Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

L'obiettivo di questa procedura è analizzare gli esosomi in base alle loro dimensioni e quantificarli utilizzando un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle o uno strumento NTA attraverso un metodo semi-automatizzato. Ciò si ottiene utilizzando passaggi di centrificazione differenziale per ottenere un pellet di esosoma dal sangue umano. Gli esosomi vengono risospesi a una concentrazione predeterminata per la quantità di plasma iniziale per ottenere l'intensità di dispersione appropriata.

Durante l'NTA, la sospensione viene quindi filtrata per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Successivamente, viene eseguita una calibrazione dello strumento NTA utilizzando una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene di dimensioni 200 nanometriche. La soluzione di esosoma viene quindi iniettata nello strumento NTA e l'impostazione ideale dell'NTA viene selezionata eseguendo un pretest prima di eseguire il test finale.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la quantificazione di tutte le particelle misurate e l'elenco delle particelle in base alle loro dimensioni. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto la soluzione e l'impostazione di ciascuna soluzione di esosoma preparata devono essere eseguite individualmente per ottenere i migliori risultati. Gli esosomi misurati devono essere in una concentrazione I in modo che la modalità live view visualizzi circa 600 particelle per schermo.

Inoltre, è necessario eseguire un pretest per trovare l'intervallo di sensibilità ottimale per la misurazione. Un'elevata impostazione della sensibilità porta alla visualizzazione di particelle più piccole, aumenterebbe anche i problemi relativi ai rumori di fondo. La procedura sarà dimostrata da Anto May, uno studente laureato del nostro laboratorio Per iniziare la preparazione dell'esosoma, raccogliere il sangue intero in tre provette di citrato tramite puntura venosa per un totale di nove millilitri.

Quindi versare il sangue in una provetta Falcon da 15 millilitri, centrifugare il campione a 1.500 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferisci la S nascent in un nuovo tubo Falcon da 15 millilitri. Quindi centrifugare nuovamente il campione a 2.800 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere tutte le cellule dal plasma.

Trasferire il plasma libero da cellule o il CFP in provette per ultracentrifugazione a un millilitro per provetta. Quindi centrifugare la CFP a 100.000 G per 90 minuti a quattro gradi Celsius per esaurire gli esosomi. Rimuovere 900 microlitri di surnatante e risospendere il pellet nei restanti 100 microlitri nella provetta per ultracentrifugazione.

Dopo aver aggiunto 900 microlitri di centrifuga PBS, si guadagna a 100.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Come prima, rimuovere 900 microlitri di agente supino e risospendere i pellet con i restanti 100 microlitri. Trasferire da cinque a 20 microlitri della sospensione di Resus in 40 millilitri di acqua distillata.

Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 450 nanometri per separare gli esosomi dalle particelle più grandi. Utilizzare questa sospensione finale per la misurazione delle particelle per utilizzare lo strumento di tracciamento delle particelle. Innanzitutto, avvia il programma facendo doppio clic sull'icona del software.

Fare clic sulle varie schede del software per passare da una all'altra durante il protocollo. Segui le istruzioni sullo schermo. Per un'implementazione automatizzata della procedura di avvio, selezionare le caselle per il controllo della qualità delle celle e l'allineamento automatico.

Se necessario, è possibile ripetere separatamente uno di questi passaggi premendo il pulsante A o B nella scheda di controllo della cella. Posizionare un becher sotto la porta di sicurezza per raccogliere la soluzione di scarto e non iniettare bolle d'aria nel sistema. Aprire la porta di ingresso e di prospettiva dello strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle o NTA e iniettare 10 millilitri di acqua distillata con una siringa nel canale cellulare attraverso la porta di ingresso.

Chiudere immediatamente la porta di ingresso e di uscita poiché viene iniettata l'ultima quantità di acqua. Assicurarsi che la cella di misura sia priva di bolle d'aria. Eseguire il controllo di qualità della cella facendo clic su. Ok.

Il software visualizzerà il risultato della qualità della cella dopo alcuni secondi, se alcune particelle sono ancora visualizzate nella schermata live view del software, o se il risultato del controllo di qualità è solo buono o scarso, ripetere l'iniezione di acqua distale fino a quando le particelle rimanenti non vengono rimosse dalla cella di misurazione L.Inoltre, Ripetere questo passaggio dopo ogni misurazione per evitare l'accumulo di particelle. Successivamente, preparare una sospensione di controllo contenente particelle di polistirene uniformi di dimensioni 200 nanometriche. Per allineare i fuochi del laser e del microscopio, aggiungere una goccia del concentrato di sospensione fornito dal produttore dello strumento a 500 millilitri di acqua distillata ottenendo la concentrazione richiesta in modo tale che vengano visualizzate più o meno 100 particelle per schermo nella visualizzazione in tempo reale.

