JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:31 min. • July 8th, 2025
Gli acidi sialici, come l'acido N-acetilneuraminico e l'acido N-glicolilneuraminico, sono frazioni di carboidrati caricate negativamente che si trovano alle estremità distali delle catene oligosaccaridiche sulla superficie cellulare dei mammiferi.
Per quantificare le quantità relative di questi acidi sialici nel tessuto epatico di topo utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa o RP-HPLC, trattare innanzitutto la miscela di acido sialico isolata con un agente di derivatizzazione. L'agente di derivatizzazione interagisce con i gruppi funzionali degli acidi sialici, generando derivati stabili e fluorescenti dell'acido sialico.
Assemblare una colonna RP-HPLC, collegata a un rivelatore a fluorescenza. La colonna è costituita da una fase stazionaria porosa a base di silice legata a leganti a catena alchilica idrofobica non polari per facilitare le interazioni selettive con i derivati dell'acido sialico durante il ciclo cromatografico.
Equilibrare la colonna utilizzando la fase mobile polare acquosa contenente basse concentrazioni di acetonitrile, un solvente organico meno polare, per un condizionamento ottimale della colonna.
Caricare la miscela di acido sialico derivatizzato nella colonna.
L'acido N-acetilneuraminico, contenente un gruppo N-acetilico idrofobo, assorbe più fortemente i ligandi idrofobici della fase stazionaria rispetto all'acido N-glicolilneuraminico con un gruppo N-glicolico idrofilo.
Analizzare i campioni, utilizzando un sistema HPLC standard collegato a un rivelatore di fluorescenza online. Per l'analisi è possibile utilizzare una colonna C-18 a fase inversa con una lunghezza di 250 millimetri e un diametro di 4,6 millimetri.
Dopo aver preparato il solvente A e il solvente B e aver impostato la corsa HPLC come descritto nel protocollo di testo, iniettare 50 microlitri di campione nel sistema HPLC.
Monitorare gli eluenti, utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione del rivelatore a fluorescenza di 373 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 448 nanometri.
Infine, calcola la quantità relativa di Neu5Gc come descritto nel protocollo di testo.