Name: Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Scopri come determinare la cinetica di legame antigene-anticorpo di alta affinità utilizzando quattro piattaforme biosensore. Questo metodo aiuta i ricercatori a selezionare la tecnologia più affidabile per la scoperta di farmaci.

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Gli autori ringraziano Noah Ditto e Adam Miles per l&#39;assistenza tecnica sul IBIS MX96.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
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<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

spese di pubblicazione di questo video-articolo sono stati pagati da Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Il nostro studio di confronto testa a testa mostra che ogni piattaforma biosensore ha i suoi punti di forza e di debolezza. Anche se i profili di legame degli anticorpi sono simili per confronto visivo (figure 3 - 6), e l&#39;ordine di classificazione delle costanti di velocità cinetiche acquisiti sono altamente coerente tra gli strumenti (Figura 7), i nostri risultati dimostrano che gli strumenti SPR-based con continui fluidica flusso) sono meglio a risolvere le interazioni ad alta affinità con tassi di dissociazione lenti. Deriva verso l&#39;alto durante la fase di dissociazione si osserva in set di dati (ad esempio, mAb 2, mAb 5, e mAb 9; figura 5) generato dal fluidica libere strumento BLI. Questo risultato può essere attribuito in gran parte per evaporazione campione nel tempo nella micropiastra, che è una limitazione principale del sistema. Con questa limitazione intrinseca, il tempo sperimentale è anche limitato a meno di 12 h; gli esperimenti sono stati quindi programmati con shvolte Orter (500 s associazione e 30 min dissociazione) rispetto a quelle delle altre piattaforme (10 min associazione e 45 min dissociazione). Tuttavia, accorciando il tempo sperimentale non sembra attenuare l&#39;impatto di evaporazione sulla qualità dei dati / coerenza, come le costanti di velocità generate dallo strumento BLI basata show less linearità a causa delle fluttuazioni in alcune delle off-rate (Figura 8C ). Oltre a evaporazione del campione, le differenze di reagenti di cattura utilizzati possono hanno anche contribuito alle differenze nei risultati ottenuti. Mentre la proteina A / G è stato utilizzato in tutte e tre le piattaforme SPR fluidici basata, sensori AHC sono stati utilizzati nella piattaforma BLI non fluidica. Poiché proteina A / G può avere una debole affinità per i mAbs che fa l&#39;AHC, una superficie biosensore a base di anticorpi, l&#39;off-rate del complesso mAb-antigene da / superfici proteina A G può artificialmente apparire più veloci di quelli ottenuto dalla superficie AHC. Questa possibilità è supportata by i dati sperimentali che dimostrano che i valori off-rate generati dalla piattaforma BLI erano notevolmente inferiori a quelli ottenuti dagli altri strumenti (Figura 7, linea rossa). Tuttavia, la piattaforma di BLI ha diversi vantaggi rispetto alle altre piattaforme. Ad esempio, è altamente flessibile per quanto riguarda la scelta del sensore e configurazione test dovuti ai diversi sensori pre-rivestite per uso immediato. Nei nostri esperimenti, l&#39;uso dei sensori AHC eliminato la necessità di passaggi ligando immobilizzazione, riducendo i tempi di preparazione. Inoltre, la piattaforma BLI richiede molto meno manutenzione rispetto alle altre piattaforme fluidica SPR, che dispongono di configurazioni di tubi e l&#39;interruttore valore complicati. Questa caratteristica è un vantaggio per gli esperimenti che coinvolgono campioni grezzi che possono causare problemi di intasamento e di contaminazione. Poiché la domanda per l&#39;identificazione efficiente, rapida e accurata dei candidati aumenta terapeutici, la necessità di biil throughput osensor è anche in aumento. Tra i quattro piattaforme biosensore, il throughput dal biosensore capace di 96-ligando stampa matrice è la più alta, seguita dal biosensore accoppiato ad un crisscrossing formato 36-ligando e il biosensore BLI-based con lettura simultanea 16 canali, che alla fine aumenta il numero di interazioni misurati in un singolo ciclo di legatura a 96, 36 e 16, rispettivamente. Queste capacità di throughput sono significativamente superiori a quella della piattaforma tradizionale SPR, che è limitata da avere solo quattro celle di flusso collegati da un unico flusso seriale. Dal momento che i nostri esperimenti coinvolti un insieme relativamente piccolo campione di 10 anticorpi monoclonali valutati a più densità di superficie con tempi di dissociazione lunghi, i throughput strumentali hanno giocato un ruolo moderato nel determinare l&#39;efficienza degli esperimenti. Non ci sono state differenze significative nei tempi sperimentali delle tre piattaforme high-throughput, e in tutti i casi gli esperimenti sono