Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo per ottenere una struttura tridimensionale di molecole assemblate in elicottero utilizzando la microscopia crioelettronica. Il protocollo inizia con la preparazione del campione criogenico EM utilizzando un metodo di diluizione rapida e tamponamento sul retro per ridurre transitoriamente la concentrazione di sale durante la preparazione della griglia EM idratata congelata. Questo processo garantisce la stabilità delle proteine, riducendo al contempo il rumore di fondo e migliorando il rapporto segnale/rumore durante la raccolta dei dati a basso dosaggio cryo EM che segue la raccolta dei dati.

L'indicizzazione elicoidale dei modelli di diffrazione è completata. Viene quindi eseguita l'elaborazione delle immagini, seguita dalla ricostruzione 3D dello spazio reale, ottenendo la mappa di densità finale del capside dell'HIV o del tubo di ca. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci sono diversi punti critici per una raccolta e un'analisi ottimali dei dati.

Ad esempio, nel caso dell'HIV si formano assemblaggi tubolari di un capside che si formano solo in una soluzione sorgente molare riducendo rapidamente la concentrazione di sale senza intaccare la struttura. È fondamentale ottenere immagini criogeniche EM di alta qualità. Data l'immagine di un tubo, è molto difficile capire cosa fare per indicizzare un tubo critico e quale software potrebbe essere preso in considerazione per eseguire la ricostruzione 3D.

Questo video fornisce un approccio dettagliato e diretto per ottenere una ricostruzione 3D di oggetti fisici e può essere utilizzato come riferimento per l'esperimento. Dimostrerò la procedura con il Dr.Puja. Siamo entrambi postdoc del Dr.Laboratory Per preparare l'HIV un assemblaggio di proteine del capside per cryo em inizia per bagliore, scaricando il lato del carbonio di 200 griglie di rame a maglie sotto i 25 milliampere per 25 secondi.

Utilizzare un nebulizzatore per portare l'umidità all'80% nella camera ambientale, che è uno stantuffo manuale a gravità fatto in casa. Nel frattempo, raffreddare l'etano liquido in un esecutore di stantuffo bott in vitro con azoto liquido montare l'esecutore di congelamento a tuffo sullo stantuffo manuale a gravità. Quindi, usa una pinza per bloccare le pinze chiuse sul bordo della griglia.

Applicare 2,5 microlitri di una soluzione proteica preassemblata sul lato in carbonio della griglia. Quindi caricare la pinza sullo stantuffo con il lato in carbonio della griglia rivolto verso l'esterno. Aggiungere tre microlitri di tampone di diluizione a basso contenuto di sale sul retro della griglia.

Tamponare immediatamente la griglia con un pezzo di carta da filtro sullo stesso lato. Tenere l'intera superficie posteriore della griglia a stretto contatto con la carta da filtro per circa sei secondi. Dopo aver rimosso la carta da filtro, immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido.

Infine, rimuovere la pinza dallo stantuffo e trasferire rapidamente la griglia in una scatola di immagazzinaggio della griglia. Inizia la microscopia crioelettronica caricando la griglia idratata congelata in un microscopio polare a due elettroni FEI G. Funzionante a 200 kilovolt e dotato di una telecamera CCD gatin 4K per 4K.

In modalità di ricerca a basso dosaggio, aggiungere un ingrandimento di circa 200 x. Schermare l'intera griglia per individuare le aree con ghiaccio adatto. Salvare le posizioni di queste aree in un file di stage.

Richiamare le posizioni salvate e schermare ulteriormente queste aree. Aggiungere un ingrandimento di 3.900 x in modalità di ricerca a basso dosaggio. Selezionare le aree con ghiaccio uniforme a strato sottile per la raccolta dei dati, che sono caratterizzate dal contenere lunghi tubi sospesi su un foro.

Salva tutte le aree in un secondo file di fase. Passa alla modalità di esposizione. Aggiungi un ingrandimento di 59.000 x e inserisci un'apertura dell'obiettivo di 100 micrometri.

Quindi regolare lo stigmatismo oggettivo e l'intensità del fascio per una dose di circa 15 elettroni per angstrom al quadrato per esposizione. Tornare alla modalità di ricerca a basso dosaggio e spostarsi in una posizione salvata. Identificare e centrare un buon tubo.

Utilizzando l'interruttore della telecamera CCD sulla modalità di messa a fuoco, regolare la messa a fuoco e impostare un valore di sfocatura normalmente compreso tra 0,5 e 2,5 micrometri. Quindi passare alla modalità di esposizione e impostare un tempo di esposizione compreso tra 0,3 e 0,5 secondi per una dose di 15 elettroni per angstrom quadrato. Raccogli le immagini su una fotocamera a lastre, lasciando che le pellicole si depositino per 10 secondi prima di scattare un'esposizione.

Dopo la raccolta delle immagini, passare alla posizione salvata successiva e ripetere questo processo per raccogliere altre immagini. Sviluppare le pellicole a piena forza D 19 per 12 minuti. Quindi digitalizza le immagini utilizzando uno scanner Nikon Super cool scan 9, 000 ED con una dimensione dei pixel di 6,35 micrometri.

Un oggetto elicoidale può essere indicizzato in base a due parametri. L'ordine di Bessel N e il numero di linea dello strato L nella trasformata formatore del reticolo superficiale di un oggetto elicoidale. Ogni linea di strato è caratterizzata da N e L e corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficiale come indicato dagli indici H e K.

Per iniziare l'indicizzazione elicoidale, utilizzare il programma Helix boxer di Iman per inscatolare un tubo relativamente lungo e dritto con diametro uniforme e salvare l'immagine in formato MRC. Quindi misura il raggio del tubo utilizzando il programma boxer di Iman. Determinare la distanza di ripetizione HEL utilizzando un programma basato sulla correlazione incrociata come I-M-G-C-C-F nel pacchetto MRC.

