Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation
4 marzo 2016
Il protocollo descrive un nuovo metodo per disaggregare tessuti umani e per creare autologhe micro-innesti che, combinato con spugne di collagene, danno origine a umani bio-complessi pronti all'uso nel trattamento delle lesioni cutanee. Inoltre, questo sistema mantiene la vitalità cellulare di micro-innesti in tempi diversi dopo disgregazione meccanica.
L'obiettivo generale di questa invenzione chirurgica è produrre microinnesti cutanei autologhi pronti per essere utilizzati immediatamente nella stessa procedura chirurgica a scopo di guarigione delle ferite. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale cutanea, riguardo ad esempio alla cicatrizzazione di ferite croniche, ustioni e ulcere post-traumatiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è molto semplice da usare da parte del medico, senza richiedere competenze specialistiche, ed è rapida ed economica.
Per iniziare, utilizzare un punch per biopsia per prelevare campioni di pelle da un paziente. Successivamente, rimuovere e scartare lo strato epiteliale. Combinare ogni campione di tessuto con 1 millilitro di soluzione salina per generare microinnesti autologhi.
Per preparare i biocomplessi per applicazione clinica, trasferire 1 millilitro della soluzione di microinnesto su spugne di collagene. Applicare immediatamente il biocomplesso sulla zona lesa del paziente. Per testare in vitro la vitalità del biocomplesso.
Dopo tre giorni di coltura, versare direttamente 0,3% di formalina sui biocomplessi e fissare per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni spesse 5 micrometri e montarle direttamente su un vetrino. Successivamente, immergere le sezioni in 15-20 millilitri di xilene per tre minuti.
Successivamente, immergere le sezioni in gradazioni decrescenti di etanolo per un'ora ciascuna prima di posizionarle in acqua deionizzata per disparaffinare e reidratare i campioni. Quindi utilizzare da 1 a 2 millilitri di ematossilina a 1 grammo per litro per colorare le sezioni per uno-due minuti. Successivamente trasferire in acqua per rimuovere il colorante con un risciacquo.
Ora aggiungere 1-2 millilitri di Eosina Y al 1% e alcol etilico al 70% e diluire in acqua, quindi colorare le sezioni per quattro-cinque minuti. Successivamente, risciacquare i vetrini con acqua corrente. Immergere le sezioni in concentrazioni crescenti di alcol etilico per un'ora ciascuna, prima di un'incubazione di un'ora in xilene.
Infine, applicare un mezzo di montaggio a base acquosa ai campioni prima di aggiungere un coprioggetto. Quindi osservare al microscopio ottico con un ingrandimento di 100x. Utilizzando un dermatomo, prelevare rispettivamente campioni papillari, morti o del derma spessi 0,6 millimetri, 1 millimetro o 0,2 millimetri dalle aree del tronco di quattro donatori multitiptici di età compresa tra 40 e 55 anni, seguendo le norme nazionali sul prelievo.
Posizionare i campioni in NaCl 0,9% e metterli su un agitatore orbitale per cinque minuti per sciacquare delicatamente il tessuto. Con una punta da biopsia da 5 millimetri, ottenere campioni uniformi in diametro dal tessuto cutaneo, epidermide e derma, e pesare tutti i campioni di tessuto. Successivamente, inserire otto, tre o quattro campioni uniformi di tessuto cutaneo, epidermide o derma, rispettivamente, nel disgregatore tissutale, e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina per la disgregazione.
Eseguire la disgregazione per tutti i campioni di tessuto come indicato in questa tabella. Utilizzare un numero corrispondente di biopsie ottenute con punch da campioni di tessuto integri come controlli. Dopo la disgregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente i microinnesti e posizionare ogni campione separatamente in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
Aggiungere 1 millilitro di mezzo RPMI-1640 integrato con FBS al 10% e antibiotici a ciascun campione. Per valutare la vitalità cellulare, aggiungere a ciascuna pozzetta 1 millilitro di mezzo contenente 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione MTT e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo MTT e sostituirlo con 1 millilitro di DMSO.
