: Le particelle che leggeriScatter troppo forte sovrapposizione e possono essere esclusi dall&#39;analisi per errore. </li><li> Min e Max Size. Impostare un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e dispersione indesiderata da particelle di grandi dimensioni, regolando la dimensione minima e massima. Utilizzare un intervallo di 10 a 500 pixel per la misurazione di esosomi. </li><li> Shutter. Regolare il periodo di tempo che la fotocamera è aperta a 1/300 sec. </li></ol></li><li> Vivere parametri letti fuori: <ol><li> Passare da una digitale e una vista modus analogico in qualsiasi momento cliccando sul tasto &quot;Live-immagine&quot;. </li><li> Durante l&#39;esperimento, monitorare la barra Intensity dispersione, che visualizza lo stato di saturazione del campione come indicatore colore codificato. Non analizzare exosomes se la barra di dispersione è rossa. In tal caso diluire ulteriormente il campione per evitare questo fenomeno. Se la condizione sperimentale vieta una manipolazione della sospensione del campione, down-regolare la sensibilità o up-regolare la luminosità nel software-smpostazioni per migliorare i risultati della misurazione. NOTA: Quando si analizzano campioni con una altissima concentrazione di particelle della dispersione si fondono singole particelle e sono contati come una singola particella. </li><li> Si noti il ​​numero di particelle contate nel campo visivo dal display. </li></ol></li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Misura&quot;. </li><li> Scegliere le impostazioni della matrice &quot;opzioni di esecuzione&quot;. <ol><li> Prima di ogni acquisizione, selezionare &quot;movimento di controllo &#39;per un controllo ripetuto di prova della deriva delle particelle. Eseguire il test almeno una volta prima di iniziare l&#39;intera analisi. Se la deriva è superiore a 20 um / sec, attendere prima di continuare la misura in modo che il campione non scorre. </li><li> Selezionare il numero di esperimenti (5) e il ritardo di tempo tra loro (0). </li><li> Eseguire un &quot;controllo a campione &#39;, se necessario. Questo test è parte dell&#39;allineamento automatico nella procedura di avvio e può essere ripetuto in seguito come necessario. </li&gt; </ol></li><li> Infine, fare clic sul pulsante &quot;acquisizione video di funzionare&quot;. Nella nuova finestra, definire il numero di cicli (15) e il numero di posizioni di misura (11). NOTA: La testa laser e il microscopio può essere spostato per analizzare il numero di particelle a 11 posizioni diverse. Secondo la richiesta sperimentale, decide se l&#39;esperimento deve essere eseguita su una posizione singola o su posizioni diverse. <ol><li> Confermare la durata minima di tempo una particella deve essere rintracciato da contare come una singola particella, impostando la risoluzione video (basso). Una risoluzione inferiore a una durata più breve inseguimento. </li><li> Selezionare un nome-file e fare clic su &quot;OK&quot; per avviare la misurazione. </li></ol></li></ol> 4. Interpretazione dei risultati <ol><li> Guarda i seguenti risultati ei parametri visualizzati dopo la misurazione sulla scheda &quot;risultati&quot;: (1) il numero totale di particelle tracciato, (2) numero medio di parteicles per la posizione, e (3) la concentrazione di particelle. <ol><li> Visualizzare la tabella media risultato del rapporto numerico delle dimensioni delle particelle (diametro, di superficie e volume) alla percentuale di numeri di particelle, nonché i valori di media e differenziazione standard. </li><li> Utilizzare la tabella di analisi di picco se più di un picco esiste nella analisi grafica. Questa tabella mostra la distribuzione di particelle di dimensioni inferiori al primo o rispettivamente secondo picco. </li></ol></li><li> Guarda il grafico calcolato dopo la misurazione di vedere una distribuzione delle particelle in base alle dimensioni. Utilizzare le icone in modalità di visualizzazione e sopra il grafico per modificare le impostazioni. </li></ol>

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</ol>

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi istituzionali del Dipartimento di Chirurgia Cardiovascolare, Facoltà di Medicina, HHU. I costi di pubblicazione di questo studio sono stati forniti da Particle MetrixGmbH.

Dimostriamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento exosome dal sangue e presente tracciamento nanoparticelle come un romanzo e metodo innovativo per misurare le dimensioni exosome e concentrazione in un fluido biologico. Negli esperimenti presentati sangue periferico umano è stato utilizzato come origine dei esosomi. Tuttavia, altre origini, quali urina, espettorato, supernatante di coltura cellulare, ecc, possono essere utilizzati anche come materiale di prova. Sulla base della variabilità biologica di concentrazione exosome negli esseri umani, test di diversi individui possono caratterizzato da una notevole variabile concentrazione di esosomi. Tuttavia, la concentrazione di particelle nella sonda di test biologico può avere un impatto sui risultati. Pertanto, è necessario un approccio affidabile e standardizzato per la diluizione di sonde. Nel metodo presentato exosome contenente plasma è generato da 9 ml di sangue intero periferico. Utilizzando centrifugazione differenziale passaggi un pellet exosome stato isolato da1 ml di plasma e risospeso in 5 ml di acqua distillata per portare nel campione di lavoro di esosomi sospesi. Questa impostazione predefinita ci ha fornito una corretta concentrazione di particelle, cioè, intensità scatter appropriato durante NTA. Accanto all&#39;aspetto volume e diluizione, la composizione delle soluzioni che vengono utilizzati è anche di importanza. Abbiamo usato l&#39;acqua distillata per la finale risospensione di esosomi. Naturalmente, possono anche essere utilizzati diversi supporti per la fase di diluizione finale, secondo le esigenze del set-up sperimentale. Tuttavia, nel caso di misure potenziali zeta di ionici-solutions, soprattutto nelle prove campioni con una capacità tampone, una diluizione prudente condizioni liberi turbolenza è utile. Per il confronto diretto di più campioni si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni, tranne la sensibilità e la risoluzione video possono essere modificate in seguito utilizzando il software di analisi ZetaView. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Sebbene gli autori ritengono che il sistema introdotto qui rappresenta attualmente lo strumento più idoneo, non è l&#39;unico sistema NTA disponibili. Una serie di studi precedenti hanno impiegato altri sistemi che applicano gli stessi principi NTA ma forniscono un altro disegno strumento che va di pari passo con alcune caratteristiche diverse 10. Riteniamo che gli aspetti pratici relativi alla manipolazione del campione e la riproducibilità dei risultati sono di importanza centrale nella scelta della sequenza metodologica per la valutazione exosome. Riteniamo inoltre che un sistema di rilevamento ideale dovrebbe eliminare i fattori dall&#39;utente a seconda che possono interferire con i risultati delle misurazioni. L&#39;approccio di analisi exosome che viene presentato qui soddisfa il criterio di maneggevolezza per un alto grado. Come ulteriore vantaggio, l&#39;analisi semiautomatica dei campioni viene eseguita in un processo rapido, generando risultati in breve tempo. Una visualizzazione online esosomi aiuta l&#39;analizzatore di gain un&#39;idea istante delle caratteristiche exosome, ad esempio, la concentrazione lordo. Un semplice ma elegante aggiunta alla tecnica di misura qui presentato è l&#39;uso di anticorpo marcato exosomes e la cattura del fascio laser diffusa utilizzando un filtro precedente davanti al rivelatore. In questo modo sottopopolazioni exosome si distinguono in base alla loro antigeni di superficie e altre caratteristiche biologicamente rilevanti tecnicamente accessibili a una colorazione fluorescente selettiva. Uno svantaggio della versione corrente del nostro strumento di monitoraggio delle particelle è il fatto che a livelli molto elevati di sensibilità manufatti come rumore di fondo possono diventare presente, che si basa sulla parete di canale della cella. Una soluzione tecnica e miglioramento del sistema attuale possono essere disponibili in un prossimo futuro. Con questo metodo le riflessioni della luce dispersione laser sulla parete del canale sarà ridotto, aumentando così<html> la precisione dei segnali misurati ei dati ottenuti e l&#39;abbassamento del limite di rilevabilità. Sebbene il protocollo attualmente utilizzato per l&#39;isolamento exosome è ben consolidata e lo strumento particle tracking applicato ha una risoluzione notevolmente preciso con una distribuzione di dimensione inferiore a 30 nm, non c&#39;è garanzia che le particelle rilevate sono infatti del tutto veri exosomes. Altre particelle, come frammenti di cellule morte o grandi complessi proteici possono anche essere presenti nella sospensione exosome e portare a segnali falsi positivi. Un metodo affidabile per cui tale &quot;inquinamento&quot; può essere escluso può essere microscopia elettronica (EM), sia EM trasmissione o scansione EM. Purtroppo, nessun indicatore generale e specifico per esosomi è stato identificato finora, anche se un certo numero di marcatori di superficie proposti in precedenza hanno acquisito una crescente quantità di attenzione, tra cui tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, ecc 11. &quot;&gt; A prescindere dal futuro progresso della ricerca sulla biologia exosome, soprattutto per quanto riguarda gli indicatori specifici exosome, il protocollo che viene qui presentata fornisce un potente metodo per l&#39;isolamento e la rilevazione di esosomi. Concentrazione e dimensioni possono essere facilmente determinato in un assistito software- modo semplice. L&#39;aggiunta di marcatori fluorescenti selettivi o anticorpi fluoroforo accoppiato probabilmente migliorare ulteriormente le possibili applicazioni del metodo presentato di NTA.

