Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement
17 gennaio 2015
In questo articolo viene presentato un metodo per l'isolamento degli esosomi dal sangue intero e un'ulteriore analisi mediante tracciamento di nanoparticelle utilizzando uno strumento semiautomatico. La tecnologia presentata fornisce un metodo estremamente sensibile per la visualizzazione e l'analisi delle particelle in sospensione liquida.
L'obiettivo di questa procedura è analizzare gli esosomi in base alle loro dimensioni e quantificarli utilizzando un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle o uno strumento NTA attraverso un metodo semi-automatizzato. Ciò si ottiene utilizzando passaggi di centrificazione differenziale per ottenere un pellet di esosoma dal sangue umano. Gli esosomi vengono risospesi a una concentrazione predeterminata per la quantità di plasma iniziale per ottenere l'intensità di dispersione appropriata.
Durante l'NTA, la sospensione viene quindi filtrata per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Successivamente, viene eseguita una calibrazione dello strumento NTA utilizzando una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene di dimensioni 200 nanometriche. La soluzione di esosoma viene quindi iniettata nello strumento NTA e l'impostazione ideale dell'NTA viene selezionata eseguendo un pretest prima di eseguire il test finale.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la quantificazione di tutte le particelle misurate e l'elenco delle particelle in base alle loro dimensioni. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto la soluzione e l'impostazione di ciascuna soluzione di esosoma preparata devono essere eseguite individualmente per ottenere i migliori risultati. Gli esosomi misurati devono essere in una concentrazione I in modo che la modalità live view visualizzi circa 600 particelle per schermo.
Inoltre, è necessario eseguire un pretest per trovare l'intervallo di sensibilità ottimale per la misurazione. Un'elevata impostazione della sensibilità porta alla visualizzazione di particelle più piccole, aumenterebbe anche i problemi relativi ai rumori di fondo. La procedura sarà dimostrata da Anto May, uno studente laureato del nostro laboratorio Per iniziare la preparazione dell'esosoma, raccogliere il sangue intero in tre provette di citrato tramite puntura venosa per un totale di nove millilitri.
Quindi versare il sangue in una provetta Falcon da 15 millilitri, centrifugare il campione a 1.500 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferisci la S nascent in un nuovo tubo Falcon da 15 millilitri. Quindi centrifugare nuovamente il campione a 2.800 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere tutte le cellule dal plasma.
Trasferire il plasma libero da cellule o il CFP in provette per ultracentrifugazione a un millilitro per provetta. Quindi centrifugare la CFP a 100.000 G per 90 minuti a quattro gradi Celsius per esaurire gli esosomi. Rimuovere 900 microlitri di surnatante e risospendere il pellet nei restanti 100 microlitri nella provetta per ultracentrifugazione.
Dopo aver aggiunto 900 microlitri di centrifuga PBS, si guadagna a 100.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Come prima, rimuovere 900 microlitri di agente supino e risospendere i pellet con i restanti 100 microlitri. Trasferire da cinque a 20 microlitri della sospensione di Resus in 40 millilitri di acqua distillata.
Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 450 nanometri per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Utilizzare questa sospensione finale per la misurazione delle particelle per utilizzare lo strumento di tracciamento delle particelle. Innanzitutto, avvia il programma facendo doppio clic sull'icona del software.
Fare clic sulle varie schede del software per passare da una all'altra durante il protocollo. Segui le istruzioni sullo schermo. Per un'implementazione automatizzata della procedura di avvio, selezionare le caselle per il controllo della qualità delle celle e l'allineamento automatico.
Se necessario, è possibile ripetere separatamente uno di questi passaggi premendo il pulsante A o B nella scheda di controllo della cella. Posizionare un becher sotto la porta di sicurezza per raccogliere la soluzione di scarto e non iniettare bolle d'aria nel sistema. Aprire la porta di ingresso e di prospettiva dello strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle o NTA e iniettare 10 millilitri di acqua distillata con una siringa nel canale cellulare attraverso la porta di ingresso.
Chiudere immediatamente la porta di ingresso e di uscita poiché viene iniettata l'ultima quantità di acqua. Assicurarsi che la cella di misura sia priva di bolle d'aria. Eseguire il controllo di qualità della cella facendo clic su. Ok.
Il software visualizzerà il risultato della qualità della cella dopo alcuni secondi, se alcune particelle sono ancora visualizzate nella schermata live view del software, o se il risultato del controllo di qualità è solo buono o scarso, ripetere l'iniezione di acqua distale fino a quando le particelle rimanenti non vengono rimosse dalla cella di misurazione L.Inoltre, Ripetere questo passaggio dopo ogni misurazione per evitare l'accumulo di particelle. Successivamente, preparare una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene uniformi di dimensioni 200 nanometriche. Per allineare i fuochi del laser e del microscopio, aggiungere una goccia del concentrato di sospensione fornito dal produttore dello strumento a 500 millilitri di acqua distillata ottenendo la concentrazione richiesta in modo tale che vengano visualizzate più o meno 100 particelle per schermo nella visualizzazione in tempo reale.