Iniettare la sospensione di allineamento nello strumento NTA come fatto per la pressa per acqua distillata. Va bene per iniziare anche l'allineamento, che è una routine automatizzata attraverso la quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi. Quando viene visualizzato un messaggio che indica che il sistema è ora pronto per gli esperimenti, fare clic su OK per avviare la misurazione.

Di tanto in tanto pulire manualmente il canale cellulare tra un esperimento e l'altro, lavando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software visualizza un rapporto di errore automatico. Per eseguire la misurazione del sistema.

Innanzitutto, sciacquare il canale con acqua distillata prima di ogni misurazione del campione. Quindi iniettare la sospensione dell'esosoma nel canale. Il passaggio successivo consiste nel regolare i parametri principali nel software per regolare la sensibilità.

Trova l'intervallo di sensibilità ottimale facendo clic sul numero di particelle rispetto alla sensibilità per visualizzare una curva per le particelle misurate per schermata per diversi livelli di sensibilità. Scegliere un livello di sensibilità prima della pendenza massima della curva. Un livello di sensibilità più elevato consente la visualizzazione di particelle più piccole, ma aumenta anche i problemi legati al rumore di fondo.

Per regolare la luminosità minima, scegliere una luminosità iniziale di 20 per la misurazione dell'esosoma. Per utilizzare questa funzione come filtro, regolare questo parametro fino a escludere le particelle fortemente luminose che diffondono. Regolalo verso il basso per amplificare gli artefatti di dispersione settimanali, molto luminosità secondo necessità durante l'esperimento.

Quindi, imposta un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e le particelle di grandi dimensioni a dispersione indesiderate. Regolando la dimensione minima e massima, utilizzare un intervallo compreso tra 10 e 500 pixel per la misurazione degli esosomi. Regolare l'otturatore modificando il periodo di tempo in cui la fotocamera è aperta impostando l'otturatore su 300, che equivale a 3,3 millisecondi.

Per regolare i parametri di lettura in tempo reale, passare da una modalità di visualizzazione digitale a una analogica in qualsiasi momento facendo clic sul pulsante dell'immagine dal vivo. Durante l'esperimento. Monitora la barra dell'intensità della dispersione, che mostra lo stato di saturazione del campione come indicatore di codice colore.

Non analizzare gli esosomi se la barra di dispersione è rossa. Per iniziare la misurazione, fare clic sulla scheda di misurazione. Scegliere le impostazioni nell'array di opzioni di esecuzione.

Prima di ogni acquisizione, selezionare il controllo del movimento, un test di deriva delle particelle di controllo ripetuto, selezionare il numero di esperimenti e il ritardo tra di loro. Se necessario, eseguire un controllo a campione. Infine, fai clic sul pulsante Esegui acquisizione video.

Nella nuova finestra, definire il numero di cicli e il numero di posizioni di misurazione. Confermare la durata minima. Una particella viene tracciata per essere contata come una singola particella.

Impostando la risoluzione video, una risoluzione più bassa si traduce in una durata del tracciamento più breve. Infine, seleziona un nome di file e fai clic su OK per avviare la misurazione. La curva del numero di particelle rispetto alla sensibilità mostra le particelle in una posizione in un momento.

Durante una scansione automatica della sensibilità, viene scelto un valore di sensibilità prima della pendenza massima del grafico. Gli artefatti non vengono eliminati in questo esperimento di test e possono influire sul grafico. La visualizzazione delle particelle sullo schermo live view è utile per impostare il giusto valore di sensibilità.

Un valore troppo basso porta al rilevamento di poche particelle. Mentre un valore troppo alto mostra un'immagine scadente, le particelle di qualità appaiono un singolo punto ben isolato l'uno dall'altro nel livello di sensibilità ottimale. La scheda dei risultati dopo la misurazione consente la lettura dei parametri, tra cui il numero totale di particelle tracciate, il numero medio di particelle per posizione e la concentrazione di particelle, nonché il rapporto numerico tra la dimensione delle particelle e la percentuale del numero di particelle.

Il grafico calcolato dopo la misurazione mostra la distribuzione delle particelle in base alle dimensioni. Le icone nella modalità di visualizzazione possono essere utilizzate per modificare le impostazioni del grafico. Inoltre, ci sono diversi modi per analizzare gli esosomi.

Questo metodo mostra un metodo molto semplice ed elegante per eseguire un'analisi simile in un processo veloce per generare risultati in breve tempo. Per confrontare più campioni, si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni accettano la sensibilità e la risoluzione video può essere modificata in seguito utilizzando il set di alcuni software di analisi.

In questo modo, l'analisi comparativa dei dati ottenuti in diversi esperimenti sulla quantità e le dimensioni degli esosomi diventa disponibile in modo semi-automatico.