L&#39;esatta funzione di exosomes circolanti rimasto sconosciuto per un lungo periodo di tempo. Anche ora il meccanismo percorso completo di esosomi non è del tutto chiaro. Dal esosomi portano antigeni, proteine ​​e RNA (mRNA e miRNA), che li riferisce alla loro cella genitori di origine, la loro funzione come trasmettitori di segnalazione cellula-cellula è principalmente stata data la priorità. Molti metodi differenti sono stati descritti in letteratura per l&#39;isolamento e la determinazione quantitativa di esosomi 1,2. Tuttavia, nessun consenso su un &#39;gold standard&#39; è stato raggiunto. Nel frattempo la maggioranza degli scienziati attivi nel campo della ricerca exosome concordano che un metodo coerente di isolamento è altamente giustificato per raggiungere un grado di comparabilità tra i diversi rapporti e studi più elevato. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è lo strumento più comune e diffusa per l&#39;analisi exosome 3. FACS ha benEFIT che, tramite l&#39;etichettatura di fluorescenza, le cellule di diversa provenienza possono essere confrontati in un solo passo. I principali svantaggi di FACS sono che questo metodo non è abbastanza sensibile per identificare le particelle inferiori a 0,5 micron 4, considerando exosomes sono generalmente compresi tra 30-120 nm di diametro 5, ancor meno per misurare le loro dimensioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono altri strumenti per l&#39;analisi della dimensione delle particelle e la morfologia di esosomi. Tuttavia, sia SEM e TEM hanno lo svantaggio che la preparazione dei campioni è, entrambi i metodi coinvolgono fasi intensità di lavoro che richiede tempo e ciascuno ha un certo rischio di generazione manufatto. Né metodo è adatto per un&#39;elevata produttività e caratterizzazione di diverse migliaia di singole particelle di un campione. Inoltre, un&#39;analisi quantitativa per clinica routine in cui i campioni devono spesso essere analizzati simultaneamente o almeno in un periodo molto breve èdifficile da eseguire. Tecniche di nuova generazione permettono ora di analizzare esosomi senza un intenso lavoro preparatorio prima (SEM esempio, ambientale). Queste tecniche moderne sono ancora piuttosto scomodo per l&#39;analisi di grandi volumi contenenti sospensioni esosomi per determinare il loro numero medio e distribuzione delle dimensioni 6. Un altro metodo molto sensibile per la visualizzazione e l&#39;analisi di esosomi è-nanoparticelle tracciamento analisi (NTA). Questo metodo sfrutta due diversi principi di fisica. In primo luogo, le particelle vengono rilevati dalla luce dispersa quando vengono irradiate con un raggio laser. Il secondo fenomeno è noto come moto browniano, secondo cui la diffusione di particelle differenti in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. In quest&#39;ultimo caso il movimento dipende anche dalla temperatura e dalla viscosità del liquido. Tuttavia, questo tasso è direttamente correlata alla dimensione delle particelle ed è utilizzato da NTA. Utilizzando morbidoanalisi basata-ware, immagini digitali di luce diffusa da singole particelle sono registrati. Piazzole di punti luce sparsi e la loro velocità di movimento forniscono dati che facilitano la determinazione del conteggio particellare totale e distribuzione delle dimensioni. Questa tecnica è particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm. Le dimensioni e la concentrazione misurazioni vengono effettuate con il ZetaView browniano e elettroforesi Motion Video Analysis microscopio. Si tratta di un banco di top nanoparticella strumento di analisi semi-automatico per campioni liquidi (di seguito denominato strumento di monitoraggio di particelle). Consiste dell&#39;analizzatore particle tracking e un computer portatile con il software utilizzato per l&#39;analisi dei dati. Campioni biologici eterogenei sono adatti per questo metodo come sospensioni più omogenei di particelle inorganiche. Un microscopio laser scattering con una videocamera viene utilizzata per il rilevamento di particelle e per la observation del loro movimento. Mentre l&#39;asse orizzontale e microscopio è concentrata nel canale cella riempita con una sospensione contenente esosomi, il raggio laser è orientato verticalmente. Le