Dopo un'incubazione di 10 minuti, trasferire ogni campione in DMSO in una cuvetta e utilizzare uno spettrofotometro per leggere la densità ottica a 570 nanometri. Calcolare la vitalità cellulare come rapporto tra l'assorbanza a 570 nanometri e il peso in grammi del tessuto utilizzato prima della disaggregazione. Successivamente, una volta aspirata la soluzione salina dal tessuto cutaneo, posizionare separatamente i campioni di tessuto morto e dermico provenienti da un singolo donatore in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per un test di vitalità cellulare oppure in una fiala da coltura per l'analisi morfologica.
Aggiungere 1 millilitro di RPMI-1640 con FBS al 10% e antibiotici nella piastra a 12 pozzetti oppure 5 millilitri nel flacone da coltura, e coltivare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica rispettivamente per 24 ore o sette giorni. Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio ottico per eseguire l'analisi morfologica valutando la presenza di sospensione cellulare. Ripetere il procedimento al settimo giorno.
Mediante analisi FACS, analizzare i campioni di derma per marcatori cellulari mesenchimali ed ematopoietici, come CD146, CD34 e CD45. Aggiungere mezzo alle cellule disgregate, quindi incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Valutare la sterilità del tessuto eseguendo un'analisi microbiologica come descritto in precedenza.
Come mostrato qui, microinnesti autologhi umani immediatamente caricati su un supporto in collagene sono stati impiantati in una lesione alla gamba. E dopo 30 giorni è stata osservata una completa ri-epitelializzazione associata alla riparazione del tessuto. Inoltre, il follow-up clinico ha mostrato una buona trama e morbidezza dell'area danneggiata dopo cinque mesi.
Come indicato in questa tabella, sono stati stabiliti i valori limite di otto, quattro e tre biopsie che possono essere processate in un unico passaggio, e i tessuti sono stati dissociati in quattro diversi momenti al fine di identificare le condizioni ottimali di dissociazione per mantenere una buona vitalità cellulare. La dissociazione meccanica mostrata in questo video mantiene un valore medio del 30% di vitalità cellulare in tutti i campioni di pelle, epidermide e derma, quando valutata in diversi momenti rispetto al tessuto intatto. Questo grafico mostra che dopo 24 ore, o sette giorni di coltura, nessuna variazione sostanziale della vitalità cellulare nei campioni di tessuto cutaneo è stata osservata al momento dell'omogeneizzazione in coltura rispetto al tempo iniziale.
Tuttavia, è stata osservata una ridotta vitalità dei campioni morti dopo 24 ore di coltura rispetto al tempo iniziale. Tuttavia, la vitalità cellulare è stata ripristinata dopo sette giorni di coltura. Risultati simili sono stati osservati per il derma.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque minuti se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere il strato epiteliale dalla pelle. Dopo questa procedura, altri metodi come la disaggregazione del tessuto osseo possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio sui meccanismi di guarigione ossea.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale per esplorare il processo di guarigione dei tessuti nei pazienti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire questa procedura di microinnesto. Non dimenticare che lavorare con i tessuti può essere estremamente pericoloso.
