Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore

L'obiettivo di questo studio sui biosensori è confrontare la capacità delle quattro piattaforme di biosensori utilizzate di routine di fornire dati cinetici di qualità e fornire approfondimenti sulle sfide tecniche e sulle considerazioni nei disegni sperimentali per la valutazione delle interazioni anticorpo-antigene ad alta affinità. Questo studio risponde a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci per la selezione di piattaforme di biosensori e formati di test che consentono i risultati più affidabili nella valutazione dei candidati anticorpi terapeutici. Il vantaggio principale di questo studio è che fornisce un confronto diretto e completo delle varie piattaforme di biosensori, per quanto riguarda la coerenza dei dati, la qualità e l'efficienza operativa.

La dimostrazione video dei quattro protocolli è fondamentale, in quanto aiuta i nuovi utenti con poca esperienza pratica a imparare come impostare esperimenti su questi strumenti. Per le misure cinetiche nel Biacore T100, fare clic su File, Apri nuovo metodo e aprire il file del metodo. Esaminare i parametri del metodo.

In Tipi di ciclo, impostare il tempo di contatto su 220 secondi per l'acquisizione 1 sul percorso di flusso 2, 110 secondi per l'acquisizione 2 sul percorso di flusso 3 e 55 secondi per l'acquisizione 3 sul percorso di flusso 4. La portata è di 10 microlitri al minuto per tutti i cicli di cattura. Selezionare Campione 1 e controllare la soluzione di esempio come variabile.

Quindi, impostare il tempo di contatto su 600 secondi e il tempo di dissociazione su 2.700 secondi sul percorso del flusso 1, 2, 3, 4. La portata è impostata su 30 microlitri al minuto. Quindi, selezionare Rigenerazione 1, inserire glicina HCl pH 1,5 nel campo della soluzione e impostare il tempo di contatto su 20 secondi sul percorso di flusso 1, 2, 3, 4.

In Impostazioni variabili, inserire concentrazioni di titolazione doppie da 100 nanomolari a 6,25 nanomolari per il ciclo 1-3, da 50 nanomolari a 3,12 nanomolari per il ciclo 4-8 e da 5 nanomolari a 0,323 nanomolari per il ciclo 9-10. In Esecuzione configurazione, scegliere il percorso del flusso di rilevamento 2-1, 3-1, 4-1, quindi fare clic su Avanti. Selezionare Prime prima dell'esecuzione, quindi fare nuovamente clic su Avanti.

Selezionare Rack campioni e reagenti 1 e definire la posizione dei reagenti. Pipettare i reagenti nelle singole fiale di campione di conseguenza e inserire il rack nello strumento. Fare clic su Eject Rack (Espulsione rack) per aprire lo sportello del vano del vassoio del campione, quindi inserire il rack del campione nello strumento.

Quindi fai clic su Avvia e inserisci un nome per l'esperimento da salvare per avviare l'esecuzione. Per le misurazioni cinetiche nel ProteOn XPR36, iniziare l'immobilizzazione selezionando Protocolli e poi Campioni. Definire EDC/Sulfo-NHS come attivatore nei pozzetti H1-H6, proteina A/G come ligando in G1-G6, etanolammina come disattivatore in F1-F6, glicina come rigeneratore in E1-E6, PBS-T-EDTA come bianco in D1-D6, campione di anticorpo monoclonale X come ligando in C1-C6 e PCSK9 umano come analita nei pozzetti B1-B6.

Selezionare Passaggi e quindi fare doppio clic su Immobilizzazione nell'editor del protocollo. Le fasi includono tre successive iniezioni orizzontali di EDC/Sulfo-NHS, proteina A/G e un molare di etanolammina. Ogni iniezione dovrebbe avere una portata di 30 microlitri al minuto e un tempo di contatto di 300 secondi.

Quindi, fai clic su Rigenera. Iniettare tre impulsi di 18 secondi di glicina a 100 microlitri al minuto sia in direzione orizzontale che verticale. A seguire due impulsi di 60 secondi di PBS-T-EDTA a 25 microlitri al minuto, anche in entrambe le direzioni.