stati completati in un giorno. D&#39;altra parte, i tradizionali esperimenti SPR flusso seriale necessari 3 giorni per completare, nonostante l&#39;automazione walk-away di acquisizione dei dati dopo l&#39;installazione. In altri studi che coinvolgono un gran numero di campioni (cioè nell&#39;ordine delle centinaia o migliaia), per scopi di classifica off-rate / di screening cinetica o epitopo di categorizzazione, il throughput diventa un fattore critico. Sebbene il throughput in IBIS MX96 è ordini di grandezza superiore a quella degli altri biosensori ed è quindi una scelta ottimale per questi scopi, ha alcuni inconvenienti. In particolare, la stampa di matrice dal CFM mostra grandi incongruenze superficiali (Figura 1) e ridotta riproducibilità dati (Figura 8D e 8E). Per misurazioni cinetiche accurate, la quantità di legante sulla superficie biosensore è un parametro critico che deve essere controllato per garantire che le risposte vincolanti non sono disturbati da fattori secondari cometrasferimento di massa o impedimento sterico. Per il Biacore T100 e ProteOn XPR36, i livelli ottimali L R sono stati determinati sulla base del calcolo standard dei valori massimi serie R come descritto nell&#39;articolo di ricerca 17. D&#39;altra parte, per le piattaforme Octet RED384 e IBIS MX96, i livelli di cattura mAb stati raggiunti empiricamente usando una serie di anticorpi 2 volte diluiti serialmente in tempi costanti. La mancanza di conoscenza o il controllo della fase di cattura comportato una superficie ad alta densità e segnali ad alta vincolanti di risposta (Figura 2) che possono aver compromesso l&#39;accuratezza delle costanti cinetiche. Inoltre, la separazione della stampante dal rivelatore SPR presenta anche una sfida per lo svolgimento di misurazioni multiple ciclo di legame che coinvolgano rigenerazioni. L&#39;unico modo per eseguire la configurazione cinetica cicli multipli era attraverso accoppiamento di ammina diretta dei mAbs, al contrario di catturare attraverso il mAb Fc dalla immobilizzato proteina A / Gsuperficie negli altri tre piattaforme biosensori. Come risultato, un esperimento di rigenerazione esplorazione è stato necessario per determinare le condizioni di rigenerazione ottimali. Il risultato di questa configurazione è stato collegato a un ~ 90% inferiore attività superficiale osservata rispetto al metodo di cattura Fc (Figura 9), in aggiunta a un tempo più lungo sperimentale. Per eseguire il metodo di cattura Fc, è stato adottato un approccio cinetico-singolo ciclo alternativo. Questo approccio comporta l&#39;iniezione sequenziale di analiti a concentrazioni crescenti senza rigenerazione fra ogni iniezione (Figura 2). Questo approccio altamente conveniente, ma meno comunemente applicato non solo ridotto il tempo sperimentale e ridotto consumo di reagenti, ma anche prodotto costanti di velocità cinetiche molto simili a quelle degli altri biosensori (Figura 7). Pertanto, l&#39;applicazione di questo approccio cinetica ciclo unico supera la limitazione intrinseca configurazione dello strumento e presenta unapossibilità di ottenere ad alta risoluzione costanti di velocità cinetiche in maniera high-throughput. Nonostante il throughput essere un grosso limite nel Biacore T100, i nostri risultati dimostrano collettivamente che ha generato i dati più coerenti con la massima qualità. Questo è stato seguito dal ProteOn XPR36, che ha ~ 10 volte maggiore produttività. La loro capacità di generare dati di alta qualità diventa un vantaggio quando caratterizzazione alta affinità interazioni anticorpo-antigene che può essere tecnicamente difficile al raggiungimento dei limiti di rilevabilità degli strumenti. Mentre le limitazioni sistematiche nella strumentazione dell&#39;ottetto RED384 ostacolano la misurazione accurata di costanti di velocità di dissociazione (cioè, diminuzione oltre la sensibilità per risolvere decadimento del segnale sufficiente per lenta off-tassi), sia il Biacore T100 e ProteOn XPR36 può fornire sensibile ed affidabile rilevamento per la differenziazione.

L'acquisizione di parametri cinetici affidabili per caratterizzare le interazioni anticorpo-antigene è una componente essenziale del processo di scoperta e sviluppo di farmaci1. I biosensori a risonanza plasmonica ottica di superficie (SPR), il "gold standard" per il rilevamento in tempo reale di queste interazioni, sono stati utilizzati per circa due decenni per consentire la selezione precoce di candidati anticorpi terapeutici che soddisfano i criteri2,3. Oltre a fornire una classificazione di affinità dei candidati anticorpi mediante lo screening rapido del legame dei surnatanti grezzi4 e le rigorose determinazioni delle costanti cinetiche dei preparati purificati5, i biosensori possono differenziare ulteriormente l'attività funzionale dei candidati principali tramite studi di binning degli epitopi6,7. 