particelle irradiate dalla dispersione laser la luce, che viene registrata meno di 90 ° da una videocamera digitale attraverso il microscopio (Figura 1). L&#39;intensità della luce diffusa consente l&#39;osservazione di particelle più grandi di 60 nm di diametro. In una tale impostazione di luminosità di una particella non è l&#39;unica indicazione della dimensione delle particelle. Quando viene applicato alcun campo elettrico, il movimento delle particelle segue solo moto browniano e può servire come indicatore per il calcolo delle dimensioni delle particelle. Tuttavia, lo strumento è in grado di applicare un campo elettrico attraverso il canale della cella. Quando sono sottoposti a questo campo, il potenziale, polarità e livello di ionica-carica delle exosomes sospesi diventano ulteriori determinanti della direzione del loro movimento. Velocità e direzione risultato in un mo elettroforeticobilità istogramma. Mentre trovare un metodo ottimale per analizzare exosomes isolato è un problema, un altro sta nella effettiva isolamento di exosomes di diversi mezzi, come sangue, ascite, urina, latte, liquido amniotico o supporto cellulare. Sono stati descritti finora metodi diversi, che si basano su ultracentrifugazione 1, reagenti di separazione industriali (come Exoquick) 7, sfere magnetiche per l&#39;antigene che impiegano la separazione 8 o ultrafiltrazione passi 9. In questo protocollo dimostriamo l&#39;intero processo di isolamento exosome via ultracentrifugazione e mostrare come analizzare il exosome conseguente sospensione contenente attraverso lo strumento di monitoraggio delle particelle. Sono fornite considerazioni specifiche per l&#39;analisi delle medie plasma o coltura cellulare umana esosomi derivati.

<table><tbody><tr><td>Provetta per citrato</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Provetta Falcon</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP Tube, Steril 15 ml</td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifugazione</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Provetta per microfuga Poliallomero 1,5 ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>2,6% Solidi-Latex </td></tr><tr><td>Siringa per soluzione di allineamento (filtro)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td> Siringa <td>da 5 ml</td></tr><tr><td>(ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td> Ago <td>da 5 ml</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD Filtro per aghi di riempimento smussato</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Filtro per siringa, idrofilo, 450 &; m</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotore: 70Ti Ser. No E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Tipo 101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotore: A-4-44</td></tr></tbody></table>

un metodo innovativo per exosome quantificazione e size measurement

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Sebbene l'importanza biologica degli esosomi abbia recentemente guadagnato una crescente attenzione scientifica e clinica, molto è ancora sconosciuto sui loro percorsi complessi, la loro biodisponibilità e le loro diverse funzioni in salute e malattia. Il lavoro attuale si concentra sulla presenza e il comportamento degli esosomi (sia in vitro che in vivo) nel contesto di diversi disturbi umani, in particolare nei campi dell'oncologia, della ginecologia e della cardiologia.
Sfortunatamente, non esiste né un consenso riguardo a un gold standard per l'isolamento degli esosomi, né c'è un accordo su un tale metodo per la loro analisi quantitativa. Poiché esistono molti metodi per la purificazione degli esosomi e anche molte possibilità per la loro analisi quantitativa e qualitativa, è difficile determinare una combinazione di metodi per l'approccio ideale. 
Qui, dimostriamo l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), un metodo semi-automatico per la caratterizzazione degli esosomi dopo l'isolamento dal plasma umano mediante ultracentrifugazione. I risultati presentati mostrano che questo approccio per l'isolamento, così come la determinazione del numero medio e della dimensione degli esosomi, fornisce dati riproducibili e validi, come confermato da altri metodi, come la microscopia elettronica a scansione (SEM).

