Visualizzazione dell'attivazione della caspasi nei macrofagi umani derivati da monociti

Nelle cellule immunitarie, la caspasi-1, una caspasi infiammatoria, è un componente chiave immuno-reattivo che esiste in una forma inattiva. Queste forme inattive sono costituite da un pro-dominio fuso con un dominio catalitico e diventano attive attraverso la dimerizzazione indotta dalla prossimità.

Per visualizzare l'attivazione delle caspasi in vivo, iniziare con una coltura di macrofagi derivati da monociti umani trasfettati che esprimono proteine fluorescenti rosse e una coppia di proteine reporter di complementazione fluorescenti. Le proteine reporter contengono un pro-dominio della caspasi-1 fuso con frammenti non fluorescenti della proteina di Venere, Venere-N o Venere-C.

Trattare le cellule con un mezzo di imaging contenente lipopolisaccaridi, uno stimolante infiammatorio di derivazione batterica, e ionofori di potassio, nigericina.

I lipopolisaccaridi interagiscono con i recettori di riconoscimento dei modelli sul macrofago, avviando l'assemblaggio di un complesso di inflammasomi.

Le molecole di nigericina entrano nella cellula e si legano agli ioni potassio, provocando il loro efflusso nel mezzo extracellulare e diminuendo la concentrazione intracellulare di ioni potassio. Ciò porta all'adescamento delle proteine sensore dell'inflammasoma con proteine adattatrici, una proteina ponte tra la proteina sensore e la procaspasi-1, che forma il complesso.

I pro-domini contenenti frammenti di Venere interagiscono con le proteine adattatrici del complesso. Questo porta i due frammenti in prossimità, costringendoli a ripiegarsi e a diventare fluorescenti.

Visualizzare le cellule al microscopio a epifluorescenza.

Le cellule trasfettate appaiono rosse con macchie di fluorescenza verdi, confermando l'attivazione della caspasi.

Prelevare una microprovetta sterile da 1,5 millilitri per trasfezione e aggiungere il plasmide reporter appropriato e i plasmidi caspasi-BiFC nella cappa. Posizionare la stazione di pipetta, il dispositivo, i puntali, i tubi di elettroporazione e la pipetta in una cappa a flusso laminare sterile. Collegare e accendere il dispositivo di nucleonucleazione.

Immettere i parametri di trasfezione nella schermata di avvio visualizzata. Premere su Tensione, immettere 1.000 e premere Fine per impostarlo su 1000 volt. Premere su Larghezza, immettere 40 e premere Fine per impostare l'impulso su 40 millisecondi. Infine, premere su # Impulsi, inserire due e premere Fine per impostare il numero di impulsi elettrici su 2.

Prendere una delle provette di elettroporazione e riempirla con tre millilitri di tampone elettrolitico E a temperatura ambiente. Inserire il tubo di elettroporazione nel supporto della pipetta sulla stazione di pipetta, assicurandosi che l'elettrodo sul lato del tubo sia rivolto verso l'interno e che si senta un clic quando il tubo viene inserito.

Prendi il pellet cellulare e aggiungi 10 microlitri di tampone R di risospensione preriscaldato per ogni 1 o 2 volte 10 alla quinta cellula e mescola delicatamente con una micropipetta P20. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a ciascuna provetta di trasfezione e mescolare delicatamente con una micropipetta P20. Inserire un puntale nella pipetta premendo il pulsante fino al secondo arresto, assicurandosi che il morsetto raccolga completamente lo stelo di montaggio del pistone nel puntale.

Quindi, premere il pulsante sulla pipetta fino al primo arresto e immergersi nella prima provetta contenente una miscela di DNA cellulare o plasmidico per aspirare il campione. Inserire la pipetta con il campione con molta attenzione nel portapipetta, assicurandosi che la pipetta scatti e sia posizionata correttamente. Premere Start sul touch screen e attendere che vengano erogati gli impulsi elettrici.

Lentamente, rimuovere la pipetta dalla stazione e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare trasfettata nel pozzetto corrispondente con il terreno preriscaldato e privo di antibiotici, premendo lentamente il pulsante fino al primo arresto. Scuotere delicatamente la piastra con cellule trasfettate e incubare per una o tre ore in un incubatore di coltura tissutale umidificato. Quindi, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto.

Metti il piatto nell'incubatrice e attendi almeno 24 ore per l'espressione genica. Il giorno successivo, ispezionare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Rimuovere con cura il terreno dalle cellule con una micropipetta P1000 e aggiungere 500 microlitri della soluzione di stimolo lungo il lato del pozzetto. Per eseguire pozzetti di controllo non trattati, aggiungere un mezzo di imaging senza lo stimolo.

Per visualizzare le cellule utilizzando un'epifluorescenza o un microscopio confocale, accendere il microscopio e la sorgente di luce fluorescente, seguendo le istruzioni del produttore. Selezionare l'obiettivo 10 volte o 20 volte e posizionare il piatto di coltura sul tavolino del microscopio.

Trova le cellule sotto il filtro a 568 nanometri con l'oculare e concentrati sulle cellule che esprimono i globuli rossi reporter. Conta tutti i globuli rossi nel campo visivo. Mentre ci si trova nello stesso campo visivo, passare ai filtri 488 o 512. Conta il numero di globuli rossi che sono anche verdi. Conta almeno 100 globuli rossi di almeno tre campi.