Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare coloranti di tracciamento cellulare per quantificare direttamente l'entità della divisione cellulare per diversi sottogruppi di cellule immunitarie all'interno di popolazioni complesse. Ciò si ottiene marcando prima la popolazione di cellule madri con un colorante fluorescente noto per dare un legame stabile alle proteine cellulari o per intercalarsi in modo non covalente nelle membrane cellulari per tracciare le cellule marcate con colorante che rispondono ai contatori di stimolazione, la colorazione con anticorpi fluorescenti e l'analisi mediante citometria a flusso multiparametrica consente di rilevare le risposte differenziali tra i tipi di cellule immunitarie di interesse stimolato, Ma i controlli non colorati con colorante di tracciamento vengono utilizzati per stabilire l'intensità di fluorescenza delle cellule figlie più bassa che può essere distinta dal colorante di tracciamento in autofluorescenza etichettato, ma i controlli non stimolati vengono quindi utilizzati per stabilire l'intensità di fluorescenza alla quale verranno rilevate le cellule indivise. La stimolazione in genere si traduce in un'ampia gamma di intensità poiché le cellule che proliferano in risposta diventano progressivamente più deboli, ma i non responder non lo fanno.

In definitiva, l'uso di software di modellazione dei picchi per stimare la frequenza relativa delle cellule in diverse generazioni può consentire il confronto quantitativo delle risposte proliferative tra diverse popolazioni o stimoli utilizzando metriche come l'indice di proliferazione o la frequenza dei precursori. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la tritiazione, l'incorporazione o l'espressione di KI 67, è che la diluizione DI fornisce una misura diretta della divisione cellulare che può essere combinata con altre misure citometriche a flusso ME come l'immunofenotipizzazione e la produzione di citochine. La dimostrazione visiva del metodo di colorazione del colorante a membrana è utile poiché l'assorbimento del colorante da parte delle cellule è estremamente rapido.

Di conseguenza, una buona tecnica è la chiave per ottenere una colorazione omogenea e brillante. Dopo che le cellule mononucleate del sangue periferico umano sono state isolate, centrifugare per cinque minuti a 300 volte G e temperatura ambiente per ridurre al minimo la contaminazione piastrinica. Quindi risospendere il pellet a 10-7 cellule per millilitro in HBSS più l'1% di BSA e metterli sul ghiaccio.

Rimuovere e mettere da parte un Eloqua da 500 microlitri, quindi trasferire un'altra aliquota di cellule da 500 microlitri in un tubo conico di polipropilene da 12 x 75 millimetri. Aggiungere 3,5 millilitri di HBSS e centrifugare le celle per cinque minuti a 400 volte G e temperatura ambiente durante il lavaggio, aggiungere 0,5 millilitri di diluente C etichettante veicolo dal kit PKH 26 GL ad un altro tubo conico in polipropilene da 12 x 75 millilitri, aspirare accuratamente il super natin lasciando non più di 15-25 microlitri di liquido residuo e facendo attenzione a non rimuovere alcuna cellula. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di diluente C marcatore al pellet della cella e aspirare ed erogare la soluzione più volte per ottenere una sospensione a cella singola.

Preparare ora i due stock XD aggiungendo due microlitri di PKH 26 alla provetta contenente il diluente C. Solo ora pipettare immediatamente la sospensione cellulare in una soluzione di colorante XPKH 26 appena preparata e aspirare ed erogare contemporaneamente la miscela più volte per disperdere uniformemente le cellule in tutto il colorante. Dopo un minuto, aggiungere un millilitro di siero inattivato a caldo per fermare l'assorbimento del colorante nelle membrane cellulari. Dopo aver centrifugato le cellule, aspirare con cura il surnatante senza rimuovere il pellet.

Quindi disperdere il pellet in quattro millilitri di terreno completo contenente il 10% di siero inattivato dal calore e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polipropilene fresca. Lavare le cellule due volte in HBSS più 1% BSA Le cellule adeguatamente colorate mostreranno una distinta sfumatura rosa nel pellet Dopo aver sospeso il pellet cellulare in un millilitro di HBSS più 1% BSA, contare le cellule e quindi regolare il volume per ottenere una concentrazione finale da 10 a settima cella per millilitro. Dopo aver colorato le cellule secondo il protocollo citofluorimetrico descritto nella tabella, utilizzare le prime cinque provette per impostare i parametri di dispersione diretta e laterale e i segnali in tutti e quattro i rivelatori di fluorescenza.

