Name: Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Impara a quantificare la proliferazione cellulare nelle cellule immunitarie utilizzando coloranti fluorescenti e citometria a flusso. Questo metodo combina marcatura diretta con software di modellazione dei picchi per analisi accurate.

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Gli autori In particolare, desidero ringraziare le seguenti persone per il loro contributo tecnico e intellettuale allo sviluppo di questi metodi nel corso degli anni: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis cellulare Scienza e la ricerca PTI) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), e Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Avrebbero anche ringraziare la classe Bowdoin del 2006 dai Corsi Annuali di metodi di ricerca e applicazioni della citometria a flusso, che hanno generato i dati mostrati nella Figura 2. La citometria a flusso è stata effettuata presso il Laboratorio di flusso Roswell Park Cancer Institute di Citometria, che è stato istituito in parte da contributi in conto impianti del Programma NIH strumento condiviso, e riceve sostegno da parte del Sussidio Core (5 P30 CA016056-29) dal NazionaleCancer Institute a Roswell Park Cancer Institute, e presso il Centro di Citometria a Flusso Abramson Cancer and Laboratory risorse cella Ordinamento della University of Pennsylvania, che è stato istituito in parte da contributi in conto impianti del Programma NIH strumento condiviso, e riceve il sostegno di NIH # 2P30 CA016520 dal National Cancer Institute. Il lavoro illustrato nelle figure 3 e 5, è stata sostenuta anche in parte da SBIR concessione EB00228 dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB) assegnato a PTI Research, Inc.

1. Membrana Etichettatura generale con PKH26 Dye cellulare Tracking (Rif. 25, Figura 1) <ol><li> Utilizzare la tecnica sterile per i passaggi 1,1-1,9. Preparare ~ 10 7 cellule mononucleari del sangue periferico umano o linfociti (hPBMC, HPBL) usando il metodo standard del laboratorio con l&#39;aggiunta di un ultimo giro 300 xg per minimizzare la contaminazione delle piastrine. Risospendere le cellule a 10 7 / ml di BSA in HBSS +1% e posto sul ghiaccio, riservando da 500 microlitri aliquota (5x10 6 cellule) per l&#39;uso nella Fase 2. </li><li> Luogo 5x10 6 celle (500 pl) in una da 12 x 75 millimetri tubo di polipropilene conica. Lavare una volta con 3,5 ml di HBSS. Aspirare accuratamente il supernatante, lasciando non più di 15-25 ml di liquido residuo, ma facendo attenzione a non rimuovere le cellule. La fiala per preparare una sospensione 2x cella nel passo 1,4. </li><li> Durante la fase di lavaggio in cella 1,2, aggiungere 0,5 ml di veicolo diluente etichettatura C (dal kit PKH26GL) per un x 12 75 millimetri tubo di polipropilene conica. La fiala di preparazionesono una soluzione 2x PKH26 nel Passo 1,5. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di diluente veicolo etichettatura C al pellet lavato dal punto 1.2 e aspirare e dispensare 3-4 volte per ottenere una sospensione di cellule singole (2x cellule). Evitare la formazione di bolle e miscelazione eccessiva, che può ridurre la vitalità cellulare e di recupero. </li><li> Subito dopo aver preparato la sospensione 2x cellulare al punto 1.4, preparare un 2x (4 mM) soluzione colorante con l&#39;aggiunta di 2,0 ml di 1,0 mM PKH26 magazzino colorante in etanolo (dal kit PKH26GL) al tubo C diluente preparata al punto 1.3 e al vortice disperdere uniformemente. </li><li> Subito dopo la preparazione della soluzione 2x colorante al punto 1.5, rapidamente pipettare la sospensione 2x cella da 1,4 passo nella soluzione colorante 2x e contemporaneamente aspirare e dispensare 3-4 volte per disperdere completamente le cellule nelle tinture Non:. Aggiungere 1,0 mM colorante direttamente alla cellule, versare