Visualizzazione dell'attivazione della caspasi nei macrofagi umani derivati da monociti

Nelle cellule immunitarie, la caspasi-1, una caspasi infiammatoria, è un componente chiave immuno-reattivo che esiste in una forma inattiva. Queste forme inattive sono costituite da un pro-dominio fuso con un dominio catalitico e diventano attive attraverso la dimerizzazione indotta dalla prossimità.

Per visualizzare l'attivazione delle caspasi in vivo, iniziare con una coltura di macrofagi derivati da monociti umani trasfettati che esprimono proteine fluorescenti rosse e una coppia di proteine reporter di complementazione fluorescenti. Le proteine reporter contengono un pro-dominio della caspasi-1 fuso con frammenti non fluorescenti della proteina di Venere, Venere-N o Venere-C.

Trattare le cellule con un mezzo di imaging contenente lipopolisaccaridi, uno stimolante infiammatorio di derivazione batterica, e ionofori di potassio, nigericina.

I lipopolisaccaridi interagiscono con i recettori di riconoscimento dei modelli sul macrofago, avviando l'assemblaggio di un complesso di inflammasomi.

Le molecole di nigericina entrano nella cellula e si legano agli ioni potassio, provocando il loro efflusso nel mezzo extracellulare e diminuendo la concentrazione intracellulare di ioni potassi