Name: Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a visualizzare l'attivazione delle caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani mediante reporter BiFC. Questo metodo permette di studiare i complessi di attivazione in tempo reale nelle cellule immunitarie primarie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo i membri del laboratorio LBH passati e presenti che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo laboratorio è supportato da NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). La Figura 2 è stata disegnata utilizzando il software Biorender.

<ol><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspases%3A+activation%2C+specificity%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li>
<li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).</li>
<li>Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspase+regulation%3A+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li>
<li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases%3A+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li>
<li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Viganò, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761(2015).</li>
<li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97(1992).</li>
<li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+and+IL-1%CE%B2+and+IL-18+processing+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li>
<li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC%2C+a+novel+22-kDa+protein%2C+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li>
<li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PYRIN+domain%3A+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li>
<li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li>
<li>Bürckstümmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li>
<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li>
<li>Bolívar, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1%CE%B2+Release+and+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li>
<li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li>
<li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1%CE%B2+secretion+by+triggering+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).</li>
<li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+Isolation%2C+Freezing%2C+thawing%2C+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
<li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1+beta+maturation%3A+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li>
<li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mature+interleukin-1%CE%B2+%28IL-1%CE%B2%29+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1%CE%B2-converting+enzyme+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li>
<li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyroptosome%3A+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+Plasma+concentrations+of+hemopexin%2C+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1%CE%B2processing+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li>
<li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li>
<li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants%3A+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li>
<li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).</li>
<li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+the+difference+between+CD80+and+CD86%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li>
<li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+kinases+in+a+death+grip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi da monociti isolati da campioni di sangue umano e un metodo per introdurre in modo efficiente i reporter BiFC della caspasi infiammatoria nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare.
Questo protocollo sfrutta la tecnica BiFC35 per etichettare le caspasi infiammatorie nel dominio di reclutamento della caspasi (CARD) con frammenti non fluorescenti della proteina fluoresce...

