Name: Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Scopri la ricostruzione 3D di strutture elicoidali con cryo-microscopia elettronica applicata agli assemblaggi capsidici di HIV-1. Questo metodo iterativo in spazio reale fornisce mappe di densità dettagliate per la biologia strutturale.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Gongpu Zhao e Danxia Ke per il supporto tecnico. Ringraziamo Drs. Edward Egelman e Niko Grigorieff per condividere il loro software di elaborazione delle immagini. Riconosciamo anche il personale che assiste la biologia strutturale Cryo-EM struttura e cluster Beowulf e griglia presso l&#39;Università di Pittsburgh School of Medicine. Questo lavoro è stato sostenuto da GM082251 e GM085043.

1. Frozen-idratata EM campione preparazione Perché l'HIV-1 proteina del capside (CA) assemblee 9 ​​sono stabili solo in sale alta (1M NaCl) tampone, che contribuisce forte rumore di fondo in Cryo-EM immagini, si usa una rapida diluizione e back-side metodo assorbente per ridurre temporaneamente il sale concentrazione nella preparazione del gelato-idratata griglia EM. <ol><li> Glow discharge il lato di carbonio di 200-mesh R2 / 1 griglie di rame Quantifoil sotto 25mA per 25 secondi. </li><li> Utilizzare un nebulizzatore per portare l'umidità nella camera ambientale, un fatto in casa stantuffo gravità manuale, al 80%. </li><li> Nella FEI Vitrobot pistone dewar, fresco etano liquido con azoto liquido. Montare il tuffo-congelamento dewar sul pistone gravità manuale. </li><li> Applicare 2,5 ml di soluzione CA preassemblati sul lato di carbonio della griglia, che è montato su pinza, e caricare la pinza sul pistone con il lato di carbonio della griglia di fronte lontano da voi. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone a bassa diluizione di sale (100 mM NaCl) per la parte posteriore della griglia e asciugare immediatamente tamponando la parte posteriore della griglia con un pezzo di carta da filtro. L'intera superficie posteriore della griglia dovrebbe essere a stretto contatto con la carta da filtro per circa 6 secondi, prima di rimuovere la carta da filtro. Immediatamente tuffo la griglia in etano liquido dopo aver rimosso la carta da filtro. </li><li> Rimuovere la pinza dal pistone e trasferire rapidamente la griglia in un contenitore griglia. </li></ol> 2. Crio-microscopio elettronico di CA assemblee tubolari <ol><li> Caricare il frozen-idratata griglia in una Polara microscopio FEI G2 operativo di elettroni a 200kV e dotato di una fotocamera Gatan 4Kx4K CCD. </li><li> Sotto basse dosi-modalità di ricerca, con un ingrandimento di circa 200x e con una dose &lt;0.001e - / A 2, la griglia schermo intero per le zone con ghiaccio idonee e salvare la posizione di queste aree in un file di scena. </li><li> Ricordiamo le posizioni salvate e schermo ulteriormente queste aree con un ingrandimento di 3.900 x in basse dosi-modalità di ricerca. Selezionare le aree con un uniforme, sottile strato di ghiaccio contenente ben separati, lunghi tubi sopra i buchi, per la raccolta dati. Salva la posizione di queste aree in un file di seconda fase. </li><li> Passa alla modalità di esposizione con un ingrandimento di 59.000 x, inserto di 100 micron apertura obiettivo, e regolare la stigmatism obiettivo e l'intensità del fascio per una dose di ~ 15 e - / a 2 per l'esposizione. </li><li> Tornare alla modalità a basso dosaggio di ricerca, passare a una posizione salvata e di identificare e centro di un tubo di buona con la fotocamera CCD. Passare alla modalità di messa a fuoco, regolare il fuoco, e impostare un valore di defocus, normalmente tra 0,5 e 2,5 micron. Passare alla modalità di esposizione, impostare un tempo di esposizione di 0.3-0.5 secondi, per una dose di 15 e - / A 2, e raccogliere un'immagine. Le immagini sono raccolte in una fotocamera piatto, e il film dovrebbe essere permesso di stabilirsi per 10 secondi prima che l'esposizione sia