Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation

L'obiettivo generale di questa invenzione chirurgica è quello di produrre micro-innesti cutanei autologhi pronti per essere utilizzati immediatamente nello stesso intervento chirurgico per scopi di guarigione delle ferite. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti cutanei su cose come la guarigione cronica delle ferite, le ustioni e le ulcere post-traumatiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto facile da usare da parte del medico senza la tecnica dell'aspettatili, ed è altrettanto veloce e conveniente.

Per iniziare, utilizzare un punzone da biopsia per raccogliere campioni di pelle da un paziente. Quindi rimuovere e scartare lo strato epiteliale. Combinare ogni campione di tessuto con 1 millilitro di soluzione salina per generare microinnesti autologhi.

Per preparare i biocomplessi per l'applicazione clinica, trasferire 1 millilitro della soluzione di micro-innesto su spugne di collagene. Applicare immediatamente il biocomplesso sulla zona lesa del paziente. Per testare in vitro la vitalità del biocomplesso.

Dopo tre giorni di coltura, versare lo 0,3% di formalina direttamente sui biocomplessi e fissare per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di 5 micrometri di spessore e montarle direttamente su un vetrino. Quindi posizionare le sezioni in 15-20 millilitri di xilene per tre minuti.

Successivamente, immergere le fette in gradi decrescenti di etanolo per un'ora ciascuna prima di metterle in acqua deionizzata per deparaffinare e reidratare le sezioni. Quindi utilizzare da 1 a 2 millilitri di 1 grammo per litro di ematossilina per uno o due minuti per colorare le sezioni. E trasferire in acqua per risciacquare la macchia.

Ora con 1 o 2 millilitri di eosina Y all'1% e etanolo al 70% e diluirlo in acqua, colorare le sezioni per quattro o cinque minuti. Quindi utilizzare l'acqua corrente del rubinetto per sciacquare gli scivoli. Immergere le sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo per un'ora ciascuna prima di un'incubazione di un'ora in xilene.

Infine, applicare un mezzo di montaggio a base di campioni prima di aggiungere un vetrino coprioggetti. Quindi osservare al microscopio ottico con un ingrandimento di 100x. Utilizzando un dermatomo, prelevare campioni papillari, morti o dermici spessi 0,6 millimetri, 1 o 0,2 millimetri, rispettivamente, dalle aree del tronco di quattro donatori multitessuto di età compresa tra 40 e 55 anni seguendo le norme nazionali sul prelievo.

Mettere i campioni in NaCl allo 0,9% e posizionarli su un agitatore orbitale per cinque minuti per risciacquare delicatamente il tessuto. Con un punzone per biopsia da 5 millimetri, è possibile creare campioni di diametro uniforme dal tessuto cutaneo, morto e derma, e pesare tutti i campioni di tessuto. Successivamente, inserire otto, tre o quattro campioni uniformi di tessuto cutaneo, morto o dermico, rispettivamente, nel disgregatore tissutale e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina per la disaggregazione.

Eseguire la disaggregazione per tutti i campioni di tessuto come indicato in questa tabella. Utilizzare un numero corrispondente di biopsie a punzone derivate da campioni di tessuto intatto come controlli. Dopo la disaggregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente micro-innesti e posizionare ciascun campione separatamente in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Aggiungere 1 millilitro di terreno RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS e antibiotici a ciascun campione. Per valutare la vitalità cellulare, a ciascun pozzetto aggiungere 1 millilitro di terreno contenente 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione MTT e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno MTT e sostituirlo con 1 millilitro di DMSO.

Dopo l'incubazione per 10 minuti, trasferire ogni campione in DMSO in una cuvetta e utilizzare uno spettrofotometro per leggere la densità ottica a 570 nanometri. Calcolare la vitalità cellulare come il rapporto tra l'assorbanza a 570 nanometri e il peso e i grammi di tessuto utilizzato prima della disaggregazione. Successivamente, una volta che la soluzione salina è stata aspirata dal tessuto cutaneo, dai campioni morti e dal derma di un singolo donatore, posizionare ciascun campione separatamente in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per un test di vitalità cellulare o in un pallone di coltura per l'analisi morfologica.

Aggiungere 1 millilitro di RPMI-1640 con il 10% di FBS e antibiotici alla piastra a 12 pozzetti o 5 millilitri al pallone di coltura e la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore o sette giorni, rispettivamente. A 24 ore, utilizzare la microscopia ottica per effettuare analisi morfologiche valutando la presenza di sospensione cellulare. Ripeti il settimo giorno.

Con l'analisi FACS, analisi dei campioni dermici da marcatori di cellule mesenchimali ed ematopoietiche, come CD146, CD34 e CD45. Aggiungere il terreno alle cellule desegregate, quindi incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. E valutare la sterilità del tessuto eseguendo analisi microbiologiche come descritto in precedenza.

Come mostrato qui, micro-innesti autologhi umani immediatamente caricati su supporto di collagene sono stati impiantati in una lesione della gamba. E una completa riepitelizzazione associata alla riparazione tissutale è stata osservata dopo 30 giorni. Inoltre, il follow-up clinico ha mostrato una buona consistenza e morbidezza dell'area danneggiata dopo cinque mesi.

Come elencato in questa tabella, sono state stabilite le soglie di otto, quattro e tre biopsie che possono essere elaborate in un unico passaggio e i tessuti sono stati disaggregati in quattro tempi diversi al fine di identificare le condizioni ottimali di disaggregazione per mantenere una buona vitalità cellulare. La disaggregazione meccanica dimostrata in questo video mantiene un valore medio del 30% di vitalità cellulare in tutti i campioni di pelle, morta e dermica, quando valutata in tempi diversi rispetto al tessuto intatto. Questo innesto mostra che dopo 24 ore, o sette giorni in coltura, non è stata osservata alcuna variazione sostanziale della vitalità cellulare nei campioni di tessuto cutaneo al momento dell'omogeneizzazione in coltura rispetto al tempo di inizio.

Tuttavia, è stata osservata una ridotta vitalità dei campioni morti dopo 24 ore in coltura rispetto all'orario di inizio. Ma la vitalità cellulare è stata ripristinata dopo sette giorni di coltura. Risultati simili sono stati osservati per il derma.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere lo strato epiteliale dalla pelle. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la disaggregazione del tessuto osseo per rispondere ad altre domande come il meccanismo di guarigione ossea.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale per esplorare la guarigione dei tessuti nei pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questa procedura di micro-innesto. Non dimenticare che lavorare con il tessuto può essere estremamente pericoloso.

E le precauzioni come gli occhiali di sicurezza dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.