Le caspasi sono una famiglia di proteasi aspartato di cisteina che possono essere raggruppate in caspasi iniziatrici e caspasi boia. Le caspasi del boia comprendono caspasi-3, -6 e -7. Si trovano naturalmente nelle cellule come dimeri e vengono scissi dalle caspasi iniziatrici per eseguire l'apoptosi1. Le caspasi iniziatrici includono caspasi umane-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Si trovano come zimogeni inattivi (pro-caspasi) che vengono attivati dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità e stabilizzati dalla scissione autoproteolitica 2,3. Le caspasi infiammatorie sono un sottoinsieme delle caspasi iniziatrici2 e comprendono caspasi-1, -4, -5 e -12 negli esseri umani e caspasi-1, -11 e -12 nel topo 4,5. Piuttosto che un ruolo apoptotico, svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione. Mediano l'elaborazione proteolitica e la secrezione di pro-interleuchina (IL)-1β e pro-IL-18 6,7, che sono le prime citochine ad essere rilasciate in risposta agli invasori patogeni 8,9. Caspase-1 viene attivato al momento del reclutamento sulla sua piattaforma di attivazione; un grande complesso proteico a peso molecolare chiamato inflammasoma (Figura 1A)10. La dimerizzazione della caspasi-4, -5 e -11 avviene indipendentemente da queste piattaforme attraverso una via infiammatoria non canonica11,12.
Gli inflammasomi canonici sono complessi proteici multimerici citosolici costituiti da una proteina sensore inflammasoma, la proteina adattatrice ASC (proteina simile allo speck associata all'apoptosi contenente una CARD) e la proteina effettrice caspasi-110. Gli inflammasomi canonici più studiati sono la famiglia di recettori NOD-like contenente un dominio pirinico (NLRP), NLRP1 e NLRP3, la famiglia NLR contenente un CARD (NLRC), NLRC4 e l'assente nel melanoma 2 (AIM2). Ognuno di essi contiene un dominio pyrin, una CARD o entrambi i domini. Il dominio CARD media l'interazione tra le caspasi contenenti CARD e i loro attivatori a monte. Pertanto, la molecola di impalcatura ASC, che è composta da un dominio di pirina N-terminale (PYD) e un motivo CARD C-terminale 13,14, è necessaria per il reclutamento di caspasi-1 agli inflammasomi NLRP1 10, NLRP315 e AIM216.
Ogni inflammasoma prende il nome dalla sua unica proteina sensore che riconosce distinti stimoli pro-infiammatori (Figura 1B). Gli attivatori di questo percorso sono chiamati stimoli canonici. Gli inflammasomi fungono da sensori per i componenti microbici e lo stress tissutale e si assemblano per innescare una robusta risposta infiammatoria attraverso l'attivazione delle caspasi infiammatorie17. L'assemblaggio dell'inflammasoma avvia l'attivazione della caspasi-1 per mediare la maturazione e la secrezione dei suoi principali substrati pro-IL-1β e pro-IL-18. Questo processo avviene tramite un meccanismo in due fasi. In primo luogo, uno stimolo primordiale sovraregola l'espressione di alcune proteine inflammasoma e pro-IL-1β attraverso l'attivazione della via NF-κB. In secondo luogo, uno stimolo intracellulare (canonico) induce l'assemblaggio dell'inflammasoma e il reclutamento della procaspasi-1 6,7.
Caspase-4 e caspasi-5 sono gli ortologhi umani della caspasi murina-1111. Sono attivati in modo indipendente dall'inflammasoma dal lipopolisaccaride intracellulare (LPS), una molecola presente nella membrana esterna dei batteri Gram-negativi 18,19,20, e dall'eme extracellulare, un prodotto dell'emolisi dei globuli rossi21. È stato proposto che LPS si leghi direttamente al motivo CARD di queste proteine e induca la loro oligomerizzazione20. L'attivazione della caspasi-4 o della caspasi-5 promuove il rilascio di IL-1β inducendo una forma infiammatoria di morte cellulare chiamata piroptosi attraverso la scissione della proteina gasdermina D (GSDMD)18,19. Inoltre, l'efflusso di ioni potassio derivanti dalla morte piroptotica mediata da caspasi-4 e GSDMD induce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la successiva attivazione della caspasi-122,23. Pertanto, caspasi-4, -5 e -11 sono considerati sensori intracellulari per LPS che sono in grado di indurre l'attivazione della piroptosi e della caspasi-1 in risposta a stimoli specifici11,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Figura 1: Caspasi infiammatorie e test della complementazione di fluorescenza caspasi-bimolecolare (BiFC). (A) Diagramma che mostra il sistema caspasi-BiFC, in cui due prodomini caspasi-1 (C1-pro) legati a ciascun frammento non fluorescente di Venere (Venere-C o Venere-N) vengono reclutati nella piattaforma di attivazione NLRP3, costringendo Venere a ripiegarsi e fluorescere. Questo complesso appare come una macchia verde al microscopio e funge da lettura per la prossimità indotta da caspasi infiammatoria, che è il primo passo nell'attivazione della caspasi iniziatrice. (B) Schema che mostra l'organizzazione del dominio dei componenti inflammasoma e delle caspasi infiammatorie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Misurare l'attivazione di caspasi iniziatrici specifiche è difficile e non ci sono molti metodi disponibili per farlo con approcci di imaging. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) può essere utilizzato per visualizzare l'attivazione della caspasi infiammatoria direttamente nelle cellule viventi (Figura 1A)25. Questa tecnica è stata recentemente adattata per l'uso in macrofagi derivati da monociti umani (MDM)21. Caspasi BiFC misura il primo passo nell'attivazione della caspasi infiammatoria, la vicinanza indotta per facilitare la dimerizzazione. Viene utilizzata l'espressione di plasmidi che codificano il prodominio caspasi contenente CARD fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla fotostabile Venere (Venus-C [VC]) e Venere-N [VN]). Quando i due prodomini della caspasi vengono reclutati sulla loro piattaforma di attivazione o subiscono una vicinanza indotta, le due metà di Venere vengono portate in prossimità e costrette a ripiegarsi e fluorescere (vedi Figura 1A,B). Ciò fornisce una lettura in tempo reale dell'attivazione di caspasi infiammatorie specifiche.
L'MDM umano esprime abbondantemente geni inflammasoma e recettori di riconoscimento dei modelli che identificano segnali di pericolo e prodotti patogeni. Ciò fornisce un tipo di cellula ideale per l'interrogazione delle vie infiammatorie della caspasi. Inoltre, possono essere derivati dal sangue periferico e persino da campioni di pazienti per valutare l'attivazione della caspasi infiammatoria in uno specifico stato patologico. Questo protocollo descrive come introdurre i reporter della caspasi BiFC nell'MDM usando la nucleofezione, un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione, come trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e come visualizzare i complessi di caspasi attivi utilizzando approcci microscopici. Inoltre, questa metodologia può essere adattata per determinare la composizione molecolare di questi complessi, la localizzazione subcellulare, la cinetica e le dimensioni di queste strutture altamente ordinate 25,26,27.