preso. </li><li> Passare alla posizione successiva salvati e ripetere il passaggio 5 per raccogliere altre immagini. </li><li> I film sono sviluppati in piena forza D19 per 12 minuti e digitalizzati utilizzando un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner con una dimensione dei pixel di 6,35 micron. Il formato di file di immagine TIFF è. </li></ol> 3. Elicoidale indicizzazione Un oggetto elicoidali possono essere indicizzati da due parametri: l'ordine di Bessel, n, e la linea il numero di livelli, l. Ogni linea di livello nella trasformata di Fourier, in quanto caratterizzato da (n, l), corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficie dell'oggetto elicoidale indicati con (h, k) gli indici, utilizzando la notazione da un reticolo 2D. Per ogni (h, k), una (n hk, l hk) linea strato è una combinazione lineare di due vettori di base (n = 10, l 10) e (n 01, l 01), che sono i valori di n e l le due linee principali strato (1, 0) e (0, 1). litri è disponibile presso l'altezza della linea strato misurato lungo l'asse Z la trasformata di Fourier. Il valore di n può essere stimato utilizzando la seguente equazione 10 πRr ≈ J n ≈ 1.1 | n | -0,9 .....................( 1) dove J n è la funzione di Bessel, che determina l'intensità della linea n ° strato, r è il raggio dell'oggetto elicoidale, e R è il raggio della massima ampiezza della linea strato. Il numero di riga strato, l, è legato al n per la regola di selezione 11 l = tn + um ....................( 2) dove t e u sono costanti dell'elica. Per qualsiasi elica data, ci possono essere unità esattamente u esattamente (o molto vicino) t complete giri. <ol><li> Box in un tubo relativamente dritto e lungo con diametro uniforme utilizzando il programma di EMAN 12 helixboxer e salvare l'immagine in formato MRC. </li><li> Determinare la distanza elicoidale ripeto, c, utilizzando un cross-correlazione programma basato, come 'imgccf', nel pacchetto MRC 13. </li><li> Calcolare la trasformata di Fourier con una lunghezza nuova scatola che è parte integrante della distanza ripeto, c. </li><li> Scegliere due linee principali strati che definiscono due vettori di base reticolo superficiale (1,0) e (0,1). </li><li> Misurare il raggio del tubo, r, e l'altezza e il raggio delle due linee principali strato in trasformata di Fourier, L 10, R 10, L 01 ​​R 01, rispettivamente (Fig. 1). </li><li> Calcolare n 10 e n 01 secondo l'equazione (1). </li><li> Dal momento che n valori sono solo stime, alcune combinazioni di n 10 en 01 sono testati nelle fasi successive (vedere il punto 4.2) per trovare la corretta simmetria elicoidale IHRSR utilizzando il pacchetto di programmi. </li><li> Calcolare la simmetria vite descritto da due numeri reali: la rotazione tra subunità (Δφ) e la crescita assiale (Δz) di one-stella elica (n = 1). Dato l 10, l 01, n 10, n 01 e ​​valori, u e t può essere ottenuta con test un intervallo di valori m (per esempio, -50 &lt;m &lt;50) secondo la regola di selezione. Infine, Δφ e Δz sono calcolati utilizzando Δφ = 360 t / u e Δz = c / u. </li></ol> 4. Ricostruzione tridimensionale <ol><li> Particelle di segmentazione <ol><li> Aprire una micrografia contenente particelle elicoidale, con il Boxer grafica del programma, che è un programma nel pacchetto EMAN. </li><li> Tagliare la particella elicoidale in segmenti che si sovrappongono. Nel pannello di controllo di Boxer, scegliete la modalità Helix e impostare i parametri per il pugilato: la dimensione della casella deve essere maggiore del diametro della particella e il valore per 'Olap' dovrebbe essere ~ 90% della dimensione del box. </li><li> Dopo aver lasciato clic su entrambe le estremità della particella elicoidale, Boxer genera automaticamente una serie di caselle particella lungo la lunghezza elica. </li><li> Salva segmenti in scatola e le loro coordinate. </li></ol></li><li> Iniziale ricostruzione 3D utilizzando programmi IHRSR <ol><li> Invertire il