Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare macrofagi umani in alta quantità e qualità con attrezzature di laboratorio standard. Ciò si ottiene centrifugando prima il sangue dai cappotti di Buffy su un gradiente di chiamata FI per raccogliere i P BMC cs. Successivamente, in un gradiente per chiamata, i monociti vengono separati dai linfociti.

Quindi i monociti vengono seminati in sacche di coltura cellulare rivestite di teflon e differenziati. Dopo sei o sette giorni, i macrofagi vengono raccolti e seminati per gli studi successivi. Le cellule ottenute dovrebbero esprimere i marcatori tipici dei macrofagi maturi e rispondere a vari stimoli come la co-coltivazione con cellule tumorali o la stimolazione con LPS, Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il controflusso, la centrifugazione o la selezione cellulare attivata magneticamente, è che i macrofagi umani possono essere generati con apparecchiature standard per le labbra senza la necessità di costosi reagenti o strumenti.

Sebbene questo metodo sia facile da eseguire, gli individui che non lo conoscono potrebbero avere difficoltà a visualizzare e separare le diverse popolazioni cellulari nei gradienti di densità. Pertanto, la dimostrazione visiva di questi passaggi aiuterà a superare queste difficoltà. Questo protocollo viene eseguito in duplicato per facilitare il bilanciamento dei rotori.

Inizia disinfettando due sacche della frazione di buffy coat dal sangue stratificato. Quindi trasferire i Buffy coat in due tubi da 50 millilitri per ogni buffy coat. Preparare tre provette da 50 millilitri con 15 millilitri di soluzione FI call a temperatura ambiente a 1,077 grammi per millilitro.

Ora lentamente e con attenzione, stendere da 30 a 35 millilitri di pelo gonfio su ogni tubo di FI call. Gli strati non devono mescolare, centrifugare queste provette senza romperle a 400 G per mezz'ora. A temperatura ambiente tra le due fasi, si formerà un anello bianco di cellule mononucleate del sangue periferico.

Rimuovere questi strati con una pipetta di plastica. Combinare gli strati delle tre provette di ciascun donatore in due provette da 50 millilitri per donatore. Lavare le cellule raccolte aggiungendo un millimolare P-B-S-E-D-T-A fino alla linea da 40 millilitri, quindi centrifugarle a 300 G per 10 minuti senza romperle a temperatura ambiente.

Ora aspirare e scartare i surnatanti. Quindi ripetere il lavaggio e P-B-S-C-D-T-A risospendere e raccogliere i pellet di ciascun donatore e 20 millilitri di RPMI più FCS senza rosso fenolo. Ora dovrebbe esserci una provetta di cellule per donatore.

Ora preparare la seconda miscela di gradiente di densità: 23,13 millilitri di soluzione a temperatura ambiente per chiamata con 1,87 millilitri di 10 XPBS in una provetta da 50 millilitri. Preparare una provetta della miscela ogni due campioni. Quindi, trasferire 23 millilitri di miscela in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Quindi aggiungere 27 millilitri di RPMI più FCS con rosso fenolo. Il risultato è una soluzione osmotica per chiamata al 46% ISO. Ora per ogni trasferimento del donatore, 25 millilitri della soluzione al 46% in una provetta da 50 millilitri e sovrapporre accuratamente la miscela cellulare.

Le due fasi dovrebbero essere distinguibili dai loro colori senza interruzioni. Centrifugare le cellule per mezz'ora a temperatura ambiente e a 550 G.Un anello bianco di monociti si accumulerà tra le due facce. Raccogli queste cellule in una provetta da 50 millilitri con una pipetta di plastica.

Lavare i monociti con un millimolare P-B-S-E-D-T-A, riempito fino alla tacca di 50 millilitri. Quindi centrifugarli a 400 G senza romperli per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere i monociti pellettati in 20 millilitri di terreno. Quindi procedi con la sezione successiva.

Questo protocollo utilizza sacche di coltura rivestite in teflon FEP come camera di coltura. Inizia stimando il numero di monociti raccolti. I monociti sono grandi e spesso di forma irregolare.

