Campionamento di microestrazione in fase solida: una tecnica basata su sonda per l'estrazione di campioni da tessuti da innesto

La conservazione a lungo termine di un trapianto d'organo influisce sul suo profilo metabolico, che è un indicatore della funzione d'organo e del rigetto d'organo in fase iniziale.

Per isolare questi metaboliti, iniziare prendendo una sottile microestrazione in fase solida o una sonda SPME rivestita con un sorbente biocompatibile. Immergere la sonda in una soluzione detergente idroalcolica per idratare l'assorbente rivestito e sciogliere eventuali impurità legate.

Agitare la sonda per rimuovere le impurità. Quindi, posizionare la sonda in una soluzione di attivazione e agitare di nuovo. Le sostanze chimiche nella soluzione di attivazione modificano la superficie della sonda, migliorandone il potenziale di adsorbimento. Sciacquare la sonda con acqua e sterilizzarla per rimuovere i contaminanti microbici.

A questo punto, inserire la sonda sterile e attivata nell'innesto dell'organo in modo che la matrice tissutale copra l'intera superficie dell'assorbente. Il materiale assorbente attrae i metaboliti liberi polari e non polari dall'innesto, consentendone l'adsorbimento sulla sua superficie. Ritrarre la sonda e sciacquarla con acqua per rimuovere eventuali residui di tessuto.

Quindi, posizionare la sonda in una soluzione di desorbimento, che interagisce con i metaboliti adsorbiti. Agitare la sonda per separare e solubilizzare i metaboliti catturati nella soluzione di desorbimento. Infine, rimuovere la sonda ed elaborare la miscela di metaboliti risultante per la successiva analisi.

Inizia preparando una miscela di precondizionamento composta da 1 a 1 metanolo e acqua. Pipettare 1 millilitro di soluzione in ogni flaconcino di vetro da 2 millilitri e posizionare una sonda in ciascun flaconcino. Agitare le fiale su un agitatore a vortice a 1.200 giri/min per 1 ora. Quindi, sciacquare le sonde con acqua di grado LC-MS e sterilizzarle secondo il protocollo di sterilizzazione chirurgica standard o nel reparto di trattamento sterile.

Quando si è pronti per estrarre il campione, aprire la confezione sterile e inserire due sonde direttamente nella corteccia renale per 10 minuti per punto temporale, assicurandosi che l'intera lunghezza del rivestimento sia coperta dalla matrice tissutale. Assicurarsi di tenere traccia del tempo di campionamento per ciascuna sonda. Ritrarre la sonda estraendola dal tessuto e sciacquare immediatamente il rivestimento con acqua di grado LC-MS per rimuovere il sangue residuo, assicurandosi di risciacquare via dal sito chirurgico.

Per trasportare le sonde, metterle in fiale separate e chiuderle. Quindi, metti le fiale in una scatola piena di ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius o procedere immediatamente con il desorbimento.

Preparare una soluzione di desorbimento composta da acetonitrile e acqua per l'analisi metabolomica e un'altra composta da isopropanolo e metanolo per l'analisi lipidomica. Aggiungere 100 microlitri di soluzione agli inserti nei flaconcini da 2 millilitri etichettati e posizionare una sonda in ciascun flaconcino. Agitare le fiale a 1.200 giri/min per 2 ore. Quindi, rimuovere le sonde dalle fiale e procedere con l'analisi LC-MS.