Per soddisfare la crescente domanda di prodotti basati su anticorpi per varie indicazioni terapeutiche8, negli ultimi anni è stata sviluppata un'ampia varietà di strumenti biosensori innovativi che aumentano l'efficienza dell'identificazione e della caratterizzazione dei candidati9,10. Questi strumenti differiscono per la configurazione dei canali microfluidici e/o per i principi ottici coinvolti nella rilevazione delle interazioni biomolecolari. In particolare, Octet RED38411, ProteOn XPR3612 e IBIS MX967 hanno ampliato il numero di interazioni misurate in un singolo ciclo di legame rispettivamente a 16, 36 e 96, rappresentando miglioramenti significativi del throughput rispetto alla tradizionale piattaforma Biacore. Sebbene queste varie piattaforme di biosensori forniscano tutte dati cinetici essenziali per caratterizzare le interazioni anticorpo-antigene, differiscono nella configurazione sperimentale e nelle procedure operative a causa delle variazioni nelle configurazioni strumentali. Ad esempio, nella piattaforma di array di imaging SPR dell'IBIS MX96, la fase di immobilizzazione del ligando multiplex viene eseguita in modalità off-line in un dispositivo di stampa esterno separato dal rivelatore7,13; Al contrario, le altre tre piattaforme di biosensori utilizzano una configurazione "all-in-one", in cui l'aggiunta di un componente sulla superficie del sensore, sia che si tratti del reagente di attivazione, del ligando o dell'analita, viene registrata in tempo reale e attraverso comandi pre-programmati in ordine sequenziale. Nell'Octet RED384, una caratteristica unica di questa piattaforma basata su BioLayer Interferometry (BLI) è la disponibilità di biosensori in fibra ottica pre-rivestiti per l'uso immediato "dip-and-read14, eliminando la necessità di preparazione della superficie del ligando e fasi di iniziazione/condizionamento, che sono spesso richieste per i chip del sensore nelle piattaforme basate su SPR. Il design privo di fluidi di questo strumento semplifica inoltre la meccanica ed evita problemi di intasamento e contaminazione quando si tratta di campioni grezzi. Con il nuovo design fluidico incrociato 6 x 6 nel ProteOn XPR36, è possibile implementare un approccio cinetico "one-shot" commutando i canali di flusso tra direzioni orizzontali e verticali per creare 36 punti di interazione15. Invece di valutare la cinetica di legame una concentrazione di ligando o analita alla volta, come avviene nella tradizionale piattaforma a flusso seriale Biacore T100, questo approccio offre la possibilità di monitorare fino a 36 diverse interazioni contemporaneamente in un singolo ciclo di legame. 
Nonostante le loro differenze, queste quattro piattaforme di biosensori sono tutte ampiamente utilizzate da molti laboratori in tutto il mondo. Per i nuovi utenti con poca esperienza pratica con i biosensori, decidere quale strumento utilizzare può essere un compito impegnativo date le differenze nella progettazione strumentale. Per determinare lo strumento più appropriato per i loro scopi di ricerca, è necessario considerare collettivamente fattori come la qualità dei dati, la coerenza delle prestazioni, la produttività, la facilità d'uso e il consumo di materiali. Mentre diversi studi di benchmark hanno esplorato la variabilità delle costanti di velocità cinetiche ottenute da più laboratori e biosensori5,16, uno studio comparativo testa a testa pubblicato di recente affronta ulteriormente i fattori sistematici che influenzano l'affidabilità dei dati dal punto di vista delle prestazioni strumentali17,18. I protocolli forniti in questo video si concentrano in dettaglio sulla configurazione e le procedure sperimentali e sono accompagnati dall'articolo di ricerca intitolato "Confronto delle piattaforme di biosensori nella valutazione della cinetica di legame anticorpo-antigene ad alta affinità"17. Questi protocolli hanno lo scopo non solo di aiutare i nuovi utenti di biosensori a implementare questi strumenti per i loro scopi di ricerca, ma anche di fornire ulteriori informazioni agli attuali utenti di biosensori in merito alle sfide tecniche e alle considerazioni nei disegni sperimentali per la valutazione delle interazioni anticorpo-antigene ad alta affinità.