Non contare i linfociti più piccoli. Se sono disponibili da 100 a 150 milioni di cellule di un donatore, preparare 180 millilitri di RPMI integrato. Se ci sono meno cellule, preparare volumi di terreno da 30 millilitri per ogni 30-50 milioni di cellule.

In un'aliquota da 20 millilitri, mescolare accuratamente le cellule nei 180 millilitri di terreno preparato. Quindi caricare la sacca di coltura con le cellule con una siringa di perfù da 50 millilitri attaccata al tappo della sacca di coltura. Rimuovere la siringa, espellere l'aria rimanente e tappare il tappo con un cono.

Ora incubare le sacche per sei o sette giorni con il 5% di anidride carbonica. Dopo sei-sette giorni di incubazione, trasferire le sacche di coltura nel ghiaccio per raccogliere le cellule, immergerle completamente nel ghiaccio e lasciarle raffreddare per un'ora o tre ore per staccare le cellule. Quindi, tira delicatamente i sacchetti su un bordo circa 10 volte.

Quindi disinfettare accuratamente l'esterno dei sacchetti. Sostituire il cono del tappo con una siringa da 50 millilitri. Quindi estrarre la sospensione cellulare e trasferirla in una provetta da 50 millilitri.

Quando tutte le provette sono raccolte, centrifugarle a 400 G per 10 minuti A temperatura ambiente, aspirare il surnatante e raggruppare tutte le cellule in 10 millilitri di RPMI più FCS. Quindi conta le celle come prima. Conta solo i macrofagi poiché possono essere presenti linfociti residui.

Quindi utilizzare le cellule per l'applicazione di interesse per riutilizzare le sacche di coltura. Lavateli due volte con etanolo al 70%. Quindi riempili con 50 millilitri di etanolo al 70% e incubali per una notte a temperatura ambiente il giorno successivo, sciacquare le sacche tre volte con PBS sterile.

Avvolgeteli poi in carta da sterilizzazione e sterilizzateli in autoclave. Un sacchetto può essere facilmente riutilizzato 10 volte il gradiente di densità. Le centrifugazioni producono un'interfaccia bianca contenente linfociti e monociti.

Qui esaminiamo il primo gradiente di densità. Maggio Grunwald. La colorazione di queste cellule mostra sia un elevato rapporto nucleo-citoplasma, tipico dei linfociti, sia nuclei a forma di fagiolo o anello, tipici dei monociti.

Queste macchie mostrano i risultati del secondo gradiente. Ogni buffy coat produce circa 150 milioni di monociti, che possono essere differenziati in circa 70 milioni di macrofagi. In 20 preparazioni, il 47% dei monociti è diventato macrofagi.

I macrofagi purificati possono essere ulteriormente arricchiti dall'adesione alle superfici plastiche, caratteristica che non è condivisa dalle cellule contaminanti. Una volta placcati, la maggior parte dei macrofagi mostra una morfologia a uovo fritto, mentre altri hanno un fenotipo allungato simile a un fuso. Le cellule sono caratterizzate dall'espressione di diversi marcatori.

Tipico dei macrofagi maturi. L'espressione di CD 11 B depone contro una differenziazione dendritica, così come la mancanza di espressione di CD 2 0 9. Dopo la differenziazione, le cellule rimangono funzionalmente e metabolicamente attive per cinque-sette giorni.

La colorazione con calcio delle cellule vitali mostra la loro capacità di assorbire le vescicole extracellulari marcate in rosso rilasciate dalle cellule tumorali. Inoltre, i macrofagi possono essere attivati, ad esempio, la stimolazione con lipopolisaccaride provoca l'espressione di diversi geni pro-infiammatori. Seguendo questa procedura, i macrofagi isolati possono essere sottoposti a un ampio spettro di saggi funzionali al fine di rispondere a domande di base sulla biologia dei macrofagi in salute e malattia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un numero elevato di macrofagi umani. Tuttavia, è importante ricordare che stai lavorando con campioni di sangue umano, che potrebbero essere potenzialmente infettivi.