Iniettare la sospensione di allineamento nello strumento NTA come fatto per la pressa per acqua distillata. Va bene per iniziare anche l'allineamento, che è una routine automatizzata attraverso la quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi. Quando viene visualizzato un messaggio che indica che il sistema è ora pronto per gli esperimenti, fare clic su OK per avviare la misurazione.
Di tanto in tanto pulire manualmente il canale cellulare tra un esperimento e l'altro, lavando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software visualizza un rapporto di errore automatico. Per eseguire la misurazione del sistema.
Innanzitutto, sciacquare il canale con acqua distillata prima di ogni misurazione del campione. Quindi iniettare la sospensione dell'esosoma nel canale. Il passaggio successivo consiste nel regolare i parametri principali nel software per regolare la sensibilità.
Trova l'intervallo di sensibilità ottimale facendo clic sul numero di particelle rispetto alla sensibilità per visualizzare una curva per le particelle misurate per schermata per diversi livelli di sensibilità. Scegliere un livello di sensibilità prima della pendenza massima della curva. Un livello di sensibilità più elevato consente la visualizzazione di particelle più piccole, ma aumenta anche i problemi legati al rumore di fondo.
Per regolare la luminosità minima, scegliere una luminosità iniziale di 20 per la misurazione dell'esosoma. Per utilizzare questa funzione come filtro, regolare questo parametro fino a escludere le particelle fortemente luminose che diffondono. Regolalo verso il basso per amplificare gli artefatti di dispersione settimanali, molto luminosità secondo necessità durante l'esperimento.
Quindi, imposta un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e le particelle di grandi dimensioni a dispersione indesiderate. Regolando la dimensione minima e massima, utilizzare un intervallo compreso tra 10 e 500 pixel per la misurazione degli esosomi. Regolare l'otturatore modificando il periodo di tempo in cui la fotocamera è aperta impostando l'otturatore su 300, che equivale a 3,3 millisecondi.
Per regolare i parametri di lettura in tempo reale, passare da una modalità di visualizzazione digitale a una analogica in qualsiasi momento facendo clic sul pulsante dell'immagine dal vivo. Durante l'esperimento. Monitora la barra dell'intensità della dispersione, che mostra lo stato di saturazione del campione come indicatore di codice colore.
Non analizzare gli esosomi se la barra di dispersione è rossa. Per iniziare la misurazione, fare clic sulla scheda di misurazione. Scegliere le impostazioni nell'array di opzioni di esecuzione.
Prima di ogni acquisizione, selezionare il controllo del movimento, un test di deriva delle particelle di controllo ripetuto, selezionare il numero di esperimenti e il ritardo tra di loro. Se necessario, eseguire un controllo a campione. Infine, fai clic sul pulsante Esegui acquisizione video.
Nella nuova finestra, definire il numero di cicli e il numero di posizioni di misurazione. Confermare la durata minima. Una particella viene tracciata per essere contata come una singola particella.
Impostando la risoluzione video, una risoluzione più bassa si traduce in una durata del tracciamento più breve. Infine, seleziona un nome di file e fai clic su OK per avviare la misurazione. La curva del numero di particelle rispetto alla sensibilità mostra le particelle in una posizione in un momento.
Durante una scansione automatica della sensibilità, viene scelto un valore di sensibilità prima della pendenza massima del grafico. Gli artefatti non vengono eliminati in questo esperimento di test e possono influire sul grafico. La visualizzazione delle particelle sullo schermo live view è utile per impostare il giusto valore di sensibilità.
Un valore troppo basso porta al rilevamento di poche particelle. Mentre un valore troppo alto mostra un'immagine scadente, le particelle di qualità appaiono un singolo punto ben isolato l'uno dall'altro nel livello di sensibilità ottimale. La scheda dei risultati dopo la misurazione consente la lettura dei parametri, tra cui il numero totale di particelle tracciate, il numero medio di particelle per posizione e la concentrazione di particelle, nonché il rapporto numerico tra la dimensione delle particelle e la percentuale del numero di particelle.
Il grafico calcolato dopo la misurazione mostra la distribuzione delle particelle in base alle dimensioni. Le icone nella modalità di visualizzazione possono essere utilizzate per modificare le impostazioni del grafico. Inoltre, ci sono diversi modi per analizzare gli esosomi.
Questo metodo mostra un metodo molto semplice ed elegante per eseguire un'analisi simile in un processo veloce per generare risultati in breve tempo. Per confrontare più campioni, si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni accettano la sensibilità e la risoluzione video può essere modificata in seguito utilizzando il set di alcuni software di analisi.