<table><tbody><tr><td>Sistema Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>Il sistema T100 è stato aggiornato al chip sensore T200</td></tr><tr><td>CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>la valutazione della BIA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Versione 4.1</td></tr><tr><td>Software di controllo Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Il software di controllo T100 è stato aggiornato al kit di accoppiamento amminico T200</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Contiene: 750 mg di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC), 115 mg di N-idrossisuccinimide (NHS), 10,5 mL 1,0 M etanolammina-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer 10&volte;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Soluzione madre concentrata&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiale in plastica, d.e. 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tappi in gomma, tipo 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Fiale e tappi in plastica, d.e. 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di array di interazione proteica ProteOn XPR36</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>Software di gestione ProteOn.</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Versione 3.1.0.6</td></tr><tr><td>Chip sensore GLM</td> Kit <td>di accoppiamento Bio-Rad</td><td></td> 1765012 <td></td></tr><tr><td>ammina</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>Include EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanolammina HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di rigenerazione e condizionamento e tamponi</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Include 1 tampone glicina (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) e NaOH, SDS, HCl, acido fosforico, NaCl; 50 ml per soluzione.</td></tr><tr><td>2 L di tampone PBS/Tween/EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Include soluzione salina tamponata con orfato (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Ottetto RED384 Sistema</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi dei dati</td> biologici <td>Fort&eacute; </td><td></td><td>Bio Versione 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Immergi e leggi i biosensori anti-hIgG Fc capture (AHC)</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Un vassoio da 96 biosensori&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra a fondo inclinato a 384 pozzetti&nbsp;</td><td>Forte&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser per biosensori</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Buffer cinetico 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>Concentrazione 10x. Contiene ProClin 300.</td></tr><tr><td>IBIS MX96 Sistema SPRi</td><td>Stampante Wasatch Microfluidics Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microspotter a flusso continuo (CFM)</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versione 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G chip</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Software di analisi dati</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versione 6.19.3.17</td></tr><tr><td>Software</td> <td>di analisi dati SPRintWasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versione 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>Software</td><td></td> BioLogic <td>Versione 2</td></tr><tr><td>Pierce Proteina ricombinante A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

biosensori ottici privi di Label sono potenti strumenti nella scoperta di nuovi farmaci per la caratterizzazione delle interazioni biomolecolari. In questo studio, si descrive l&#39;utilizzo di quattro piattaforme biosensore comunemente impiegati nel nostro laboratorio per valutare l&#39;affinità di legame e cinetica di dieci anticorpi ad alta affinità monoclonali (mAb) contro proprotein umano convertasi subtilisina tipo KEXIN 9 (PCSK9). Mentre sia Biacore T100 e ProteOn XPR36 sono derivati ​​dalla tecnologia (SPR) consolidata Plasmon superficie risonanza, il primo ha quattro celle di flusso collegati da configurazione flusso seriale, mentre il secondo presenta 36 punti di reazione in parallelo attraverso un improvvisato 6 x 6 incrociato configurazione del canale microfluidico. All&#39;IBIS MX96 opera anche basato sulla tecnologia dei sensori SPR, con una funzione di imaging aggiuntivo che fornisce rilevamento orientamento spaziale. Questa tecnica di rilevazione accoppiato con il flusso continuo Microspotter (CFM) espande il throughput significativamente tramite enabling multiplex stampa array e il rilevamento di 96 sport di reazione contemporaneamente. Al contrario, l&#39;Octet RED384 si basa sul principio ottico BioLayer interferometria (BLI), con sonde fibra ottica che agisce come biosensore per rilevare variazioni configurazione di interferenza dalle interazioni di legame alla superficie punta. A differenza delle piattaforme SPR-base, il sistema BLI non si basa su fluidica flusso continuo; invece, le punte del sensore raccogliere letture mentre sono immersi in soluzioni analita di 384 micropiastra durante l&#39;agitazione orbitale. Ognuna di queste piattaforme biosensore ha i suoi vantaggi e svantaggi. Per fornire un confronto diretto della capacità di questi strumenti per fornire dati cinetici di qualità, i protocolli descritti illustrano esperimenti che utilizzano lo stesso formato del test e gli stessi reagenti di alta qualità per caratterizzare la cinetica antigene-anticorpo che si adattano alla semplice 1: 1 modello di interazione molecolare .