Quindi, fare clic su Ligando e iniettare l'anticorpo monoclonale 1, l'anticorpo monoclonale 2 in direzione verticale, utilizzando una velocità di flusso di 25 microlitri al minuto e un tempo di contatto di 160 secondi. Dopo aver fatto clic su Analyte, iniettare cinque concentrazioni di PCSK9 umano in un tampone bianco su sei canali orizzontali contemporaneamente. Utilizzare 40 microlitri al minuto per 600 secondi di tempo di associazione, seguiti da 2.700 secondi di tempo di dissociazione.

Quindi, fare clic su Rigenera e iniettare due impulsi di 18 secondi di glicina a 100 microlitri al minuto sia in direzione orizzontale che verticale. Quindi, preparare i campioni e i reagenti in una piastra a 96 pozzetti in base alle posizioni dei reagenti definite. Trasferire la piastra sullo strumento, quindi fare clic sulla scheda Esegui, selezionare il protocollo e fare clic su Avvia.

Viene dimostrata l'iniezione parallela a sei aghi nella registrazione di dati sperimentali in tempo reale. Per le misure cinetiche nell'Octet RED384, impostare il metodo sperimentale facendo clic su Esperimento, quindi su Nuova procedura guidata esperimento, Nuovo esperimento cinetico e infine Cinetica di base nel software di acquisizione dati. Quindi fare clic su Modifica piastre e modificare 96 pozzetti in 384 pozzetti sia nella piastra 1 che nella piastra 2.

Definire i tipi di campione e le posizioni nella piastra come descritto nel protocollo di testo. Passare alla definizione del saggio per definire la configurazione sperimentale. La configurazione sperimentale è definita come un tempo di base di 30 secondi, un tempo di rigenerazione di 30 secondi, un tempo di equilibrio di 18 secondi, un carico con un tempo di 200 secondi, un tempo di associazione di 500 secondi e un tempo di dissociazione di 1.800 secondi.

La velocità di agitazione è impostata su 1.000 giri/min. Per aggiungere i passaggi all'elenco dei passaggi del saggio, fare clic su un passaggio, quindi fare clic sui pozzetti situati nel campione o nella piastra dei reagenti. Innanzitutto, inserire le istruzioni di rigenerazione dell'equilibrio per precondizionare i sensori di cattura Fc anti-umani con tre cicli di immersioni di 15 secondi nella glicina alternate a immersioni di 15 secondi in 1XKB.

Quindi, inserire le istruzioni di caricamento per acquisire i campioni di anticorpi monoclonali sui sensori di cattura Fc anti-umani per 200 secondi. Quindi, inserire le istruzioni di base per stabilire il segnale dell'interferometria del biostrato per 60 secondi prima della fase di associazione. Inserire la fase di associazione per immergere i sensori in pozzetti contenenti concentrazioni variabili di PCSK9 umano per un periodo di associazione di 500 secondi.

Entra nella fase di dissociazione per immergere i sensori legati a PCSK9 in nuovi pozzetti di 1XKB per un periodo di dissociazione di 1.800 secondi. Infine, per la fase di rigenerazione, immergere i sensori legati all'anticorpo monoclonale PCSK9 in pozzetti di glicina con due impulsi di 18 secondi tra ogni ciclo di legame. Vai su Rivedi esperimenti, scorri i passaggi, quindi fai clic sul pulsante verde Apri per aprire lo scomparto del campione.

Trasferire le piastre di campionamento nello strumento. Passare a Esegui esperimenti, immettere un tempo di ritardo di 60 secondi e agitare la piastra del campione durante l'attesa. Impostare la temperatura della piastra su 25 gradi Celsius, immettere il nome dell'esecuzione dell'esperimento, quindi premere Go.Live viene visualizzata la raccolta dei dati.

Per le misure cinetiche multiciclo nell'IBIS-MX96, installare il chip del sensore nel microspotter a flusso continuo. Aprire il software CFM2.0, quindi fare clic su Impostazioni di caricamento e 96 Coppia ammina. Posizionare le due piastre per campioni e reagenti nella stampante CFM.

Per creare l'array di anticorpi, premere Esegui per avviare la stampante e consegnare l'EDC/Sulfo-NHS nella metà superiore della piastra reagente al sensore utilizzando 48 microcanali e farli scorrere sulla superficie del sensore per cinque minuti. Somministrare i campioni di anticorpi monoclonali nella metà superiore della piastra sorgente al sensore e farli scorrere sulle superfici attivate per 10 minuti. Quindi, erogare il tampone di immobilizzazione da un tubo conico da 50 millilitri sulla superficie dell'anticorpo per cinque minuti.