Il campione utilizzato per questa dimostrazione mostra un ambiente ottimale per la misura con una sensibilità del 85%, prima della massima pendenza della curva di sensibilità (Figura 2). La luminosità, il min / max valori sono stati scelti come raccomandato nel protocollo. Una concentrazione di 5,3 particelle / ml x 10 6 è stata misurata, mentre la dimensione media delle particelle era 0,149 micron, la maggior parte erano 0,137 micron. I valori ricevuti dopo la misurazione possono essere salvati in un report con un formato di file .pdf o come .txt per l&#39;esportazione in un database. Il grafico può essere regolata a piacere, come descritto nel protocollo (sezione 4). La sequenza video viene inoltre memorizzato e può essere utilizzato per più tardi off-line rianalisi. Tuttavia, in tale analisi off-line, le impostazioni pre-acquisizione della fotocamera non possono essere modificate con effetto retroattivo. Per trovare le impostazioni dei parametri ottimali per una misura, noi qui descriviamo the ottimizzazione delle impostazioni dello strumento sulla esempio di un formato di polistirene standard 100 nm. L&#39;influenza di due parametri, sensibilità e min / max dimensioni sull&#39;immagine video e granulometria distribuzione è discusso in dettaglio. Tutti gli altri parametri sono riassunti in Tabella 1. Una impressione visiva dell&#39;impatto della sensibilità (da 50 a 94) sulle immagini analogiche e digitali è visualizzato in Figura 3. Le informazioni quantitative derivate dalle immagini è presentato nella Figura 4, in base alle impostazioni della Tabella 1, Dimensione min = 5 e Max Size = 200. Un tipico rapporto del numero di particelle rilevate vs sensibilità è mostrato in Figura 4A. Tra 50 e 90, il numero di particelle rilevate aumentato con sensibilità e aumentato drammaticamente per sensibilità&gt; 90. È stato trovato un intervallo ottimale di sensibilità tra 66 e 86 (A). Granulometrie ottenuti con difimpostazioni di sensibilità ferenti sono illustrati nella Figura 4B. Le distribuzioni granulometriche rappresentano la media di tre misurazioni individuali. Per troppo bassa sensibilità (sensibilità = 62, curva rossa) sono stati analizzati solo poche particelle causando statistiche piuttosto poveri. Il numero di particelle analizzati aumentata con sensibilità e raggiunto un ottimale tra 70 (curva gialla) e 86 (curva tan). Aumentando ulteriormente il vantaggio sensibilità ad un deterioramento della distribuzione granulometrica con il numero di particelle che cadono e distribuzione dimensionale spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità = 94, curva blu). La figura 4C mostra l&#39;andamento del diametro x50 basato sul numero (50% particelle sono più piccole di questo diametro) in funzione della sensibilità. Nell&#39;intervallo beige, l&#39;RSD delle dimensioni delle particelle è inferiore all&#39;8% e corrisponde all&#39;intervallo ottimale in A. Le regioni rosse indicano RSD&gt; 8% a causa di statistiche poveri (sensibilità troppo bassa) o ampia distributi con spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità troppo alta). Le impostazioni di Dimensione min e Max Size sono filtri applicati alle immagini digitali, al fine di rimuovere le particelle di dimensioni inferiori a pronti Dimensione min e più grandi di Max Size. Grazie alla capacità di diffondere la luce, una particella crea un punto di una certa dimensione in una immagine digitale. La dimensione dello spot è misurato come numero di pixel (px). Quando una particella diffonde la luce molto bene (ad esempio, particelle&gt; 200 nm o inerti), la dimensione del punto è abbastanza grande, ad esempio,&gt; 500 px. La dimensione del punto è piuttosto piccola (ad esempio, &lt;10 px) per le piccole particelle (ad esempio, &lt;20 nm) a seconda del materiale particellare. Dimensioni Spot (px), non può essere scambiato con granulometria (nm), in quanto non sono identici e non vi è alcun rapporto diretto tra queste due variabili. Un&#39;ottimizzazione di Min e Max Size permette all&#39;utente di filtrare gli oggetti indesiderati come agglomerati (Dimensione massima) o piccolooggetti come rumore di fondo (Dimensione min). L&#39;influenza di Min / Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle di dimensioni standard 100 nm è mostrato in Figura 4D (sensibilità = 82). Quando l&#39;intervallo è impostato su piccoli formati in loco (ad esempio, min = 