La Figura 1 mostra l&#39;immagine matrice anticorpo dal CFM ei livelli mAb macchiati con i due metodi di immobilizzazione, e la Figura 2 mostra i corrispondenti sensorgrams vincolanti generati nel MX96 dal multi-ciclo cinetico e il ciclo unico misurazioni cinetiche di queste matrici mAb . Il legame e le curve cineticamente muro di molteplici superfici rivestite di anticorpi generati nei quattro piattaforme biosensore tempo reale sono mostrati nelle figure 3 - 6. La figura 7 mostra il confronto dei tassi cinetici finali e vincolanti equilibrio costanti ricavate dall&#39;analisi globale di queste curve di legame. L&#39;individuo associazione (k a), dissociazione (k d), e l&#39;equilibrio (K D) costanti di legame sono riportati in Tabella 1. Per dimostrare la variabilità dei set di dati generati all&#39;interno dello stesso strumento, <strong&gt; La Figura 8 mostra appezzamenti di k a, k d, e K D a diverse densità di superficie mAb, e la figura 9 confronta ulteriormente le attività di legame calcolati delle superfici mAb attraverso le piattaforme biosensore. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figura 1. Multiplex Ligand Arrays di Amine-accoppiati (A) e Fc-catturato (B) Antibody superfici da CFM Stampa in IBIS MX96. Immagini delle matrici stampate sono mostrati nei pannelli di sinistra, dove le aree grigie racchiuse da quadrati rossi indicano la presenza di anticorpi. I interspots scure situate tra i punti di anticorpi attivi sono utilizzati per la sottrazione riferimento. Ogni colonna contiene un anticorpo stampato alle concentrazioni titolazione identificati sotto ea sinistra dell&#39;immagine. Le quantità di anticorpi stampati quantificati calcolando la difference a turni di massa tra le posizioni attive e di riferimento sono presenti nei pannelli di destra. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figura 2. Confronto di tempo reale Binding Sensorgrams da Multi-ciclo (A) e ciclo singolo (B) Esperimenti cinetica nel IBIS MX96. Le iniezioni sequenziali di PCSK9 umana a concentrazioni crescenti attraverso le matrici 10 x 8 anticorpali sono indicati sopra ogni segmento sensorgram corrispondente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <strong&gt; Figura 3. Binding Sensorgrams degli anticorpi catturati Interazione con PCSK9 umana e 1: 1 Kinetic Fit modello overlay nella Biacore T100. Le interazioni sono valutati su alta (pannelli superiori), medio (pannelli centrali) e bassa (pannelli inferiori) superfici densità. Le linee nere lisce sovrapposte rappresentano la misura cinetica dei segnali di risposta di legame a differenti concentrazioni PCSK9 umane (linee colorate) ad un 1: 1 modello di interazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figura 4. Binding Sensorgrams degli anticorpi catturati Interazione con PCSK9 umana e 1: 1 Kinetic Fit modello overlay nella ProteOn XPR36. Le interazioni sono valutate nel corso di alta (pannelli superiori), medium- (pannelli centrali) e bassa (pannelli inferiori) superfici densità. Le linee nere lisce sovrapposte rappresentano la misura cinetica dei segnali di risposta di legame a differenti concentrazioni PCSK9 umane (linee colorate) ad un 1: 1 modello di interazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figura 5. Binding Sensorgrams degli anticorpi catturati Interazione con PCSK9 umana e 1: 1 Kinetic Fit modello overlay nella Octet RED384. Le interazioni sono valutati su alta (pannelli superiori), medio (pannelli centrali) e bassa (pannelli inferiori) superfici densità. Le linee rosse sovrapposte rappresentano la misura cinetica dei segnali di risposta vincolanti a diverse concentrazioni PCSK9 umane (linee colorate) ad un 1:<html> 1 modello di interazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figura 6. Binding Sensorgrams dell&#39;ammina-accoppiati (A) e Fc-catturate (B) Anticorpi Interazione con PCSK9 umana e 1: 1 cinetiche modello Fit sovrapposizioni in IBIS MX96. I profili di legame sono organizzati come 10 x 8 pannelli che seguono la mappa piastra matrice di figura 1. Le linee nere rappresentano i segnali di risposta vincolanti registrati a diverse concentrazioni PCSK9 umani, e le linee rosse sovrapposte rappresentano le curve a muro. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> gura 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. Confronto dell&#39;Associazione k a (A), dissociazione K D (B), ed Equilibrio K D (C) costanti di legame generati dalle piattaforme Four biosensore. I parametri cinetici derivano da analisi globale delle curve di legame delle Figure 3 - 6. Gli strumenti sono rappresentati: Biacore T100 (blu), ProteOn XPR36 (verde), Octet RED384 (rosso), IBIS MX96, ammina accoppiati (viola), e IBIS MX96, Fc-catturate (arancione). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figura 8. Confronto della Consistenza Kinetic Tasso costanti su più densità superficiale anticorpo nel Biac<html> minerale T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, ammina-accoppiati (D), e IBIS MX96, Fc-catturato (E). I parametri cinetici k A (in alto sotto-pannelli), k d (middle sottoquadri), e K D (peggiori gruppi secondari) sono derivati da analisi di gruppo a singola densità superficiale anticorpo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figura 9. Attività legame dell&#39;anticorpo superfici e loro deviazioni standard (barre di errore) nelle piattaforme Quattro biosensore. I valori sono calcolati usando le equazioni descritte negli articoli di ricerca 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (nm) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11.4 (8.3) x 10 5 </td><td> 27.6 (11.0) x 10 -5 </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3.61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20.1 (12.3) x 10 -5 </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4.02 (2.23) x 10 5 </td><td> 22.8 (10.7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0.68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4.20 (2.13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0.16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12.5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Kinetic Prezzi ed equilibrio Binding costanti di 10 anticorpi monoclonali ottenuti inserendo globale delle curve vincolante da quattro biosensore Instruments al 1: 1 Interaction Model.