Agganciare il chip del sensore stampato allo strumento. Nel software di controllo, fare clic su File, Apri misurazione, Misurazione esistente e selezionare il file del metodo. Trasferire il chip del sensore stampato nello strumento.

Nel menu generale, selezionare G-System Prime in Script di sistema completo. Quindi, selezionare G-Quench per disattivare le superfici degli anticorpi monoclonali iniettando 150 microlitri di etanolammina molare. In Ciclo di analisi, selezionare A-AP Standard Run in Script IBIS.

Impostare 1,0 minuti per il basale, 10,0 minuti per l'associazione e 90 passi per la dissociazione a una velocità di otto microlitri al secondo. All'interno dei cicli, iniettare PCSK9 umano una concentrazione alla volta, dopo cinque iniezioni di tampone. Rigenerare le superfici degli anticorpi monoclonali con glicina tra ogni ciclo di legame.

I sensorigrammi di legame registrati in sovrapposizioni di adattamento del modello cinetico uno-a-uno sono mostrati per gli anticorpi che interagiscono con PCSK9 umano in quattro strumenti. I profili di legame degli anticorpi a densità multiple sono simili tra gli strumenti. Anche se le costanti di velocità associate a ciascuno degli anticorpi variavano tra gli strumenti, i loro ordini di rango sono rimasti per lo più gli stessi.

È stata studiata la riproducibilità e la coerenza delle affinità nei tassi cinetici su più superfici di anticorpi. Come mostrato qui, è stata osservata una forte linearità per tutte le costanti di velocità generate utilizzando il Biacore T100 e il ProteOn XPR36. Tuttavia, le costanti di velocità generate dall'ottetto RED384 erano meno lineari a causa delle fluttuazioni di alcune delle velocità di spegnimento.

Ciò è stato potenzialmente causato dall'evaporazione del campione nel tempo nella micropiastra. Anche le costanti di velocità generate dall'IBIS-MX96 erano meno lineari a causa delle fluttuazioni nelle eterogeneità della superficie. Le attività di legame degli anticorpi associate alla maggior parte dei sistemi erano coerenti, mentre un'attività circa dieci volte inferiore è stata osservata per il metodo accoppiato all'ammina dell'IBIS-MX96.

Ciò era probabilmente dovuto all'inattivazione degli anticorpi o alla generazione di orientamenti anticorpali che non erano conduttivi al legame dell'antigene. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare gli esperimenti in ciascuna delle quattro piattaforme di biosensori e come selezionare la tecnologia dei biosensori appropriata per il tuo scopo di ricerca. Il nostro studio comparativo testa a testa mostra che ogni piattaforma di biosensori ha i suoi vantaggi e svantaggi.

Nonostante alcune limitazioni sistematiche intrinseche nella strumentazione, l'ordine diretto delle costanti di associazione e di dissociazione era altamente correlato tra questi strumenti. Ai fini della classificazione dei candidati, supponendo che il numero di campioni e la quantità di materiali non siano fattori limitanti, può essere utilizzato uno qualsiasi di questi strumenti, in quanto possono differenziare gli anticorpi in modo comparabile, indipendentemente dallo strumento di importazione. Esiste un compromesso tra l'affidabilità dei dati e la velocità effettiva dei campioni.

Biacore T100, seguito da ProteOn XPR36R, ha mostrato la migliore qualità e coerenza dei dati. Mentre l'Octet RED384 e l'IBIS-MX96 dimostrano un'elevata flessibilità e velocità di trasmissione con compromessi in termini di accuratezza e coerenza dei dati. Per gli studi che richiedono un rilevamento sensibile e affidabile, Biacore T100 o ProteOn XPR36 sono i più adatti.

Per gli studi in cui la velocità è un fattore critico e sono coinvolti un gran numero di campioni, è preferibile Octet Red384 o IBIS-MX96. Gli strumenti con fluido a flusso continuo X forniscono dati di alta qualità per la risoluzione delle interazioni con velocità di dissociazione lenta. Il limite principale per lo strumento BRI fluid ex-a-fray è l'evaporazione del campione nel tempo nella micropiastra, che può comportare una deriva verso l'alto, compromettendo l'accuratezza dei dati.