contrasto della Cryo-EM immagini e applicare filtri passa-basso 14 (opzionale) prima del trattamento con il metodo iterativo elicoidale reale ricostruzione spazio (IHRSR). </li><li> Aprire l'interfaccia grafica del programma IHRSR digitando "Generator". Forniscono l'interfaccia grafica con tutte le informazioni per la pila in scatola particelle, incluso il nome e il percorso dello stack, il numero di immagini in stack, i valori per i parametri di simmetria, ecc Clicca su "Fine" per creare lo script ricostruzione, b25.spi. </li><li> Utilizzare un cilindro pieno o vuoto come riferimento iniziale e consentire la procedura di ciclo fino a quando non ci sono cambiamenti nella simmetria vite definito, che si verifica in genere dopo pochi cicli. Una simmetria elicoidale destra dovrebbe dare una ricostruzione stabilmente convergente. La ricostruzione generata nel ciclo verrà utilizzato come riferimento iniziale per un ulteriore affinamento. IHRSR esegue ricostruzione 3D tramite programmi di SPIDER. </li></ol></li><li> Ricostruzione con raffinamento iterativo 15 La ricostruzione 3D generato da IHRSR è ora utilizzato come riferimento iniziale per ulteriore affinamento. Durante la raffinatezza, la simmetria elicoidale è fissata a Δφ e Δz, che sono determinati dalla procedura IHRSR. <ol><li> Determinare la defocus e presente astigmatismo nella micrografia utilizzando programmi CTFFIND3 e CTFTILT 16. </li><li> Moltiplicare i segmenti delle particelle dal CTF utilizzando programmi SPIDER 17. L'operazione denominata FT nella suite SPIDER è utilizzata per calcolare la trasformata di Fourier (FFT) dell'immagine 2D. Successivamente, la FFT è moltiplicato per i valori CTF, determinati nei passi precedenti, con l'operazione denominata MU all'interno della suite SPIDER. Il valore ottenuto viene poi trasformata inversa di nuovo per formare una nuova immagine (CTF-corrected) nello spazio reale utilizzando l'operazione SPIDER, FT di nuovo. </li><li> Eseguire corrispondenza proiezione confrontando proiezioni dei volumi di riferimento con il CTF-correzione delle immagini, con riferimento multi-allineamento. La variazione in out-of-plane angolo di inclinazione è limitata a + / -10 ° e campionato di 1 °. Introdurre vincoli, come ad esempio i coefficienti di correlazione elevata, nel piano angoli vicino a 0 ° o 180 ° e limitati x-turni, per i parametri di allineamento di ogni segmento. Includere nella ricostruzione solo i segmenti che soddisfano i vincoli. </li><li> Dopo ogni ciclo iterativo raffinatezza, una ricostruzione 3D viene generato utilizzando la proiezione posteriore e somma divisa per il CTF2. </li><li> Imporre la simmetria elicoidale di generare un volume simmetrizzate. Il raffinamento iterativo termina quando nessun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D si verifica. </li><li> L'elaborazione dell'immagine SPIDER pacchetto viene utilizzato per la maggior parte dei passi di raffinamento. Una serie di operazioni sono controllate da script SPIDER, che sono file creati dall'utente controllo batch contenente sequenze di operazioni e di valori dei parametri. La ricostruzione finale viene calcolato utilizzando programmi in SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un singolo di HIV-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) era fuori in scatola e la sua trasformata di Fourier (Fig. 1b) è stata calcolata per l'indicizzazione elicoidale. Per linee strato (1, 0) e (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Dato un raggio del tubo di 211.57Å, abbiamo approssimato n 10 =- 12, n 01 = 11 (qui, la prepotenza era predeterminato). Con una distanza di ripetere 5195.48Å, la simmetria vite del tubo è stato determinato come Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz e Δφ erano raffinato per 7.1321Å e 328,86 ° con IHRSR (Fig. 2a) e la ricostruzione iniziale è mostrato in fig. 2b. La ricostruzione finale (Fig. 3), dopo il raffinamento iterativo, ha migliorato la mappa densità significativamente dal modello iniziale calcolato con IHRSR (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indicizzazione di HIV-1 tubo CA elicoidale. (A) Un singolo virus HIV-1 CA immagine tubo A92E. Scala grafica, 30 nm. (B) La trasformata di Fourier del tubo mostrato in (A). Gli indici elicoidale (n = 10 =- 12, n 01 = 11) sono indicati. I punti di punta di freccia alla linea di livello alla risoluzione 23A. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una prima ricostruzione utilizzando IHRSR. (A) simmetria determinazione a vite per ogni ciclo iterativo. Δφ e Δz, a partire dai valori iniziali, convergono ai valori stabili dopo 10 cicli iterativi raffinatezza. (B) La mappa 3D di densità iniziale dopo 10 cicli iterativi. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La mappa 3D di densità dopo il raffinamento iterativo. (AC) La mappa densità di CA tubi viene visualizzato come tre fette ortogonali: parallela all'asse del tubo e vicino alla superficie (A), perpendicolare all'asse del tubo (B), e la parallela e attraverso l'asse del tubo (C) . Barre di scala, a 10 nm. (D) il rendering di superficie della mappa 3D di densità sagomato a 1.8s racchiude 100% vol.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo una serie di protocolli per fornire un approccio diretto per ottenere strutture 3D di oggetti elicoidali. Usando le procedure descritte, abbiamo acquisito una struttura 3D di HIV-1 di assemblaggio del capside da un&#39;immagine singolo tubo (176 segmenti). Strutture ad alta risoluzione può essere ottenuto inserendo i dati delle immagini più. Ci sono diversi punti critici per ottimizzare la raccolta e analisi dei dati: in primo luogo, durante la preparazione di un Cryo-EM campione, la soluzione campione deve essere cancellato, lasciando una divisa, sottile strato di soluzione che è leggermente più spesso rispetto alla dimensione del campione. Ci sono diversi modi per cancellare il campione. Per le cellule batteriche e campioni tubolari, come l&#39;HIV-1 CA di montaggio, cancellando da un lato, in particolare dal lato posteriore, è più appropriato. In secondo luogo, la prepotenza della spirale deve essere determinato, in quanto questo non può essere fatto con l&#39;indicizzazione elicoidale o ricostruzione. Una pratica comune è quella di utilizzare freeze-etching, seguita da rotante shadowing 18 a determinare la manualità. Manualità può essere determinata anche post-ricostruzione quando la risoluzione della mappa di densità è sufficientemente alto, i modelli 3D atomici dei singoli componenti dovrebbe inserirsi bene nella mappa della densità quando una manualità corretta è assunto. Altrimenti, la prepotenza opposto dovrebbe essere assunto. In terzo luogo, un filtro Wiener deve essere usato durante l&#39;elaborazione delle immagini, sia per la correzione di fase e ampiezza, per ridurre l&#39;amplificazione del rumore. Dal momento della CTF da una singola immagine è sempre zero crossing, parte delle informazioni nello spazio reciproco è perduto. Pertanto, è necessario disporre di dati più set di proiezione 3D incluso per la ricostruzione, ognuno ripreso a valori defocus diversi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Fonte </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Glow-scarico dispositivo 100X </td><td> Glow-scarico dispositivo 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscopio con una pistola Field Emission </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K telecamera CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Tuffo-congelamento dispositivo </td><td></td><td> Fatto in casa manuale stantuffo gravità </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-carbonio griglie di rame </td><td> Quantifoil Micro Strumenti, Jena, Germania </td><td></td></tr><tr><td> EM software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programmi disponibili da Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Spider </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC base elicoidale software di elaborazione </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programmi disponibili da Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT e Real-space software raffinatezza elicoidale </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

