Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

L'obiettivo generale di questa procedura è generare macrofagi umani in elevata quantità e qualità utilizzando attrezzature di laboratorio standard. Questo risultato si ottiene innanzitutto centrifugando il sangue proveniente da Buffy coat su un gradiente di densità al fine di raccogliere le PBMC. Successivamente, su un ulteriore gradiente di densità, i monociti vengono separati dai linfociti.

Quindi i monociti vengono seminati in sacche per coltura cellulare rivestite in teflon e differenziati. Dopo sei o sette giorni, i macrofagi vengono raccolti e seminati per studi successivi. Le cellule ottenute dovrebbero esprimere i marcatori tipici dei macrofagi maturi e rispondere a vari stimoli, come la co-coltivazione con cellule tumorali o la stimolazione con LPS. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il counterflow, la centrifugazione o il sorting cellulare magnetico attivato, è che i macrofagi umani possono essere generati utilizzando attrezzature standard per lipidi, senza la necessità di reagenti o strumenti costosi.

Sebbene questo metodo sia semplice da eseguire, le persone nuove a questa tecnica potrebbero avere difficoltà a visualizzare e separare le diverse popolazioni cellulari nei gradienti di densità. Pertanto, una dimostrazione visiva di questi passaggi aiuterà a superare tali difficoltà. Questo protocollo viene eseguito in duplicato per facilitare il bilanciamento dei rotori.

Iniziare disinfettando due sacche della frazione di buffy coat ottenuta dal sangue stratificato. Trasferire quindi i buffy coat in due provette da 50 millilitri per ogni buffy coat. Preparare tre provette da 50 millilitri aggiungendo 15 millilitri di soluzione FI call a temperatura ambiente a 1,077 grammi per millilitro.

Ora, lentamente e con attenzione, stratificate da 30 a 35 millilitri di strato buffy su ogni provetta contenente FI call. Gli strati non devono mescolarsi; centrifugate queste provette senza interruzione a 400 G per mezz'ora. A temperatura ambiente, tra le due fasi, si formerà un anello bianco di cellule mononucleate del sangue periferico.

Rimuovere questi strati con una pipetta di plastica. Riunire gli strati delle tre provette di ciascun donatore in due provette da 50 millilitri per donatore. Lavare le cellule raccolte aggiungendo P-B-S-E-D-T-A 1 millimolare fino alla linea dei 40 millilitri, quindi centrifugare a 300 G per 10 minuti senza frenata a temperatura ambiente.

Ora aspirare e scartare i soprannatanti. Quindi ripetere il lavaggio e risospendere in P-B-S-C-D-T-A, raccogliendo i pellet di ogni donatore in 20 millilitri di RPMI aggiunti di FCS senza rosso fenolo. A questo punto dovrebbe esserci un tubo di cellule per ogni donatore.

Ora preparare la seconda miscela per gradiente di densità mescolando 23,13 millilitri di soluzione per call a temperatura ambiente con 1,87 millilitri di 10 XPBS in un tubo da 50 millilitri. Preparare un tubo della miscela per ogni due campioni. Successivamente, trasferire 23 millilitri della miscela in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Quindi aggiungere 27 millilitri di RPMI più FCS con rosso fenolo. Il risultato è una soluzione iposmotica al 46% per ogni cellula. Ora, per ogni donatore, trasferire 25 millilitri della soluzione al 46% in un tubo da 50 millilitri e stratificare con attenzione la miscela cellulare.

Le due fasi dovrebbero essere distinguibili per colore senza interruzioni. Centrifugare le cellule per mezz'ora a temperatura ambiente e a 550 G. Un anello bianco di monociti si raccoglierà tra le due fasi. Raccogliere queste cellule in un tubo da 50 millilitri utilizzando una pipetta di plastica.

Lavare i monociti con P-B-S-E-D-T-A uno millimolare, portando a 50 millilitri. Quindi centrifugare a 400 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente senza interruzione, eliminare il soprannatante e risospendere i monociti pellettizzati in 20 millilitri di mezzo. Procedere quindi con la sezione successiva.

Questo protocollo utilizza sacche per coltura rivestite in teflon FEP come camera di coltura. Iniziare stimando il numero di monociti raccolti. I monociti sono grandi e spesso hanno una forma irregolare.