<table><tbody><tr><td>Coltura tissutale a 48 pozzettiPiastre 2:34</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-108</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 10 cm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoetanolo 1000x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass a 8 pozzetti con coverglass da 1,5 HP</td><td></td><td>Colonne AutoMACS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-021-101</td><td>Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-092-545</td><td>Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator AutoMACS Pro</td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio Miltenyi</td><td>(Biotec)</td><td>130-092-987</td><td>Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>AutoMACS Soluzione di risciacquo</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-222</td><td>Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>AutoMacs running buffer</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-221</td><td>Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 microscopio invertito motorizzato dotato di un'unità disco rotante CSU-X1A 5000</td><td>Zeiss</td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale dotato di un modulo laser dotato di linee laser di lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP)</td></tr><tr><td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Qualsiasi microscopio a epifluorescenza con filtri a fluorescenza in grado di eccitare lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP) può essere utilizzato</td></tr><tr><td>CD14+ MICROBEADS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-050-201</td><td>Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator</td></tr><tr><td>DPBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>DsRed mito plasmide</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>Plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti si trovano su Addgene</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td><td>Sigma</td><td>GE17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC2011</td><td></td></tr><tr><td>Hemin BioXtra, da Porcine, &ge; 96,0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>51280-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific 15630106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caspasi infiammatorie Plasmidi</td><td></td><td></td> BiFC <td>Disponibile su richiesta presso il laboratorio LBH</td></tr><tr><td>LPS-EB Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-3PELPS</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonne</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-401</td><td>Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS</td></tr><tr><td>Rack per provette MACS da 15 mL</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-052</td><td>Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore</td></tr><tr><td>MACS MACS MultiStand</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-303</td><td>Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore</td></tr><tr><td>mCherry Plasmidi</td><td>Yungpeng Wang Lab</td><td></td><td>Plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene</td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Include dispositivo di elettroporazione al neon, pipetta e stazione di pipettazione</td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon 10 &; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>Include tampone di risospensione R, tampone di risospensione T, tampone elettrolitico E, 96 x 10 &micro; L Punte al neon e tubi per elettroporazione al neon</td></tr><tr><td>Sale sodico di nigericina, soluzione pronta</td><td>Sigma</td><td>SML1779-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P7280-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-090-976</td><td>Per la separazione manuale utilizzando Solo separatore QuadroMACS</td></tr><tr><td>qVD-OPh</td><td>Fisher (ApexBio)</td><td>50-101-3172</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Qualsiasi software utilizzato per utilizzare il microscopio confocale di scelta</td></tr></tbody></table>

visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Le caspasi infiammatorie includono caspasi-1, -4, -5, -11 e -12 e appartengono al sottogruppo delle caspasi iniziatrici. La caspasi-1 è necessaria per garantire una corretta regolazione della segnalazione infiammatoria ed è attivata dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità in seguito al reclutamento agli inflammasomi. La caspasi-1 è abbondante nel lignaggio delle cellule monocitiche e induce la maturazione delle citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 alle molecole secrete attive. Le altre caspasi infiammatorie, caspasi-4 e -5 (e la loro caspasi omologa murina-11) promuovono il rilascio di IL-1β inducendo la piroptosi. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) è uno strumento utilizzato per misurare la prossimità indotta da caspasi infiammatoria come lettura dell'attivazione della caspasi. Il prodominio caspasi-1, -4 o -5, che contiene la regione che si lega all'inflammasoma, è fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla Venere (Venus-N [VN] o Venus-C [VC]) che si associano per riformare il complesso fluorescente di Venere quando le caspasi subiscono una vicinanza indotta. Questo protocollo descrive come introdurre questi reporter nei macrofagi primari derivati dai monociti umani (MDM) usando la nucleofezione, trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e misurare l'attivazione della caspasi usando la fluorescenza e la microscopia confocale. Il vantaggio di questo approccio è che può essere utilizzato per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione del complesso di attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi. Tuttavia, è necessario considerare controlli accurati per evitare di compromettere la vitalità e il comportamento delle cellule. Questa tecnica è un potente strumento per l'analisi delle interazioni dinamiche della caspasi a livello di inflammasoma e per l'interrogazione delle cascate di segnalazione infiammatoria in MDM viventi e monociti derivati da campioni di sangue umano.