1, max = 52; curva arancione), il numero di particelle analizzate si riduce e il diametro x50 basato numero è leggermente spostata verso dimensioni più piccole. Un ambiente per le macchie più grandi (min = 40, max = 1.000; curva rossa) si traduce in una vasta distribuzione granulometrica spostata verso formati più grandi. Al fine di ottenere la parità di numero totale di particelle, i confini di intervallo delle distribuzioni sia arancione e rosso sono stati adeguati in base 80 particelle. La distribuzione con le impostazioni ottimali (min = 5, max = 200; curva tan) è composto da 360 particelle. Una serie di esperimenti sono stati eseguiti con successo esosomi isolato mediante ultracentrifugazione e misurati da NTA utilizzando il sistema presentato. I dati risultanti erano altamentecoerente e confermato un elevato livello di riproducibilità. Altri metodi di isolamento dovrebbe mostrare risultati simili. Tuttavia, la fase di diluizione è stato identificato come un passo particolarmente critico e il suo impatto sul numero totale calcolato di particelle deve essere rivalutato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del setup della NTA. L&#39;asse microscopio / video e laser sono orientati ortogonalmente tra loro, attraversano la sezione trasversale canale della cella. Luce diffusa dalle particelle viene visualizzato nella finestra &quot;live-view&quot; del software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Numero di particelle vs curva di sensibilità. Il numero di particelle vs curva di sensibilità mostra le particelle in una posizione in un momento durante una scansione automatica della sensibilità. Questa visualizzazione grafica viene utilizzata per determinare le migliori preferenze per le misurazioni iniziali. Un valore di sensibilità viene scelto prima alla massima pendenza del grafico. E &#39;importante ricordare che gli artefatti non sono eliminati in questo esperimento di prova e possono influenzare il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figura 3. Impatto di sensibilità da analogico e digitale delle immagini. Visualizzazione di particelle sullo schermo live view viene visualizzato per sensibilità tra 50 e 94 sia analogica (riga in alto) und vista digitali (fila in basso). Quando la sensibilità è troppo bassa, solo poche particelle vengono rilevati (a sinistra). Alla sensibilità ottimale le particelle appaiono come singoli punti e isolati gli uni dagli altri (al centro). A un relativamente elevati particelle sensibilità si fondono portando ad una scarsa qualità dell&#39;immagine (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figura 4. Influenza delle impostazioni di dimensione max sensibilità min e per un campione di controllo di 100 nm polistirolo particelle (A) Trama di sensibilità in funzione del numero rilevato di particelle.; l&#39;intervallo ottimale è 66-86, prima della massima pendenza della curva. Distribuzioni (B) dimensione delle particelle ottenute con diverse impostazioni di sensibilità (62-94); grafici per troppo bassa (62) o troppo alto (94) sensibilità non catturano la distribuzione delle dimensioni delle particelle per il campione di controllo polistirene 100 nm. (C) Numero basato diametro x50 contro sensibilità; l&#39;errore di x50 nell&#39;intervallo beige è inferiore a 8%, intervallo ottimale è da 66 a 86. (D) Effetto Min e Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle; parametri ottimali (min = 5 e max = 200) catturano la distribuzione corretta per il campione di controllo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Parametri pre-acquisizione </td></tr><tr><td> Sensibilità </td><td> variabile </td></tr><tr><td> Otturatore </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Frame rate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Risoluzione </td><td> Ciaogh </td></tr><tr><td> Cicli </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Più Acquisizioni </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Posizione </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Parametri post-acquisizione </td></tr><tr><td> Min Luminosità </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Size </td><td> variabile </td></tr><tr><td> Min Size </td><td> variabile </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintesi dei parametri pre e post-acquisizione per l&#39;impostazione dello strumento di monitoraggio delle particelle.

