Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

L'interesse per la microscopia elettronica liquida è salito alle stelle negli ultimi anni, come ora possiamo visualizzare nei processi in tempo reale su scala nanometrica. Una migliore conoscenza di queste strutture flessibili può aiutarci a sviluppare nuovi reagenti per combattere agenti patogeni emergenti come SARS-CoV-2. Osservare le proteine in un ambiente fluido aiuta a imitare i sistemi biologici e ci dà l'opportunità di guardare le proteine in modo più dinamico.

E questo esperimento ti mostrerà nuove tecniche su come utilizzare e visualizzare le proteine sia in ambienti di ghiaccio vitreo che liquidi. I risultati recenti includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini nelle terapie a base di anticorpi visualizzate in liquido. Le applicazioni correlate liquide e crio-EM migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per la salute e le malattie umane.

I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l'implementazione di flussi di lavoro EM liquidi per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie. I sistemi liquid-EM disponibili in commercio possono fornire flusso, miscelazione, stimoli elettrochimici e controllo della temperatura, che sono essenziali per molte applicazioni di imaging in tempo reale. Il metodo a sandwich di microchip qui presentato descrive un modo semplice per visualizzare i campioni in liquido prima di fare il salto verso un sistema commerciale più complesso per esperimenti in situ.

Per iniziare, pulire i microchip di nitruro di silicio incubando ciascun chip in 150 millilitri di acetone per due minuti, seguito dall'incubazione in 150 millilitri di metanolo per due minuti. Lasciare asciugare i trucioli in un flusso d'aria laminare. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento di scarica a bagliore funzionante in condizioni standard per 45 secondi utilizzando gas argon.

Quindi, caricare un microchip a base secca nella punta del supporto del campione e aggiungere circa 0,2 microlitri del campione al chip di base. Dopo l'incubazione per uno o due minuti, posizionare il chip superiore sul chip di base bagnato contenente il campione. Piantate insieme l'assieme per formare un involucro ermeticamente sigillato tenuto in posizione meccanicamente da tre viti in ottone.

Pompare la punta a 10 a meno sei torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbo pompata. Il supporto è ora pronto per essere inserito nel TEM. Pulire al plasma i microchip e le griglie di carbonio utilizzando uno strumento di scarica del bagliore per 45 secondi.

E aggiungi circa due microlitri di campione a un microchip scaricato a bagliore posto su un pacchetto di gel. Rimuovere la soluzione in eccesso con carta da filtro o una pipetta e incubare per uno o due minuti. Quindi aggiungere la griglia di carbonio scaricata a bagliore al microchip bagnato contenente il campione.

Piantare insieme l'assieme utilizzando un singolo portacampioni inclinabile a temperatura ambiente per formare un involucro ermeticamente sigillato. In alternativa, utilizzate le clip a griglia con caricamento automatico e posizionate il gruppo sandwich sulla clip C inferiore. Posizionare la clip superiore sopra il gruppo e utilizzare lo strumento di serraggio standard per sigillare il gruppo.

Il campione è ora pronto per essere inserito nel TEM. Esaminare i campioni posti in caricatori automatici in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente. Per l'imaging liquido-EM, caricare il portacampioni nel TEM dotato di una pistola ad emissione di campo e operare a 200 kilovolt.

Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione oscillante, inclinando il campione da meno 15 gradi a più 15 gradi nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione Z per adattarsi allo spessore del campione e aiuta a garantire un ingrandimento accurato durante la registrazione dell'immagine. Registra le immagini come filmati con fotogrammi lunghi o singole immagini utilizzando il pacchetto software di raccolta dati seriale, implementando routine di imaging automatizzate.

Acquisisci immagini in condizioni di basso dosaggio con ingrandimenti compresi tra 28.000X e 92.000X e 40 fotogrammi al secondo. Regolare i tempi di esposizione per ridurre al minimo i danni del fascio al campione e utilizzare un intervallo di sfocatura da meno uno a quattro micrometri all'ingrandimento specificato. Se viene rilevata una soluzione spessa, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare un'area di interesse diversa.

Assicurarsi che la soluzione sia presente nei campioni durante la sessione di imaging focalizzando il fascio di elettroni su un'area sacrificale non utilizzata per la raccolta dei dati fino a quando non si formano bolle. Analizza i filmati per le particelle di SARS-CoV-2 utilizzando il programma RELION-3.0.8 o qualsiasi altro software di elaborazione delle immagini. Eseguire la correzione del movimento utilizzando il programma MotionCor2.

Una volta corrette, estrarre le particelle utilizzando lo strumento di auto-picking nel pacchetto software del programma. Le dimensioni tipiche delle scatole sono 330 pixel per i campioni liquidi e 350 pixel per i campioni di ghiaccio. Calcola le ricostruzioni iniziali utilizzando la simmetria C1 con la routine del modello iniziale 3D del programma e le opzioni del modello ab initio nel pacchetto software di elaborazione dati.

Quindi eseguire protocolli di perfezionamento nel software di elaborazione dati. Esaminare i risultati utilizzando un pacchetto software di analisi della struttura molecolare durante la valutazione dei cambiamenti dinamici. Qui viene mostrato un confronto tra strutture liquido-EM e crio-EM nel sottotipo tre o AAV del virus adeno-associato.

Le immagini rappresentative mostrano la struttura di AAV nella soluzione e nel ghiaccio. Le viste rotazionali della subunità AAV VP1 estratta dalle strutture liquide e ghiacciate sono mostrate qui. Queste immagini rappresentano i valori dinamici nelle strutture liquide generate utilizzando la funzione morph map nel software di analisi della struttura molecolare.

Le strutture medie di più gruppi di virus mostrano cambiamenti conformazionali con una variazione di diametro di quasi il 5% misurata utilizzando i dati EM. Qui viene mostrata un'immagine degli assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 isolati da frazioni sieriche di pazienti COVID-19. Queste bolle bianche indicano la presenza di liquido nel campione.

Una ricostruzione EM di questi assemblaggi subvirali è mostrata qui con densità radiali colorate a cinque fette nanometriche attraverso la mappa. L'immagine rappresentativa descrive l'analisi delle particelle a doppio strato di rotavirus preparate nel ghiaccio vitreo utilizzando la tecnica del sandwich con microchip. L'uso di detergenti, glicerolo, polietilene, glicoli e alti livelli di zuccheri dovrebbe essere ridotto al minimo o evitato per l'imaging liquido-EM.

Questi reagenti possono introdurre artefatti, creare eccessivi gorgoglii, prodotti di idrolisi e radicali liberi a causa di danni al fascio. L'uso di questi protocolli consentirà agli scienziati di essere in grado di studiare i processi dinamici a dettaglio atomico. E questo si estende a più campi della scienza, tra cui medicina, scienze della vita e ricerca sui materiali.

I protocolli qui presentati descrivono come strumenti all'avanguardia possano fornire un mezzo entusiasmante per visualizzare macromolecole biologiche attraverso nuovi occhi. Il campo della microscopia elettronica liquida può elevare il modo in cui studiamo questi nuovi virus che rappresentano una minaccia per la salute umana, forse anche contribuendo alle nostre misure di preparazione alla pandemia.