Descriviamo qui Protocolli per la misurazione di anticorpo-antigene affinità e cinetica usando quattro piattaforme biosensore comunemente utilizzati vincolante.

Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

L'obiettivo di questo studio sul biosensore è confrontare la capacità delle quattro piattaforme di biosensori comunemente utilizzate di fornire dati cinetici di qualità e offrire spunti riguardo alle sfide tecniche e alle considerazioni nella progettazione sperimentale per la valutazione delle interazioni anticorpo-antigene ad alta affinità. Questo studio risponde a domande fondamentali nel campo della scoperta di farmaci per la selezione di piattaforme di biosensori e formati di saggio che consentano risultati più affidabili durante la valutazione di candidati anticorpi terapeutici. Il vantaggio principale di questo studio è che fornisce un confronto diretto e completo delle diverse piattaforme di biosensori, in termini di coerenza, qualità dei dati ed efficienza operativa.La dimostrazione video dei quattro protocolli è fondamentale, poiché aiuta i nuovi utenti con poca esperienza pratica ad apprendere come impostare esperimenti su questi strumenti. Per eseguire misure cinetiche nel Biacore T100, fare clic su File, Apri nuovo metodo e aprire il file del metodo. Esaminare i parametri nel metodo.In Tipi di Ciclo, impostare il tempo di contatto a 220 secondi per la cattura 1 attraverso il percorso di flusso 2, 110 secondi per la cattura 2 attraverso il percorso di flusso 3 e 55 secondi per la cattura 3 attraverso il percorso di flusso 4. La velocità di flusso è di 10 microlitri al minuto per tutti i cicli di cattura. Selezionare Campione 1 e selezionare soluzione campione come variabile.Quindi, impostare il tempo di contatto a 600 secondi e il tempo di dissociazione a 2.700 secondi lungo il percorso di flusso 1, 2, 3, 4. La velocità di flusso è impostata a 30 microlitri al minuto. Successivamente, selezionare Rigenerazione 1, inserire glicina HCl pH 1,5 nel campo della soluzione e impostare il tempo di contatto a 20 secondi lungo il percorso di flusso 1, 2, 3, 4.In Impostazioni variabili, inserire concentrazioni in titolazione doppia da 100 nanomolari a 6,25 nanomolari per i cicli 1-3, da 50 nanomolari a 3,12 nanomolari per i cicli 4-8 e da 5 nanomolari a 0,323 nanomolari per i cicli 9-10. In Configurazione esecuzione, selezionare il percorso di rilevamento 2-1, 3-1, 4-1, quindi fare clic su avanti. Verificare l'azzeramento prima dell'esecuzione e successivamente fare nuovamente clic su avanti.Selezionare il campione e il supporto reagenti 1 e definire la posizione per i reagenti. Pipettare i reagenti nei singoli vial del campione di conseguenza e inserire il supporto nello strumento. Fare clic su Espelli supporto per aprire lo scomparto del vassoio campioni e quindi inserire il supporto campioni nello strumento.Quindi fare clic su Avvia e inserire un nome per l'esperimento da salvare per avviare la corsa. Per le misurazioni cinetiche nel ProteOn XPR36, iniziare l'immobilizzazione selezionando Protocolli e quindi Campioni. Definire EDC/Sulfo-NHS come attivatore nelle pozzette H1-H6, proteina A/G come ligando in G1-G6, etanolammina come disattivatore in F1-F6, glicina come rigeneratore in E1-E6, PBS-T-EDTA come bianco in D1-D6, campione di anticorpo monoclonale X come ligando in C1-C6 e PCSK9 umano come analita nelle pozzette B1-B6.Selezionare Passaggi e quindi fare doppio clic su Immobilizzazione nell'editor del protocollo. I passaggi includono tre iniezioni orizzontali successive di EDC/Sulfo-NHS, proteina A/G e etanolammina uno molare. Ogni iniezione deve avere una velocità di flusso di 30 microlitri al minuto e un tempo di contatto di 300 secondi.Successivamente, fare clic su Rigenera. Iniettare tre impulsi di 18 secondi di glicina a 100 microlitri al minuto sia nella direzione orizzontale che verticale. Seguire con due impulsi di 60 secondi di PBS-T-EDTA a 25 microlitri al minuto, anch'essi in entrambe le direzioni.Quindi, fare clic su Ligando e iniettare l'anticorpo monoclonale 1, anticorpo monoclonale 2 in direzione verticale, utilizzando un flusso di 25 microlitri al minuto e un tempo di contatto di 160 secondi. Dopo aver fatto