In questo articolo viene presentato un metodo per l'isolamento degli esosomi dal sangue intero e un'ulteriore analisi mediante tracciamento di nanoparticelle utilizzando uno strumento semiautomatico. La tecnologia presentata fornisce un metodo estremamente sensibile per la visualizzazione e l'analisi delle particelle in sospensione liquida.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Lo scopo di questa procedura è analizzare gli esosomi in base alle dimensioni e quantificarli mediante un'analisi automatizzata del tracciamento delle nanoparticelle, o strumento NTA. Questo viene ottenuto utilizzando passaggi di centrifugazione differenziale per ottenere un pellet di esosomi dal sangue umano. Gli esosomi vengono risospesi a una concentrazione predeterminata in base alla quantità iniziale di plasma, al fine di ottenere un'intensità di scattering appropriata.Durante l'NTA, la sospensione viene quindi filtrata per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Successivamente, si esegue una calibrazione dello strumento NTA utilizzando una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene di 200 nanometri. La soluzione di esosomi viene quindi iniettata nello strumento NTA e l'impostazione ideale dell'NTA viene selezionata eseguendo un pretest prima di effettuare il test finale.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la quantificazione di tutte le particelle misurate e l'elenco delle particelle in base alle loro dimensioni. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché la soluzione e le impostazioni per ciascuna soluzione di esosomi preparata devono essere eseguite singolarmente per ottenere i migliori risultati. Gli esosomi misurati devono essere a una concentrazione tale per cui la modalità di visualizzazione in tempo reale mostri circa 600 particelle per schermo.Inoltre, deve essere eseguito un test preliminare per determinare il range ottimale di sensibilit&agrave; per la misurazione. Un'impostazione elevata della sensibilit&agrave; consente la visualizzazione di un numero maggiore di particelle piccole, ma aumenta anche i problemi legati ai rumori di fondo. La procedura sar&agrave; dimostrata da Anto May, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare la preparazione degli esosomi, raccogliere il sangue intero in tre provette con citrato mediante venipuntura per un totale di nove millilitri.Quindi versare il sangue in un tubo Falcon da 15 millilitri e centrifugare il campione a 1.500 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferire il sopranatante in un nuovo tubo Falcon da 15 millilitri. Quindi centrifugare nuovamente il campione a 2.800 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere tutte le cellule dal plasma.Trasferire il plasma acellulare o CFP in provette per ultracentrifugazione, utilizzando un millilitro per provetta. Successivamente, centrifugare il CFP a 100.000 ×g per 90 minuti a quattro gradi Celsius per esaurire gli esosomi. Rimuovere 900 microlitri di sopranatante e risospendere il pellet nei rimanenti 100 microlitri all'interno della provetta per ultracentrifugazione.Dopo aver aggiunto 900 microlitri di PBS, centrifugare a 100.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Come in precedenza, rimuovere 900 microlitri del sopranatante e risospendere il pellet con i restanti 100 microlitri. Trasferire da 5 a 20 microlitri della sospensione risospesa in 40 millilitri di acqua distillata.Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 450 nanometri per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Utilizzare questa sospensione finale per la misurazione delle particelle mediante l'uso dello strumento di tracciamento delle particelle. Per prima cosa, avviare il programma facendo doppio clic sull'icona del software.Fare clic sulle diverse schede del software per passare da una all'altra durante il protocollo. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo. Per un'esecuzione automatizzata della procedura di avvio, selezionare le caselle relativa al controllo della qualità delle cellule e all'allineamento automatico.Ognuno di questi passaggi può essere ripetuto separatamente, se necessario, premendo il pulsante A o B nella scheda di controllo della cella. Posizionare un becher sotto il portello di uscita per raccogliere la soluzione di scarto ed evitare di introdurre bolle d'aria nel sistema. Aprire il portello di ingresso e quello di uscita dello strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle (nanoparticle tracking analysis o NTA) e iniettare 10 millilitri di acqua distillata mediante siringa nel canale della cella attraverso il portello di ingresso.Chiudere immediatamente il porto di ingresso e quello di uscita mentre viene iniettata l'ultima quantità di acqua. Assicurarsi che la cella di misura sia priva di bolle d'aria. Eseguire il controllo di qualità della cella facendo clic su Ok.Il software mostrerà il risultato della qualità della cella dopo alcuni secondi; se nella schermata di visualizzazione in tempo reale del software sono ancora visibili particelle, oppure se il risultato del controllo di qualità è solo buono o scadente, ripetere l'iniezione di acqua distale finché le particelle residue non vengono rimosse dalla cella di misura L. Inoltre, ripetere questo passaggio dopo ogni misurazione per evitare l'accumulo di particelle. Successivamente, preparare una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene uniformi, di dimensioni pari a 200 nanometri. Per allineare i fuochi del laser e del microscopio, aggiungere una goccia della sospensione concentrata fornita dal