Quindi calcola l'atrio. Trasforma con una nuova lunghezza della casella che è parte integrante della distanza di ripetizione. Quindi, scegli due linee di livello principali che definiscono due vettori di reticolo di superficie di base, uno zero e uno zero in unità di pixel FFT.

Determinare i numeri delle linee di layer e i raggi di ampiezza massima per le due linee di layer principali nella trasformata di Fourier. Dati i numeri delle linee di strato e i valori degli ordini di Bessel per le due linee principali degli strati, la rotazione tra le subunità e l'aumento assiale dell'elica di una stella possono essere ottenuti utilizzando la regola di selezione come descritto nella procedura scritta. Questi due numeri reali descrivono la simmetria della vite del tubo.

La ricostruzione 3D inizia con la segmentazione delle particelle utilizzando il programma Iman. Pugile. Dopo aver aperto una micrografia contenente particelle elicoidali, tagliare una particella in segmenti sovrapposti nel pannello di controllo del boxer. Scegli la modalità elica e imposta i parametri per l'inscatolamento.

La dimensione della scatola dovrebbe essere maggiore del diametro della particella e il valore di OLA dovrebbe essere circa il 90% della dimensione della scatola. Dopo aver lasciato il pulsante sinistro, facendo clic su una delle estremità del boxer di particelle, verrà generata automaticamente una serie di caselle di particelle lungo la lunghezza dell'elica, salvando i segmenti in scatola e le loro coordinate. Il passo successivo consiste nell'eseguire la ricostruzione 3D iniziale utilizzando il metodo iterativo di ricostruzione elicoidale nello spazio reale I-H-R-S-R prima dell'elaborazione con I-H-R-S-R.

Invertire il contrasto delle immagini cryo-EM e applicare il filtro passa-basso. Quindi aprire l'interfaccia grafica del programma I-H-R-S-R digitando generatore. Fornisci all'interfaccia grafica tutte le informazioni per la pila di particelle in scatola, incluso il nome e il percorso della pila, il numero di immagini nella pila e i valori per i parametri di simmetria.

Fare clic sul pulsante Fine per creare lo script di ricostruzione. B 25 SP. Utilizzo un cilindro pieno o cavo come riferimento iniziale e lascio scorrere la procedura fino a quando non ci sono cambiamenti nella simmetria della vite definita, che di solito si verifica dopo alcuni cicli. Una simmetria elicoidale retta dovrebbe fornire una ricostruzione convergente stabile.

La ricostruzione generata nell'ultimo ciclo sarà utilizzata come riferimento iniziale per ulteriori perfezionamenti. Infine, eseguire la ricostruzione 3D con il perfezionamento iterativo utilizzando la mappa di densità 3D generata da I-H-R-S-R come riferimento iniziale per un ulteriore perfezionamento durante il perfezionamento. La simmetria elicoidale è fissata alla rotazione tra le subunità e all'aumento assiale, che sono determinati dalla procedura I-H-R-S-R.

Successivamente, determinare la sfocatura e l'astigmatismo presenti nel micrografo utilizzando i programmi CTF find three e CTF tilt utilizzando i programmi a ragno denominati FT e mu moltiplicano i segmenti di particelle in base alla funzione di trasferimento del contrasto. Le CTF abbreviate eseguono la corrispondenza delle proiezioni confrontando le proiezioni dei volumi di riferimento con le immagini corrette CTF utilizzando l'allineamento multi-riferimento. La variazione dell'angolo di inclinazione fuori dal piano è limitata a più o meno 10 gradi e campionata in passi di un grado introduce vincoli come alti coefficienti di correlazione in angoli semplici vicini a zero gradi o 180 gradi e spostamenti X limitati.

Per i parametri di allineamento di ogni segmento, includere nella ricostruzione solo i segmenti che soddisfano i vincoli. Dopo ogni ciclo di raffinamento iterativo, viene generata una ricostruzione 3D utilizzando la retroproiezione e divisa per alcuni sopra il quadrato CTF impone la simmetria elicoidale per generare un volume di simmetrie. Il perfezionamento iterativo termina quando non si verifica alcun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D.

Un singolo gruppo di capside HIV one, un tubo 92 e, è stato inscatolato e la sua trasformata di Fourier è calcolata per l'indicizzazione elicoidale dei due raggi, sono stati determinati i numeri delle linee di strato e i raggi di massima ampiezza per le linee di strato uno zero e zero uno. I valori finali di 12 e 11 negativi sono stati quindi calcolati rispettivamente per uno zero e zero uno con una distanza di ripetizione di 5195,48 angstrom. La simmetria della vite del tubo è stata determinata come delta Z uguale a 6,81 angstrom e delta cinque uguale a 328,88 gradi, delta Z e delta cinque sono stati raffinati a 7,13 angstrom e 328,86 gradi utilizzando I-H-R-S-R e una ricostruzione iniziale è stata generata dopo 10 cicli iterativi.

La ricostruzione finale dopo il raffinamento iterativo ha migliorato significativamente la mappa di densità rispetto al modello iniziale calcolato con I-H-R-S-R. La mappa di densità dei tubi di assemblaggio del capside viene visualizzata come tre sezioni ortogonali parallele all'asse del tubo e vicine alla superficie, perpendicolari all'asse del tubo e parallele all'asse del tubo e passanti. La struttura visualizzata risulta dal rendering della superficie della mappa di densità 3D contornata a 1,8 Sigma che racchiude il 100% del volume.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come ottenere una struttura 3D di una molecola assemblata alleata utilizzando la microscopia elettronica del corvo.