clic su Analita, iniettare cinque concentrazioni di PCSK9 umano in un tampone vuoto su sei canali orizzontali contemporaneamente. Utilizzare 40 microlitri al minuto per 600 secondi di tempo di associazione, seguiti da 2.700 secondi di tempo di dissociazione.Quindi, fare clic su Rigenera ed erogare due impulsi di glicina di 18 secondi ciascuno a una velocità di 100 microlitri al minuto sia nella direzione orizzontale che in quella verticale. Successivamente, preparare i campioni e i reagenti in una singola piastra a 96 pozzetti secondo le posizioni definite per i reagenti. Trasferire la piastra sullo strumento, quindi fare clic sulla scheda Esegui, selezionare il protocollo e fare clic su Avvia.Viene dimostrata l'iniezione parallela a sei aghi nella registrazione di dati sperimentali in tempo reale. Per le misurazioni cinetiche sull'Octet RED384, configurare il metodo sperimentale cliccando prima su Experiment, quindi su New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment e infine su Basic Kinetics nel software di acquisizione dati. Successivamente, fare clic su Modify Plates e modificare da 96 a 384 pozzetti sia nella Piastra 1 che nella Piastra 2.Definire i tipi di campione e le posizioni nella piastra come descritto nel protocollo testuale. Passare alla definizione del saggio per impostare la configurazione sperimentale. La configurazione sperimentale è definita con un tempo di baseline di 30 secondi, un tempo di rigenerazione di 30 secondi, un tempo di equilibrazione di 18 secondi, un caricamento con un tempo di 200 secondi, un tempo di associazione di 500 secondi e un tempo di dissociazione di 1.800 secondi.La velocità di agitazione è impostata a 1.000 giri al minuto. Per aggiungere i passaggi all'elenco dei passaggi del saggio, fare prima clic su un passaggio e poi sui pozzetti situati nella piastra del campione o in quella del reagente. Inserire innanzitutto le istruzioni per l'equilibrazione e la rigenerazione, per condizionare i sensori di cattura anti-Fc umano mediante tre cicli di immersioni di 15 secondi in glicina alternati a immersioni di 15 secondi in 1XKB.Quindi, inserire le istruzioni di caricamento per catturare i campioni di anticorpi monoclonali sui sensori di cattura anti-Fc umano per 200 secondi. Successivamente, inserire le istruzioni per la linea di base al fine di stabilizzare il segnale di interferometria a biostrato per 60 secondi prima del passaggio di associazione. Impostare il passaggio di associazione immergendo i sensori in pozzetti contenenti concentrazioni variabili di PCSK9 umano per un periodo di associazione di 500 secondi.Avviare la fase di dissociazione immergendo i sensori legati al PCSK9 in nuove pozzette contenenti 1XKB per un periodo di dissociazione di 1.800 secondi. Infine, per la fase di rigenerazione, immergere i sensori con anticorpo monoclonale legato al PCSK9 in pozzette contenenti glicina, applicando due impulsi di 18 secondi ciascuno tra ogni ciclo di legame. Andare su "Review Experiments", scorrere i passaggi, quindi fare clic sul pulsante verde "open" per aprire il compartimento del campione.Trasferire le piastre del campione nello strumento. Accedere a Esegui esperimenti, impostare un tempo di ritardo di 60 secondi e agitare la piastra del campione durante l'attesa. Impostare la temperatura della piastra a 25 gradi Celsius, inserire il nome dell'esecuzione dell'esperimento, quindi premere Avvia. La raccolta dei dati in tempo reale è mostrata qui.Per misurazioni cinetiche multi-ciclo nell'IBIS-MX96, installare il chip sensore nel microspotter a flusso continuo. Aprire il software CFM2.0, quindi fare clic su Carica impostazioni e Accoppiamento amminico 96. Posizionare le due piastre per campioni e reagenti nella stampante CFM.Per creare l'array di anticorpi, premere Esegui per avviare la stampante e consegnare l'EDC/Sulfo-NHS nella metà superiore della piastra dei reagenti al sensore utilizzando 48 microcanali, ciclandoli sulla superficie del sensore per cinque minuti. Consegnare i campioni di anticorpi monoclonali nella metà superiore della piastra sorgente al sensore e ciclarli sulle superfici attivate per 10 minuti. Successivamente, consegnare il buffer di immobilizzazione da un tubo