produttore dello strumento a 500 millilitri di acqua distillata, ottenendo la concentrazione richiesta tale da visualizzare 600 ± 100 particelle per schermo nella vista in tempo reale.Iniettare la sospensione di allineamento nello strumento NTA come fatto per la pressa con acqua distillata. È possibile avviare anche l'allineamento, una procedura automatizzata attraverso la quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi. Quando apparirà un messaggio che indica che il sistema è pronto per gli esperimenti, fare clic su ok per iniziare la misurazione.Pulire occasionalmente il canale della cella manualmente tra un esperimento e l'altro, lavando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software visualizza un rapporto automatico di errore. Per eseguire la misurazione del sistema.Per prima cosa, sciacquare il canale con acqua distillata prima di ogni misurazione del campione. Successivamente, iniettare la sospensione di esosomi nel canale. Il passaggio successivo consiste nell'aggiustare i parametri principali nel software per regolare la sensibilità.Trova l'intervallo di sensibilità ottimale facendo clic sul numero di particelle rispetto alla sensibilità per visualizzare una curva con il numero di particelle misurate per schermo a diversi livelli di sensibilità. Scegli un livello di sensibilità precedente alla pendenza massima della curva. Un livello di sensibilità più elevato permette la visualizzazione di un numero maggiore di particelle piccole, ma aumenta anche i problemi legati al rumore di fondo.Per regolare la luminosità minima, scegliere una luminosità iniziale di 20 per la misurazione degli esosomi. Per utilizzare questa funzione come filtro, regolare questo parametro verso l'alto per oscurare le particelle fortemente diffondenti alla luce. Regolarlo verso il basso per amplificare gli artefatti con debole diffusione, modificando la luminosità secondo necessità durante l'esperimento.Successivamente, impostare un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e le particelle di dimensioni eccessive che causano scattering indesiderato. Regolando le dimensioni minima e massima, utilizzare un intervallo compreso tra 10 e 500 pixel per la misurazione degli esosomi. Regolare l'otturatore modificando il tempo di apertura della fotocamera, impostando il valore dell'otturatore su 300, corrispondente a 3,3 millisecondi.Per regolare i parametri della lettura in tempo reale, è possibile passare in qualsiasi momento da una modalità di visualizzazione digitale a una analogica facendo clic sul pulsante dell'immagine in tempo reale. Durante l'esperimento, monitorare la barra dell'intensità di scattering, che mostra lo stato di saturazione del campione tramite un indicatore codificato a colori.Non analizzare gli esosomi se la barra di scattering è rossa. Per iniziare la misurazione, fare clic sulla scheda di misurazione. Selezionare le impostazioni nell'array delle opzioni di esecuzione.Prima di ogni acquisizione, selezionare il controllo del movimento, un test ripetuto per verificare la deriva delle particelle, scegliere il numero di esperimenti e il ritardo temporale tra essi. Eseguire un controllo del campione se necessario. Infine, fare clic sul pulsante per avviare l'acquisizione video.Nella nuova finestra, definire il numero di cicli e il numero di posizioni di misurazione. Confermare la durata minima. Una particella viene tracciata e conteggiata come singola particella.Impostando la risoluzione del video, una risoluzione più bassa comporta una durata minore del tracciamento. Infine, selezionare un nome per il file e fare clic su ok per avviare la misurazione. Il grafico del numero di particelle rispetto alla sensibilità mostra le particelle in una posizione in un determinato momento.Durante una scansione automatica della sensibilità, un valore di sensibilità viene scelto prima del punto di pendenza massima del grafico. Gli artefatti non vengono eliminati in questo esperimento di prova e possono influenzare il grafico. La visualizzazione delle particelle sullo schermo in tempo reale è utile per impostare il valore di sensibilità corretto.Un valore troppo basso porta al rilevamento di poche particelle. Un valore troppo elevato, invece, produce un'immagine di scarsa qualità; al livello ottimale di sensibilità, le particelle di buona qualità appaiono come singoli punti ben isolati l'uno dall'altro. La scheda dei risultati dopo la misurazione consente la lettura dei parametri, tra cui il numero totale di particelle rilevate, il numero medio di particelle per posizione e la concentrazione delle particelle, nonché il rapporto numerico tra la dimensione delle particelle e la percentuale del numero di particelle.Il grafico calcolato dopo la misurazione mostra la distribuzione delle particelle per dimensione. Le icone in modalità visualizzazione possono essere utilizzate per modificare le impostazioni del grafico. Inoltre, esistono diversi metodi per analizzare gli esosomi.Questo metodo illustra un approccio molto semplice ed elegante per eseguire un'analisi simile in un processo rapido, generando risultati in breve tempo. Per confrontare più campioni, si raccomanda di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni, ad eccezione della sensibilità e della risoluzione video, possono essere modificate successivamente utilizzando il software di analisi disponibile.In questo modo, l'analisi comparativa dei dati ottenuti in diversi esperimenti sulla quantità e dimensione degli esosomi diventa disponibile in modo semi-automatico.

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