E le precauzioni, come l'uso di occhiali di sicurezza, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo chirurgico per la creazione di microinnesti cutanei autologhi che possono essere utilizzati immediatamente per la guarigione delle ferite. La tecnica si distingue per semplicità d'uso ed economicità, rendendola accessibile ai professionisti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Medicina rigenerativa
- Ingegneria dei tessuti cutanei
Sfondo
- Guarigione delle ferite croniche
- Trattamento delle ustioni
- Ulcerazioni post-traumatiche
- Importanza della vitalità cellulare negli innesti
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'uso immediato di microinnesti cutanei
- Migliorare la comprensione della rigenerazione cutanea
- Fornire una soluzione pratica per la guarigione delle ferite
Metodi Utilizzati
- Punch per biopsia per prelevare campioni di pelle
- Rimozione dello strato epiteliale
- Combinazione di campioni di tessuto con soluzione salina
- Creazione di microinnesti autologhi
Risultati principali
- Disaggregazione riuscita di tessuti umani
- Preservazione della vitalità cellulare nei microinnesti
- Preparazione rapida degli innesti per uso immediato
- Potenziali applicazioni in diversi scenari di guarigione delle ferite
Conclusioni
- Il metodo è efficiente e di facile utilizzo per i clinici
- Offre un approccio promettente per il trattamento delle lesioni cutanee
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliarne le applicazioni nella medicina rigenerativa
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per Dirigenti
Questo metodo consente la produzione rapida di microinnesti autologhi per un uso clinico immediato nella guarigione delle ferite, affrontando esigenze insoddisfatte nella gestione delle lesioni croniche. Preservando la vitalità cellulare e la sterilità, supporta una previsione affidabile nelle applicazioni rigenerative. L'approccio offre una soluzione scalabile ed economicamente vantaggiosa per i flussi di lavoro nell'ingegneria tissutale cutanea.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della composizione cellulare in tessuto cutaneo dissociato, inclusa l'identificazione di cellule staminali mesenchimali per la verifica di ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo standardizzato e rapido di dissociazione che riduce la variabilità nell'isolamento di cellule primarie per studi di validazione di bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera sospensioni cellulari vitali ed eterogenee adatte all'analisi fenotipica e saggi funzionali in modelli di rigenerazione dermica.
- Valore operativo: Produce microinnesti standardizzati compatibili con scaffold di collagene, consentendo la preparazione riproducibile di saggi per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la vitalità cellulare e la sterilità per sette giorni in coltura, consentendo la valutazione longitudinale dell'integrazione dell'innesto e dei meccanismi di riparazione tissutale.
- Valore operativo: Fornisce bio-complessi autologhi pronti all'uso che fungono da ponte tra la scoperta e la validazione preclinica nei modelli di guarigione delle ferite.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la rapida generazione di sistemi cellulari derivati dalla pelle, caratterizzati, per studi meccanicistici e traslazionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla vitalità cellulare e sulla multipotenza nei tessuti cutanei dissociati mediante citometria a flusso e saggi di vitalità.
- Screening: Permette la preparazione standardizzata di microinnesti per una valutazione costante dei composti nei saggi di rigenerazione dermica.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi, inclusi parametri di vitalità cellulare (normalizzazione OD570) e conferma della sterilità, per decisioni basate sui dati.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la fedeltà biologica delle cellule derivate dalla pelle umana durante il tempo di coltura, supportando la continuità preclinica nei modelli di guarigione delle ferite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di dissociazione riutilizzabile, applicabile a diversi tipi di tessuto (pelle, derma, derma de-epidermizzato) per la ricerca e sviluppo basata su piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al mantenimento della vitalità cellulare e della sterilità, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei risultati rigenerativi.
- Valore operativo: Processo standardizzato e rapido (5 minuti) di disgregazione che richiede competenze tecniche minime, aumentando la produttività del laboratorio.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go nei programmi di guarigione delle ferite, fornendo innesti immediatamente utilizzabili con proprietà biologiche caratterizzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati rigenerativi in base al rischio mediante una produzione affidabile e scalabile di microinnesti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione nella manipolazione asettica dei tessuti e nella rimozione dello strato epiteliale per garantire l'integrità del campione.
- Richiede l'accesso a un dispositivo di frammentazione tissutale, una centrifuga, uno spettrofotometro e la citometria a flusso per la valutazione della vitalità e della sterilità.
- Necessita della standardizzazione del tempo di disgregazione e del volume della biopsia tra i diversi siti utilizzatori per mantenere rese cellulari costanti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a densità tissutali diverse o a fonti di donatori differenti.
- È limitato dalla necessità di un'elaborazione immediata dopo la disgregazione per preservare la vitalità, poiché ritardi potrebbero influenzare la coerenza dei saggi successivi.