In questo modo, l'analisi comparativa dei dati ottenuti in diversi esperimenti sulla quantità e le dimensioni degli esosomi diventa disponibile in modo semi-automatico.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per isolare gli esosomi dal sangue intero e analizzarli mediante analisi del tracciamento di nanoparticelle (NTA) con uno strumento semiautomatico. La tecnologia offre un approccio altamente sensibile per la visualizzazione e la quantificazione di particelle in sospensione liquida.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Analisi degli esosomi
Sfondo
- Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari coinvolte nella comunicazione intercellulare.
- L'isolamento e l'analisi degli esosomi possono fornire informazioni su diversi processi biologici.
- L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle consente la misurazione della dimensione e della concentrazione delle particelle.
- I metodi standard per l'isolamento degli esosomi richiedono spesso procedure complesse.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento di esosomi dal sangue umano.
- Quantificare e analizzare gli esosomi utilizzando l'NTA.
- Ottimizzare le impostazioni dell'NTA per misurazioni accurate.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di sangue intero e centrifugazione per separare il plasma.
- Ultracentrifugazione per isolare gli esosomi dal plasma acellulare.
- Preparazione di sospensioni di controllo per la calibrazione dello strumento.
- Utilizzo dell'analisi della traiettoria delle particelle (NTA) per misurare la dimensione e la concentrazione delle particelle.
Risultati principali
- Il metodo isola con successo gli esosomi con elevata purezza.
- La NTA fornisce una quantificazione dettagliata delle popolazioni di esosomi.
- Impostazioni di sensibilità ottimali migliorano la visualizzazione delle particelle piccole.
- I risultati dimostrano l'efficacia dell'approccio semi-automatico.
Conclusioni
- Questo metodo offre un approccio semplificato per l'analisi degli esosomi.
- Può essere adattato per varie applicazioni di ricerca in neuroscienze e biologia.
- Studi futuri potrebbero esplorare le implicazioni del contenuto degli esosomi nelle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione degli esosomi e la misurazione della dimensione sono fondamentali per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci in oncologia, ginecologia e cardiologia. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) fornisce dati quantitativi e riproducibili che supportano l'eliminazione dei rischi meccanicistici e una maggiore affidabilità predittiva nello sviluppo precoce di biomarcatori. Questo metodo semi-automatico consente una valutazione affidabile delle popolazioni di esosomi come sistemi rilevanti per le malattie nella ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando la concentrazione di esosomi e la distribuzione dimensionale nel plasma umano.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante dati riproducibili di tracciamento delle particelle, validati rispetto alla microscopia elettronica a scansione.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio fornendo metriche quantitative sugli esosomi per la valutazione della fiducia nel bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sospensioni di esosomi validate per la standardizzazione di saggi successivi e flussi di lavoro di screening di composti.
- Valore operativo: Fornisce conteggi di particelle risolti per dimensione e misurazioni della concentrazione essenziali per la riproducibilità del saggio.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su più campioni attraverso protocolli standardizzati di diluizione e calibrazione dello strumento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega l'analisi degli esosomi nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso metodi di quantificazione coerenti.
- Sistema Rilevante per le Malattie: Supporta la ricerca in oncologia, ginecologia e cardiologia permettendo la misurazione degli esosomi provenienti dal plasma umano.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Fornisce risultati quantitativi che guidano decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi guidati da biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo dati quantitativi sugli esosomi per ottenere informazioni meccanicistiche e preparare il saggio.
- Biologia della Scoperta Supporta il test delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante la quantificazione di esosomi frazionati per dimensione ottenuti da sangue umano.
- Screening: Consente la prontezza del saggio mediante misurazioni riproducibili della concentrazione delle particelle e della distribuzione dimensionale.
- Analitica: Genera output di concentrazione delle particelle, numero medio di particelle per posizione e rapporto dimensione-percetuale per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'isolamento e la misurazione standardizzati degli esosomi, applicabili ai modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'analisi degli esosomi in diversi progetti mediante protocolli standardizzati di NTA e controlli di calibrazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a dati quantitativi su dimensioni e concentrazione degli esosomi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della misurazione degli esosomi tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi di biomarcatori.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e avanzamento delle decisioni corretti per il rischio, basati sulla quantificazione riproducibile degli esosomi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in ultracentrifugazione, analisi del tracciamento delle nanoparticelle e biologia degli esosomi.
- Necessita di uno strumento per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle dotato di software per l'ottimizzazione della sensibilità, luminosità e filtri digitali.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di raccolta del plasma, centrifugazione e risospensione.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di campioni e volumi iniziali di plasma.
- Include limitazioni pratiche come il rumore di fondo dipendente dalla sensibilità e la necessità di un'ottimizzazione individuale per ogni campione.