struttura del virus hiv-1 assemblee capsidico da cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-microscopia elettronica (cryo-EM), combinata con l&#39;elaborazione delle immagini, è uno strumento sempre più potente per la determinazione della struttura di complessi proteici macromolecolari e assiemi. In realtà, solo la microscopia elettronica di particelle 1 e bidimensionali (2D) cristallografia elettroni 2 sono diventati metodologie relativamente di routine e un gran numero di strutture sono stati risolti con questi metodi. Allo stesso tempo, l&#39;elaborazione delle immagini e tridimensionali (3D) la ricostruzione di oggetti elicoidale si è rapidamente sviluppata, in particolare, il iterativo elicoidale nello spazio reale ricostruzione (IHRSR) metodo 3, che utilizza solo strumenti di analisi delle particelle in collaborazione con simmetria elicoidale. Molte entità biologiche funzione in forme filamentose o elicoidali, tra filamenti di actina 4, microtubuli 5, fibre amiloidi 6, virus del mosaico del tabacco 7, e flagelli batteri 8, e, perché una mappa 3D di densità un&#39;entità elicoidale può essere raggiunta da un&#39;unica proiezione immagine, rispetto alle molte immagini necessarie per la ricostruzione 3D di un oggetto non-elicoidale, con il metodo IHRSR, l&#39;analisi strutturale di tali assiemi flessibili e disordinato elicoidale è ora raggiungibile. In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati per l&#39;ottenimento di una mappa 3D di densità di un assemblaggio di proteine ​​elicoidale (HIV-1 capside 9 è il nostro esempio), compresi i protocolli per Cryo-EM preparazione dei campioni, a bassa dose di raccolta dati da parte di Cryo-EM, l&#39;indicizzazione di modelli di diffrazione elicoidali, e l&#39;elaborazione delle immagini e la ricostruzione 3D utilizzando IHRSR. Rispetto ad altre tecniche, Cryo-EM offre la conservazione ottimale del campione in condizioni quasi nativa. I campioni sono incorporati in un sottile strato di ghiaccio vitreo, di congelamento rapido, e ripreso in microscopi elettronici alla temperatura dell&#39;azoto liquido, in condizioni di basse dosi di ridurre al minimo i danni da radiazioni. Immagini di esempio sono ottenuti in condizioni quasi nativa a discapito di segnale basso e basso contrasto nel micrografie registrato. Fortunatamente, il processo di ricostruzione elicoidale è stato in gran parte automatizzato, con l&#39;eccezione di indicizzazione del modello elicoidale di diffrazione. Qui, descriviamo un approccio alla struttura dell&#39;indice elicoidale e determinare simmetrie elicoidale (parametri elicoidale) da micrografie digitalizzati, un passo essenziale per la ricostruzione 3D elicoidale. In breve, si ottiene una mappa 3D di densità iniziale applicando il metodo IHRSR. Questa mappa iniziale è poi iterativamente raffinato con l&#39;introduzione di vincoli per i parametri di allineamento di ogni segmento, controllando così la loro gradi di libertà. Un ulteriore miglioramento si ottiene attraverso la correzione per la funzione di trasferimento contrasto (CTF) del microscopio elettronico (correzione di ampiezza e fase) e ottimizzando la simmetria elicoidale del gruppo.

Questo articolo descrive un metodo per ottenere un modello tridimensionale (3D) struttura delle molecole elicoidale assemblati con crio-microscopia elettronica. In questo protocollo, utilizziamo gruppi di HIV-1 capside per illustrare la procedura dettagliata ricostruzione 3D per ottenere una mappa della densità del iterativo elicoidale reale spazio metodo di ricostruzione.

Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

La criomicroscopia elettronica (cryo-EM), combinata con l'elaborazione delle immagini, è uno strumento sempre più potente per la determinazione strutturale di proteine macromolecolari...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo per ottenere una struttura tridimensionale di molecole assemblate di heli mediante microscopia elettronica a criogenia. Il protocollo inizia con la preparazione del campione per microscopia elettronica a criogenia, utilizzando un metodo di diluizione rapida e asciugatura dal lato opposto per ridurre transitoriamente la concentrazione di sale durante la preparazione della griglia elettronica congelata e idratata. Questo processo garantisce la stabilità della proteina riducendo al contempo il rumore di fondo e migliorando il rapporto segnale-rumore durante l'acquisizione di dati a basso dosaggio in microscopia elettronica a criogenia che segue successivamente alla raccolta dei dati.È completato l'indicizzazione elicoidale dei modelli di diffrazione. Successivamente viene eseguita l'elaborazione delle immagini, seguita dalla ricostruzione tridimensionale nello spazio reale, che porta alla mappa di densità finale del capside del virus dell'HIV o del tubo ca. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché esistono diversi punti critici per una raccolta e un'analisi ottimali dei dati.Ad esempio, nel caso dell'HIV, si formano assemblaggi tubolari del capside che si sviluppano rapidamente in una soluzione madre unimolare riducendo la concentrazione di sale senza alterare la struttura. È fondamentale ottenere immagini di alta qualità mediante microscopia crioelettronica. Data un'immagine di un tubo, risulta molto difficile capire come procedere per indicizzare un tubo critico e quale software potrebbe essere utilizzato per effettuare la ricostruzione tridimensionale.Questo video offre un approccio dettagliato e semplice per ottenere una ricostruzione tridimensionale di oggetti fisici e può essere utilizzato come riferimento per il tuo esperimento. Dimostrerò la procedura insieme alla dott.ssa Puja. Siamo entrambi ricercatori postdottorandi del laboratorio del dottor. Per preparare gli assemblaggi della proteina del capside dell'HIV per la microscopia crioelettronica, inizia con la scarica al plasma della faccia con rivestimento di carbonio delle griglie di rame da 200 mesh, applicando 25 milliampere per 25 secondi.Utilizzare un nebulizzatore per portare l'umidità all'80% nella camera ambientale, che è un pistone manuale a gravità fatto in casa. Nel frattempo, raffreddare l'etano liquido in un pistone in vetro con azoto liquido, quindi montare il dispositivo per la congelazione immersione sul pistone manuale a gravità. Successivamente, utilizzare una pinza per chiudere le ganasce sul bordo della griglia.Applicare 2,5 microlitri di una soluzione proteica preassemblata sul lato al carbonio della griglia. Successivamente, posizionare la pinzetta sul pistone con il lato al carbonio della griglia rivolto verso l'esterno. Aggiungere tre microlitri di tampone di diluizione a bassa salinità sul retro della griglia.Asciugare immediatamente la griglia con un pezzo di carta da filtro sullo stesso lato. Mantenere l'intera superficie posteriore della griglia a stretto contatto con la carta da filtro per circa sei secondi. Dopo aver rimosso la carta da filtro, immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido.Infine, rimuovere la pinzetta dallo stantuffo e trasferire rapidamente la griglia in una scatola di conservazione per griglie. Iniziare la microscopia elettronica criogenica caricando la griglia congelata idratata in un microscopio elettronico FEI Polara G2, funzionante a 200 chilovolt e dotato di una telecamera CCD Gatan da 4K per 4K.In modalità di ricerca a basso dosaggio, aggiungere un'ingrandimento di circa 200 x. Esaminare l'intera griglia alla ricerca di aree con ghiaccio adatto. Salvare le posizioni di queste aree in un file della piastra. Ricordare le posizioni salvate ed esaminare ulteriormente