In particolare per il rivelatore utilizzato per monitorare la fluorescenza PKH 26 nel tubo due. Verificare che tutte le cellule colorate con PKH 26 appaiano sulla scala come un singolo picco simmetrico nella terza-quarta decade con poche o nessuna cellula nell'ultimo canale. Successivamente, utilizzare il software di compensazione del colore e i file della modalità elenco raccolti per i tubi da uno a cinque per stabilire una matrice di sovrapposizione del colore per ogni fluro nei rivelatori utilizzati per monitorare gli altri tre fluorocromi.

Quindi applica questa matrice al file della modalità elenco per il campione sei. Verificare che la presenza di marcatura PKH 26 non alteri la capacità di rilevare sette cellule A a D positive. Ora applica questa matrice di sovrapposizione dei colori appena stabilita al file della modalità elenco per il tubo sette.

Identificare le popolazioni CD tre positive, CD quattro negative e CD tre positive, CD quattro positive su un grafico FE rispetto a PC. Verificare che la presenza di anti CD tre, FE e anti CD quattro A PC non alteri la capacità di rilevare sette cellule A a D positive. Infine, applica la matrice di sovrapposizione dei colori per il tubo sette alla modalità elenco File per il tubo otto.

Ora apri un programma contenente un modulo di analisi della proliferazione. Caricare il file colorato PKH 26 stimolato dal set di dati da analizzare. Successivamente, selezionare i parametri per l'analisi in questo caso, PKH 26 gated su sette a d cd negativi, tre linfociti positivi e dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale per l'esclusione di piccoli detriti e grandi aggregati.

Nella definizione di queste regioni, fare attenzione a includere l'area di dispersione in avanti in cui si trovano tipicamente le esplosioni. Quindi, apri la procedura guidata di proliferazione. Fare clic sulla scheda iniziale per aprire il file di dati e caricare il controllo positivo PKH 26 non stimolato.

Definisce la posizione del picco parentale corrispondente alle celle indivise. Analizza il file annotando i valori per la posizione e la larghezza del picco genitoriale. Se si desidera un'ampiezza di picco fissa, selezionare il blocco SD caricare il controllo negativo P KH 26 e regolare il numero di generazioni impostando il canale di picco per la generazione dimus figlia al di sopra delle celle negative PKH 26.

Questo stabilisce il numero di generazioni figlie. Il modello può adattarsi con precisione una volta completato. Ricaricare il file positivo PKH 26 stimolato.

Se sono evidenti picchi generazionali distinguibili, scegliere l'impostazione mobile nell'opzione modello. Se le decadi di log non sono esattamente 4.0, regolare la spaziatura generazionale come discusso nell'articolo. Ora, analizza il campione stimolato e conferma che la regione per la posizione del picco parentale rimane invariata.

Infine, selezionare analizza per ogni file sperimentale nel set di dati da applicare. Il modello ha appena creato e registrato le metriche di proliferazione desiderate risultanti dal miglior adattamento per ogni file sperimentale nel set di dati. Questa prima serie di dati illustra l'effetto della tecnica di miscelazione sulle distribuzioni di fluorescenza di PKH 26.

Quando sono state coltivate, le cellule mieloidi U 9 37 sono state colorate con il colorante di tracciamento cellulare utilizzando il metodo appena descritto: questo primo istogramma mostra i dati di controllo non colorati. Le impostazioni del citometro sono state regolate per posizionare l'autofluorescenza di queste cellule nella prima decade con nessuna o pochissime cellule che si accumulano nel primo canale. Questo secondo istogramma illustra una buona colorazione PKH 26.

La rapida miscelazione di due celle x con due coloranti x ha fornito una distribuzione della fluorescenza brillante, omogenea e simmetrica, ma senza cellule fuori scala con le impostazioni dello strumento utilizzate per l'istogramma precedente. Quando due celle x sono state aggiunte a due x coloranti senza miscelazione immediata, si è ottenuta una distribuzione della fluorescenza più eterogenea. Questa piccola sottopopolazione di cellule scarsamente marcate verrebbe erroneamente interpretata come cellule figlie se fossero presenti in un punto successivo dell'istogramma finale di questo esperimento, una scarsa miscelazione si è verificata anche quando tre microlitri di stock di colorante concentrato di etanolo sono stati accidentalmente aggiunti direttamente a 0,5 millilitri di due x sospensione cellulare producendo una distribuzione dell'intensità della fluorescenza estremamente debole e asimmetrica.