conico da 50 millilitri sulla superficie degli anticorpi per cinque minuti.Inserire il chip sensore stampato nello strumento. Nel software di controllo, fare clic su File, Apri misurazione, Misurazione esistente, quindi selezionare il file del metodo. Trasferire il chip sensore stampato nello strumento.Nel menu generale, selezionare G-System Prime sotto Full system script. Quindi, selezionare G-Quench per disattivare le superfici di anticorpi monoclonali mediante l'iniezione di 150 microlitri di etanolammina uno molare. Nel ciclo di analisi, selezionare A-AP Standard Run sotto IBIS Scripts.Impostare 1,0 minuto per la fase iniziale, 10,0 minuti per l'associazione e 90 passaggi per la dissociazione a una velocità di otto microlitri al secondo. All'interno dei cicli, iniettare la PCSK9 umana una concentrazione alla volta, dopo cinque iniezioni di tampone. Rigenerare le superfici dell'anticorpo monoclonale con glicina tra ogni ciclo di legame.Vengono mostrati i sovrapposizioni dei sensori di legame registrati adattati a un modello cinetico uno-a-uno per gli anticorpi che interagiscono con la PCSK9 umana su quattro strumenti. I profili di legame degli anticorpi a diverse densità sono simili tra gli strumenti. Anche se le costanti di velocità associate a ciascun anticorpo variavano tra gli strumenti, i loro ordini gerarchici sono rimasti per lo più invariati.È stata esaminata la riproducibilità e la coerenza delle affinità nei tassi cinetici su diverse superfici di anticorpi. Come mostrato in questo caso, è stata osservata una forte linearità per tutte le costanti di velocità ottenute utilizzando il Biacore T100 e il ProteOn XPR36. Tuttavia, le costanti di velocità generate dall'Octet RED384 erano meno lineari a causa di fluttuazioni in alcuni dei tassi di dissociazione.Questo è stato potenzialmente causato dall'evaporazione del campione nel tempo nella micropiastra. Le costanti di velocità generate dall'IBIS-MX96 erano inoltre meno lineari a causa delle fluttuazioni nelle eterogeneità della superficie. Le attività di legame dell'anticorpo associate alla maggior parte dei sistemi erano costanti, mentre è stata osservata un'attività circa dieci volte inferiore per il metodo di accoppiamento amminico proveniente dall'IBIS-MX96.Questo è stato probabilmente dovuto all'inattivazione dell'anticorpo o alla generazione di orientamenti dell'anticorpo non favorevoli al legame con l'antigene. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare esperimenti su ciascuna delle quattro piattaforme di biosensore e di come selezionare la tecnologia di biosensore più adatta al tuo scopo di ricerca. Il nostro studio comparativo dimostra che ciascuna piattaforma di biosensore presenta vantaggi e svantaggi propri.Nonostante alcune limitazioni sistematiche intrinseche negli strumenti, l'ordine diretto delle costanti di associazione e dissociazione è risultato altamente correlato tra questi strumenti. Ai fini del classificare i candidati, assumendo che il numero di campioni e la quantità di materiali non siano fattori limitanti, ciascuno di questi strumenti può essere utilizzato, poiché in grado di discriminare gli anticorpi in modo comparabile, indipendentemente dallo strumento impiegato. Esiste un compromesso tra l'affidabilità dei dati e la capacità di elaborazione dei campioni.Biacore T100, seguito da ProteOn XPR36R, ha mostrato la migliore qualità e coerenza dei dati. Al contrario, Octet RED384 e IBIS-MX96 dimostrano un'elevata flessibilità e produttività, con alcune compromessi in termini di accuratezza e coerenza dei dati. Per studi che richiedono un rilevamento sensibile e affidabile, sono più indicati o il Biacore T100 o il ProteOn XPR36.Per studi in cui la velocità è un fattore critico e sono coinvolti un elevato numero di campioni, è preferibile utilizzare Octet Red384 o IBIS-MX96. Gli strumenti con flusso continuo del fluido X forniscono dati di alta qualità per risolvere interazioni con tassi di dissociazione lenti. Il limite principale dello strumento BRI fluid ex-a-fray è l'evaporazione del campione nel tempo nella micropiastra, che può causare una deriva verso l'alto, compromettendo l'accuratezza dei dati.

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