queste aree. Impostare un ingrandimento di 3.900x in modalità di ricerca a basso dosaggio. Selezionare le aree con uno strato di ghiaccio uniforme e sottile per la raccolta dei dati, caratterizzate dalla presenza di lunghi tubi sospesi sopra un foro.Salvare tutte le aree in un file di secondo stadio. Passare alla modalità di esposizione. Aggiungere un'ingrandimento di 59.000 x e inserire un diaframma obiettivo da 100 micrometri.Quindi regolare lo stigma dell'obiettivo e l'intensità del fascio per una dose di circa 15 elettroni per angstrom quadrato per esposizione. Tornare alla modalità di ricerca a bassa dose e spostarsi su una posizione salvata. Identificare e centrare un buon tubulo.Utilizzando la telecamera CCD, passare alla modalità di messa a fuoco, regolare il fuoco e impostare un valore di sfocatura normalmente compreso tra 0,5 e 2,5 micrometri. Successivamente, passare alla modalità di esposizione e impostare un tempo di esposizione di 0,3-0,5 secondi per una dose di 15 elettroni per angstrom quadrato. Acquisire le immagini con una camera a lastre, lasciando stabilizzare i film per 10 secondi prima di effettuare l'esposizione.Dopo aver acquisito le immagini, passare alla posizione salvata successiva e ripetere questo processo per raccogliere ulteriori immagini. Sviluppare le pellicole con D 19 alla concentrazione piena per 12 minuti. Successivamente, digitalizzare le immagini utilizzando uno scanner Nikon Super cool scan 9.000 ED con una dimensione del pixel di 6,35 micrometri.Un oggetto elicoidale può essere indicizzato mediante due parametri: l'ordine di Bessel N e il numero di linea di strato L nella trasformata di Fourier del reticolo superficiale di un oggetto elicoidale. Ogni linea di strato è caratterizzata da N e L e corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficiale indicato dagli indici H e K.Per iniziare l'indicizzazione elicoidale, utilizzare il programma Helix boxer di Iman per delimitare un tubo relativamente lungo e dritto con diametro uniforme e salvare l'immagine in formato MRC. Successivamente, misurare il raggio del tubo utilizzando il programma boxer di Iman. Determinare la distanza del ripetizione dell'elica (HEL) mediante un programma basato sulla correlazione incrociata, come I-M-G-C-C-F nel pacchetto MRC.Quindi calcolare il foyer. Trasformare con una nuova lunghezza della scatola che sia un multiplo intero della distanza di ripetizione. Successivamente, scegliere due linee principali del reticolo che definiscono due vettori fondamentali del reticolo superficiale, uno zero e zero uno, in unità di pixel della FFT.Determinare i numeri delle linee stratificate e i raggi di massima ampiezza per le due linee stratificate principali nella trasformata di Fourier. Dati i numeri delle linee stratificate e i valori degli ordini di Bessel per le due linee stratificate principali, la rotazione tra le sottounità e l'avanzamento assiale dell'elica monostellata possono essere ottenuti utilizzando la regola di selezione descritta nella procedura scritta. Questi due numeri reali descrivono la simmetria elicoidale del tubo.La ricostruzione 3D inizia con la segmentazione delle particelle utilizzando il programma Iman.Boxer. Dopo aver aperto una micrografia contenente particelle elicoidali, tagliare una particella in segmenti sovrapposti nel pannello di controllo di Boxer. Selezionare la modalità elica e impostare i parametri per il delimitamento.La dimensione della scatola dovrebbe essere maggiore del diametro della particella e il valore per OLA dovrebbe essere circa il 90% della dimensione della scatola. Dopo aver fatto clic su una delle due estremità della scatola della particella, verrà generata automaticamente una serie di scatole di particelle lungo la lunghezza dell'elica, salvando sia i segmenti delimitati che le loro coordinate. Il passo successivo consiste nell'eseguire una ricostruzione tridimensionale iniziale utilizzando il metodo di ricostruzione iterativa nello spazio reale elicoidale, noto come I-H-R-S-R, prima dell'elaborazione con I-H-R-S-R.Invertire