Qui i risultati tipici di un esperimento di proliferazione in cui cellule mononucleate del sangue periferico umano colorate con PKH 20 sono state coltivate con o senza stimolatori. Vengono mostrati i reagenti Anti CD tre e IL due. Dopo 96 ore di coltura, le cellule sono state prelevate e controcolorate con anti CD, tre FE, anti CD, 19 A, PC e sette A a d.

Nella prima strategia di gating sono state confrontate due diverse strategie di gating, un dot plot di CD tre contro sette. A A D è stato utilizzato per selezionare sette a d CD negativi tre cellule T positive. Una regione di dispersione anteriore e laterale è stata quindi utilizzata per eliminare grandi aggregati, pur includendo i linfociti esplosivi.

Gli eventi R uno più R due gate per il controllo non colorato sono rappresentati dall'istogramma grigio e le cellule PKH 26 colorate, ma non stimolate, sono in blue note, la colorazione omogenea simmetrica brillante per le cellule T vitali ma indivise nel controllo non stimolato. Questi dati sono stati controllati nello stesso modo della figura precedente, ma in questo caso le cellule sono state stimolate con anti CD tre e IL due. L'istogramma PKH 26 per gli eventi gated R uno più R due ora contiene per lo più celle divise con intensità ridotta rappresentate da picchi colorati per ogni generazione figlia.

Anche se alcune cellule luminose e indivise rimangono ancora nel picco blu dei genitori. Si noti che l'intensità delle celle altamente divise non si sovrappone ancora alla regione in cui vengono misurate le cellule non colorate, il che confonderebbe la stima delle metriche basate sul numero di cellule nelle generazioni figlie a più bassa intensità. Gli stessi dati sono stati analizzati come le due serie di figure precedenti, ma solo la dispersione della luce e il CD tre sono stati utilizzati per selezionare le cellule T vitali.

Questa strategia di gating esclude molte, ma non tutte, le cellule morte, come dimostrato dalla piccola popolazione residua di sette cellule morte positive A a D che rimangono nei tre punti CD rispetto a sette A A D. La scelta dei fluorocromi utilizzati per l'immunofenotipizzazione può creare problemi di compensazione impegnativi quando si utilizzano monconi di tracciamento cellulare, poiché l'intensità di colorazione delle cellule indivise è estremamente brillante. In questo esperimento, le cellule mononucleate del sangue periferico di 24 ore sono state marcate con PKH 26 e poi controcolorate con anticorpi contro CD tre e CD quattro più un colorante di vitalità.

In questa serie di dati, le cellule marcate con due micromolari PKH 26 sono state contro-colorate con anti CD tre FZ sette A a D e anti CD quattro A PC, e quindi analizzate utilizzando la stessa strategia di gating R uno più R due come prima, perché c'è poca sovrapposizione di PKH 26 nel canale A PC, CD quattro eventi positivi e negativi sono stati chiaramente risolti, indipendentemente dal fatto che sia stata applicata o meno la compensazione. Questi dati illustrano come le cellule T vitali CD, tre CD positive, quattro positive siano rimaste ben risolte anche quando la concentrazione finale di PKH 26 è stata aumentata a quattro micromolari. L'uso di anti CD quattro per CP in combinazione con anti CD tre FE, due micromolari PKH 26 e il die di vitalità per pro tre hanno dato risultati molto peggiori a causa della significativa sovrapposizione di PKH 26 nel canale per CP.

CD: quattro celle positive e negative non potevano essere risolte l'una dall'altra nei dati non compensati e sono state risolte solo marginalmente quando è stata applicata la compensazione. L'aumento della concentrazione finale di PKH 26 a quattro micromolari ha comportato una perdita completa della capacità di risolvere gli eventi CD quattro positivi da quattro negativi anche dopo l'applicazione della compensazione. Si noti come i campioni che includevano o mancavano anti CD quattro per CP erano essenzialmente identici.

Quando un profilo di diluizione del colorante viene analizzato utilizzando un software di modellazione dei picchi per stimare la frequenza delle cellule nelle generazioni figlie successive, le posizioni e/o le larghezze dei picchi figlie successive possono essere fisse o fluttuanti. Rispetto ai valori per il picco parentale. Questi valori sono stimati dal controllo non stimolato.