Non contare i linfociti più piccoli. Se sono disponibili da 100 a 150 milioni di cellule di un donatore, preparare 180 millilitri di RPMI integrato. Se sono presenti meno cellule, preparare volumi di mezzo pari a 30 millilitri per ogni 30-50 milioni di cellule.

In un'aliquota di 20 millilitri, mescolare con attenzione le cellule nei 180 millilitri di mezzo preparato. Quindi caricare il sacchetto di coltura con le cellule utilizzando una siringa per perfusione da 50 millilitri collegata al tappo del sacchetto di coltura. Rimuovere la siringa, espellere l'aria residua e chiudere il tappo con un cono.

Ora incubare i sacchetti per sei o sette giorni con il 5% di anidride carbonica. Dopo sei o sette giorni di incubazione, trasferire i sacchetti di coltura sul ghiaccio per raccogliere le cellule; immergere completamente i sacchetti nel ghiaccio e lasciarli raffreddare da un'ora a tre ore per staccare le cellule. Successivamente, tirare delicatamente i sacchetti oltre un bordo circa 10 volte.

Quindi disinfettare accuratamente l'esterno dei sacchetti. Sostituire il tappo conico con una siringa da 50 millilitri. Successivamente aspirare la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 50 millilitri.

Dopo aver raccolto tutti i tubi, centrifugarli a 400 G per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il soprannatante e raccogliere tutte le cellule in 10 millilitri di RPMI più siero fetale bovino (FCS). Quindi contare le cellule come in precedenza. Contare solo i macrofagi, poiché potrebbero essere presenti linfociti residui.

Quindi utilizzare le cellule per l'applicazione di interesse per riutilizzare i sacchetti di coltura. Lavare due volte con etanolo al 70%. Successivamente, riempire con 50 millilitri di etanolo al 70% e incubare tutta la notte a temperatura ambiente; il giorno successivo, risciacquare i sacchetti tre volte con PBS sterile.

Quindi avvolgerli nella carta per sterilizzazione e sottoporli ad autoclave. Un sacchetto può essere facilmente riutilizzato 10 volte. Le centrifugazioni del gradiente di densità forniscono un'interfaccia bianca contenente linfociti e monociti.

Qui esaminiamo il primo gradiente di densità. May Grunwald. La colorazione di queste cellule mostra sia un elevato rapporto nucleo-citoplasma, tipico dei linfociti, sia nuclei a forma di fagiolo o ad anello, tipici dei monociti.

Queste colorazioni mostrano i risultati del secondo gradiente. Ogni strato di buffy coat produce circa 150 milioni di monociti, che possono differenziarsi in circa 70 milioni di macrofagi. In 20 preparazioni, il 47% dei monociti si è trasformato in macrofagi.

I macrofagi purificati possono essere ulteriormente arricchiti mediante adesione a superfici di plastica, una caratteristica che non è condivisa dalle cellule contaminanti. Una volta seminati, la maggior parte dei macrofagi mostra una morfologia a uovo fritto, mentre altri presentano un fenotipo allungato a fuso. Le cellule sono caratterizzate dall'espressione di diversi marcatori.

Tipo caratteristico dei macrofagi maturi. L'espressione di CD11b esclude una differenziazione dendritica, così come l'assenza di espressione di CD209. Dopo la differenziazione, le cellule rimangono funzionalmente e metabolicamente attive per cinque-sette giorni.

La colorazione al calcio delle cellule vitali mostra la loro capacità di internalizzare vescicole extracellulari marcate in rosso rilasciate dalle cellule tumorali. Inoltre, i macrofagi possono essere attivati; ad esempio, la stimolazione con lipopolisaccaride induce l'espressione di diversi geni pro-infiammatori. Dopo questa procedura, i macrofagi isolati possono essere sottoposti a un'ampia gamma di saggi funzionali al fine di rispondere a domande fondamentali sulla biologia dei macrofagi in condizioni fisiologiche e patologiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare elevate quantità di macrofagi umani. Tuttavia, è importante ricordare che si lavora con campioni di sangue umano, che potrebbero essere potenzialmente infettivi.