Saggio di quantificazione dell'infezione batterica: un metodo per quantificare la carica batterica intraoculare in un modello murino di endoftalmite batterica

L'endoftalmite batterica è una malattia infiammatoria dell'occhio che si verifica quando il Bacillus cereus, un batterio patogeno, infetta la regione intraoculare.

Per quantificare l'infezione batterica, posizionare lateralmente un modello murino soppresso di endoftalmite batterica su un tavolo operatorio. Applicare una leggera pressione sotto l'occhio per aiutare a staccare il bulbo oculare dall'orbita. Trasferire il bulbo oculare in una provetta contenente un tampone appropriato integrato con un cocktail di inibitori della proteasi.

Omogeneizzare il tessuto oculare per disintegrarlo, rilasciando batteri nella sospensione. Gli inibitori della proteasi presenti nel tampone inattivano le proteasi cellulari rilasciate per mantenere la vitalità batterica. Successivamente, diluire in serie la sospensione batterica per ottenere varie concentrazioni di Bacillus cereus.

Prelevare una piastra di coltura angolata contenente il terreno di coltura arricchito e delimitare le file corrispondenti a ciascuna concentrazione di diluizione. Erogare alcune gocce dalla sospensione batterica sulla parte superiore della fila designata e lasciarla scorrere verso il basso fino a raggiungere la fine della piastra, aiutando la diffusione uniforme dei batteri. Appiattire la piastra e incubare.

Durante l'incubazione, ogni batterio utilizza i nutrienti dell'agar per proliferare e formare colonie individuali. Il numero di colonie diminuisce, in corrispondenza di un aumento della diluizione della sospensione batterica. Conta il numero di colonie in una particolare fila per quantificare la carica batterica oculare.

Al punto finale sperimentale appropriato, aggiungere 400 microlitri di PBS integrato con inibitore della proteasi in una provetta di raccolta autoclavata etichettata per occhio sul ghiaccio e posizionare una pinza a punta fine aperta su entrambi i lati dell'occhio infetto. Spingere le punte verso il basso verso la testa per proptosare l'occhio.

Una volta che le pinze sono dietro il globo oculare, stringile insieme e tira via le pinze dalla testa per staccare il bulbo oculare. Quindi, posizionare immediatamente il bulbo oculare nel tubo di raccolta adeguatamente etichettato. Entro 60 minuti dalla raccolta del campione, posizionare le provette di raccolta chiuse in un omogeneizzatore di tessuti e omogeneizzare i campioni per due periodi di omogeneizzazione di un minuto, con un periodo di riposo di 30 secondi tra l'uno e l'altro.

Dopo l'omogeneizzazione, porre i campioni su ghiaccio e utilizzare aliquote da 20 microlitri di omogenato per diluire in serie i campioni in 180 microlitri di PBS per diluizione fino a raggiungere un fattore da 1 x 10 a 8 negativo. Quindi, etichettare ogni riga di una piastra BHI quadrata preriscaldata con la concentrazione di diluizione appropriata e con la piastra inclinata di un angolo di 45 gradi, aggiungere 10 microlitri di ciascuna diluizione in singole file nella parte superiore della piastra. Lasciare scorrere ogni campione fino a raggiungere quasi il fondo della piastra prima di stendere la piastra in piano. Quando i campioni sono stati assorbiti nell'agar, trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Le colonie dovrebbero iniziare ad essere visibili dopo otto ore di incubazione.

Per una rappresentazione accurata della concentrazione nel campione, contare la fila che ha tra le 10 e le 100 colonie.