Ad esempio, questo profilo di intensità PKH 26 proviene da una coltura non stimolata di 96 ore da un responder moderato ed è stato utilizzato per fornire alla procedura guidata di proliferazione mod fit la prima stima della posizione e della larghezza per il picco che rappresenta le cellule parentali indivise. L'uso di un'impostazione fissa per la posizione del picco richiede che la media per ogni picco generazionale sia esattamente la metà dell'intensità di fluorescenza del picco precedente. Un'impostazione float per la posizione del picco consente alle posizioni finali dei picchi generazionali di variare dalle intensità previste secondo necessità per ottenere l'adattamento migliore.

Analogamente, un'impostazione fissa per l'ampiezza del picco richiede che l'ampiezza di ciascun picco generazionale sia uguale a quella del picco di controllo parentale o non stimolato. Un'impostazione float per la larghezza del picco consente di variare le larghezze finali in modo indipendente secondo necessità per ottenere il miglior adattamento a questa tabella. I risultati dell'analisi dei dati precedenti per due donatori diversi sono mostrati per questi donatori in cui erano evidenti picchi generazionali distinguibili.

I migliori valori di chi quadrato ridotto sono stati ottenuti quando sia la posizione del picco che l'ampiezza sono state lasciate fluttuare per profili di proliferazione in cui i picchi generazionali distinguibili non sono evidenti, si raccomanda un'impostazione fissa per la posizione del picco. Questi dati illustrano l'uso di due coloranti di tracciamento per monitorare separatamente le storie di proliferazione di diversi tipi di cellule immunitarie in un test di immunosoppressione citometrica a flusso. Le cellule effettrici T mostrate in verde sono state marcate con CFSE e le cellule regolatorie T mostrate in blu sono state etichettate con la vista cellulare.

Le popolazioni cellulari marcate con Claret sono state mescolate in rapporti variabili e coltivate in presenza di cellule anti-CD tre, anti CD 28 e cellule accessorie irradiate per 96 ore. Successivamente, le cellule sono state raccolte e colorate con anti CD quattro, PE di dimensione sette e viola vivo morto. Qui. I dati rappresentativi per un rapporto treg/effettore T di 0,25 a uno sono mostrati dopo l'eliminazione delle cellule viola morte vive positive.

È stato applicato un gate di dispersione della luce che includeva linfociti e blasti, ma escludeva aggregati e detriti, seguito da un gate per includere quattro eventi positivi di CD. La colorazione con chiaretto in vista cellulare ha permesso di distinguere facilmente le cellule treg vitali dalle cellule effettrici T vitali che erano altamente proliferate e quindi i profili di proliferazione DIM CFSE per le cellule effettrici T positive per CFSE e le cellule treg Claret positive per la vista cellulare sono stati analizzati utilizzando il software di modellazione dei picchi mod fit. Sono stati analizzati circa 25.000 eventi.

Di questi, il 48% erano effettori T vitali, il 6% erano T reg vitali, mentre il resto erano cellule morte, cellule accessorie e detriti. L'indice di proliferazione calcolato, che riflette l'aumento del numero di cellule durante il periodo di analisi, è stato di 3,85 per gli effettori T e di 1,83 per le Treg. Qui viene mostrato l'effetto della concentrazione delle cellule tregs sull'indice di proliferazione delle cellule effettrici T calcolato dal profilo di diluizione del colorante CFSE.

I risultati sono stati gli stessi, sia che le cellule treg siano state marcate con chiaretto a vista cellulare o non colorate, indicando che la funzione treg non è stata alterata dalla colorazione. Con il tracciamento come previsto, l'entità della proliferazione dei tectori è aumentata man mano che la concentrazione di cellule treg è diminuita. Gli indici di proliferazione delle cellule Treg sono stati calcolati anche dai profili di diluizione del colorante chiaretto a diversi rapporti treg/T effettori.

Come previsto, le Treg hanno subito una proliferazione minima in assenza di cellule T effettrici all'aumentare della concentrazione delle cellule T effettrici. Tuttavia, anche l'entità della proliferazione delle cellule treg è aumentata. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare con successo i coloranti di tracciamento cellulare per monitorare la proliferazione cellulare, come scegliere i fluorocromi appropriati e i controlli di compensazione del colore e come selezionare un modello appropriato per quantificare la divisione cellulare in base alla diluizione del colorante.

Insieme a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per rispondere a domande sperimentali come la colorazione delle cellule T specifiche dell'antigene o lo smistamento del flusso per il recupero di cellule staminali che sono quiescenti o che si dividono lentamente. Grazie mille per la visione.