Saggio di motilità invertita: una tecnica in vitro per visualizzare il movimento della miosina su filamenti di actina immobilizzati

La miosina, una proteina motrice, ha un dominio globulare della testa che interagisce con l'actina, una proteina filamentosa. Questa interazione è essenziale per la traslocazione della miosina lungo i filamenti di actina. Per studiare questo legame in vitro, eseguire un saggio di motilità invertita della miosina su actina legata alla superficie.

Per iniziare, assemblare una camera di saggio posizionando un vetrino coprioggetti rivestito di glicole polietilenico biotinilato su un vetrino da microscopio in modo che la superficie rivestita sia rivolta verso l'interno, creando la parte superiore della camera.

Passare una soluzione contenente avidina, una glicoproteina, attraverso la camera. L'avidina si lega alla biotina con elevata affinità, che migliora l'adesione dell'actina. Successivamente, fluire in filamenti di actina marcati con biotina marcati con un fluoroforo rosso. Il ligando della biotina si lega all'avidina, immobilizzando i filamenti sulla superficie del vetrino.

Infine, aggiungi le proteine della miosina 5A marcate con proteine fluorescenti verdi in un tampone contenente molecole di adenosina trifosfato, o ATP. La miosina 5A a doppia testa, contenente una testa posteriore e una anteriore, interagisce con i filamenti di actina immobilizzati. La testa posteriore della miosina si lega a un ATP e si stacca dall'actina.

L'idrolisi dell'ATP genera un colpo di potenza, consentendo alla testa posteriore di legarsi in una posizione davanti alla testa principale lungo il filamento. Attraverso colpi di potenza successivi, la miosina si muove lungo il filamento di actina immobilizzato senza staccarsi.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, registrare il movimento delle molecole di miosina verde sui filamenti rossi di actina.

Preparare le soluzioni per il test della motilità invertita della miosina 5a e tenerle in ghiaccio.

Lavare la camera con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT. Flusso in 10 microlitri da 1 milligrammo per millilitro BSA in tampone di motilità con DTT. Ripeti l'operazione due volte, aspettando un minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare un fazzoletto o carta da filtro per far passare la soluzione attraverso il canale posizionando delicatamente l'angolo della carta all'uscita della camera di flusso.

Quindi, lavare la camera con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT tre volte. Versare 10 microlitri della soluzione di NeutrAvidin in tampone di motilità con DTT e attendere un minuto. Quindi, lavare con 10 microlitri di quella soluzione tre volte.

Versare 10 microlitri di tampone di motilità contenente bRh-actina con DTT utilizzando un puntale per pipetta di grandi dimensioni e attendere un minuto. Quindi, lavare con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT tre volte.

Versare 30 microlitri di tampone finale con 10 nanomolari di miosina 5a e caricare immediatamente sul microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale. Avviare la registrazione una volta trovata la messa a fuoco ottimale per l'imaging TIRF.