Lo schema mostrato nella Figura 2 fornisce una panoramica di come ottenere, trasfettare e visualizzare l'MDM umano. Dopo l'incubazione dei monociti CD14+ selezionati con GM-CSF per 7 giorni, la morfologia cellulare cambia nel corso del periodo di differenziazione (Figura 3A), passando dalle cellule in sospensione sferica a spinose e completamente attaccate (giorni 3 e 4), e infine a cellule più diffuse quando completamente differenziate (giorno 7). Le cellule c...

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per visualizzare e interrogare la via della caspasi infiammatoria a livello molecolare nelle cellule viventi in un particolare stato patologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione dei complessi infiammatori di attivazione della caspasi nelle cellule immunitarie primarie. Con ottimizzazioni minori, questo metodo può essere adattato ad altre cellule primarie e ad una gamma di proteine attivate dall'oligomerizzazione, e la sua applicabilità non è limitata alle metodologie microscopiche.In primo luogo, aspirare il supporto da macrofagi completamente differenziati su piatti da 10 centimetri e lavare il monostrato cellulare con un mezzo RPMI-1640 caldo senza siero, rimuovendo completamente tutti i supporti. Raccogliere le cellule aggiungendo due millilitri di soluzione calda di tripsina-EDTA allo 0,25% per piatto di 10 centimetri. Pipettare delicatamente la tripsina-EDTA su e giù su tutta la piastra con una micropipetta P-1000, quindi trasferire la sospensione su un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di ter

visualization-inflammatory-caspases-induced-proximity-human-monocyte

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Questo video dimostra l'attivazione delle proteine caspasi nei macrofagi umani utilizzando proteine reporter di complementazione a fluorescenza bimolecolare. I pro-domini della caspasi-1 sono fusi con frammenti non fluorescenti di proteine di Venere, che vengono reclutati nei complessi dell'inflammasoma. La vicinanza degli inflammasomi induce il ripiegamento e la fluorescenza dei frammenti di Venere, confermando l'attivazione delle caspasi nei macrofagi.

Visualizzazione dell'attivazione della caspasi nei macrofagi umani derivati da monociti

Questo video mostra un metodo per rilevare l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi utilizzando sonde reporter fluorescenti. Le cellule vengono trattate con ionofori di potassio e glicina per indurre l'assemblaggio dell'inflammasoma e l'attivazione della caspasi-1. Le sonde reporter fluorescenti visualizzano la caspasi-1 attivata e le cellule vengono colorate con un colorante fluorescente per la visualizzazione dei nuclei.

Rilevamento dell'attivazione dell'inflammasoma tramite microscopia a fluorescenza

Questo video dimostra una tecnica per studiare la formazione di inflammasomi NLRP3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3) nei macrofagi primari tramite immunofluorescenza. I macrofagi vengono prima innescati con lipopolisaccaride batterico (LPS) per sovraregolare l'espressione della proteina NLRP3. L'esposizione dei macrofagi alla nigericina, uno ionoforo di potassio, porta all'attivazione di NLRP3 e alla formazione di inflammasomi, che vengono visualizzati tramite...

Una tecnica in vitro per studiare la formazione di complessi inflammasomici nei macrofagi

Questo video dimostra la valutazione delle attivazioni multiple delle caspasi nei macrofagi derivati dal midollo osseo attraverso la stimolazione con il virus dell'influenza. Dopo la lisi dei macrofagi, l'inattivazione termica del lisato e la centrifugazione, le caspasi intracellulari vengono raccolte per la successiva analisi immunologica.

Valutazione dell'attivazione di caspasi multiple nei macrofagi

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Il presente protocollo descrive due metodi per misurare l'attività delle caspasi attraverso un substrato fluorogenico utilizzando la citometria a flusso o uno spettrofluorometro.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Impara a visualizzare l'attivazione delle caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani mediante reporter BiFC. Questo metodo permette di studiare i complessi di attivazione in tempo reale nelle cellule immunitarie primarie.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Esplora altri video