il contrasto delle immagini di microscopia elettronica criogenica ed applicare un filtro PASSA-BASSO. Successivamente, aprire l'interfaccia grafica del programma I-H-R-S-R digitando generator. Fornire all'interfaccia grafica tutte le informazioni relative allo stack delle particelle selezionate, inclusi il nome e il percorso dello stack, il numero di immagini nello stack e i valori dei parametri di simmetria.Fare clic sul pulsante di completamento per creare lo script di ricostruzione. B 25 SP.I utilizza un cilindro solido o cavo come riferimento iniziale e permette al procedimento di ciclare finché non si verificano più variazioni nella simmetria a vite definita, il che di solito avviene dopo alcuni cicli. Una simmetria elicoidale destrorsa dovrebbe fornire una ricostruzione stabilmente convergente.La ricostruzione generata nell'ultimo ciclo verrà utilizzata come riferimento iniziale per un'ulteriore affinamento. Infine, eseguire la ricostruzione tridimensionale con affinamento iterativo utilizzando la mappa di densità 3D generata da I-H-R-S-R come riferimento iniziale per un affinamento aggiuntivo durante il processo di affinamento. La simmetria elicoidale è fissata all'angolo di rotazione tra le sottounità e all'avanzamento assiale, che sono determinati a partire dalla procedura I-H-R-S-R.Successivamente, determinare la defocalizzazione e l'astigmatismo presenti nella microfotografia utilizzando i programmi CTF find three e CTF tilt mediante programmi spider denominati FT e mu moltiplicando i segmenti delle particelle per la funzione di trasferimento del contrasto. Abbreviato CTF, eseguire l'allineamento per proiezione confrontando le proiezioni dei volumi di riferimento con le immagini corrette per la CTF utilizzando un allineamento multiplo di riferimento. La variazione dell'angolo di inclinazione fuori dal piano è limitata a più o meno 10 gradi ed è campionata con passi di un grado; si introducono vincoli come coefficienti di correlazione elevati per angoli nel piano prossimi a zero gradi o 180 gradi e spostamenti X limitati.Per i parametri di allineamento di ciascun segmento, includere nella ricostruzione solo quei segmenti che soddisfano i vincoli. Dopo ogni ciclo di affinamento iterativo, viene generata una ricostruzione 3D mediante retroproiezione e divisa per il quadrato della CTF, quindi viene imposta la simmetria elicoidale per generare un volume con simmetrie. L'affinamento iterativo termina quando non si verifica alcun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D.Un singolo assemblaggio del capside di HIV, un tubo di 92 e, è stato delimitato e la sua trasformata di Fourier è stata calcolata per l'indicizzazione elicoidale dei due raggi; sono stati determinati i numeri delle linee layer e i raggi di ampiezza massima per le linee layer uno zero e zero uno. Sono stati quindi calcolati i valori finali di meno 12 e 11 rispettivamente per uno zero e zero uno, con una distanza di ripetizione di 5195,48 angstrom. La simmetria elicoidale del tubo è stata determinata come delta Z uguale a 6,81 angstrom e delta cinque uguale a 328,88 gradi; delta Z e delta cinque sono stati affinati a 7,13 angstrom e 328,86 gradi utilizzando I-H-R-S-R ed è stata generata una ricostruzione iniziale dopo 10 cicli iterativi.La ricostruzione finale, dopo un affinamento iterativo, ha migliorato in modo significativo la mappa di densità rispetto al modello iniziale calcolato con I-H-R-S-R. La mappa di densità dei tubi di assemblaggio del capside è mostrata come tre sezioni ortogonali parallele all'asse del tubo e vicine alla superficie, perpendicolari all'asse del tubo e parallele e passanti attraverso l'asse del tubo. La struttura visualizzata deriva da una rappresentazione superficiale della mappa tridimensionale di densità, contornata a 1,8 Sigma e che racchiude il 100% del volume.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una struttura 3D di una molecola assemblata in modo allelico utilizzando la microscopia elettronica criogenica.

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