cellule 2x 2x in colorante, oppure aggiungere celle a 2x 2x colorante mentre vortex. Perché colorazione è quasi istantaneo, tali metodi produrre menointensità uniformi rispetto al metodo consigliato (Figura 2). </li><li> Dopo 1 minuto, aggiungere 1,0 ml di siero inattivato con il calore o BSA HBSS +5% per fermare l&#39;assorbimento colorante all&#39;interno della membrana cellulare. Il mancato utilizzo abbastanza proteine ​​rischia la formazione di aggregati di colorante, che può pellet con cellule durante le fasi di lavaggio e causare etichettatura involontaria di altre cellule presenti in un esperimento. Se medio con calore siero inattivato al 10% (CM) o HBSS 1% BSA deve essere utilizzato come reagente di arresto, eseguire la colorazione in un tubo di polipropilene 15 ml conica e aggiungere almeno 5,0 ml di reagente di arresto per assicurare adsorbimento di tutti prive di personalità giuridica colorante. </li><li> Centrifugare le cellule marcate per 5 min @ ~ 400 x g. Aspirare accuratamente il supernatante senza rimuovere le cellule. Lavare il pellet due volte con 4 ml di HBSS CM o BSA 1%, disperdendo il pellet ben prima recentrifugation. Per minimizzare riporto di colorante adsorbito sulle pareti del tubo e massimizzare l&#39;efficacia del lavaggio, trasferire le cellule a un tubo di polipropilene fresco dopo la fiRST risospensione. Nota: le cellule colorate adeguatamente esporrà una tinta rosa distinto nel pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in lavato 1,0% ml HBSS BSA +1. Contare le cellule, determinare il recupero delle cellule, e regolare il volume per dare una concentrazione finale di 10 7 / ml. Con aspirazione attento, il recupero delle cellule dovrebbe essere ≥ 85%. Se il recupero delle cellule è &lt;70%, determinare la causa prima di procedere ulteriormente. Prelevare un&#39;aliquota di 150 microlitri (1.5x10 6 celle) e posto in ghiaccio per l&#39;uso al punto 2. </li></ol> 2. Preparazione dei controlli di configurazione dello strumento e del test (Tabella 1) <ol><li> Aliquotare 50 pl (5x10 5) di cellule non marcate dalla sospensione cellulare salvato nel passaggio 1,1 in ciascuna delle cinque 1,8 ml provette Eppendorf: 1, 3, 4, 5, e 7. Aliquotare 50 pl (5x10 5) di cellule PKH26 POS Passo 1,9 in ciascuna delle tre provette: 2, 6 e 8. </li><li> Aggiungere 10 microlitri IgG blocco (100 mg / tubo di IgG, si veda la tabella dei reagenti) per Tubi 1-8e incubare per 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Aggiungere una quantità saturante dell&#39;anticorpo (i) indicato nella Tabella 1 nelle provette 4, 5, 7, e 8 e incubare tutti i campioni (Tubi 1-8) per 30 min a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di HBSS BSA 1% di tutti i campioni, il pellet per centrifugazione (5 min @ 400 xg) e lavare una volta con 1,5 ml di HBSS 1% BSA, con aspirazione attenzione per evitare perdita di cellule. </li><li> Risospendere ogni campione in 500 ml di BSA HBSS +1%. Se necessario per i campioni da analizzare sul citometro, trasferire in un tubo da 12 x 75 mm in basso rotondo. Aggiungere 10 microlitri di 100 pg / ml 7-AAD giornaliera stock di lavoro (vedi tabella dei reagenti) Tubi a 3, 6, 7 e 8, come indicato nella tabella 1. Incubare in ghiaccio per 30 minuti prima di utilizzare nella configurazione di flusso citometro e verifica colorazione (Fase 3). </li></ol> 3. Configurazione portata Citometro e verifica colorazione <ol><li> Verificare che il flusso cytometer funziona correttamente, mediante procedure definite dal laboratorio per il controllo di qualità giornaliero. Verificare che i segnali possono essere prontamente individuato in ciascuna finestra spettrale da utilizzare, e che le risposte del rivelatore sono linearmente proporzionale alla intensità del segnale della finestra da utilizzare per il controllo della proliferazione 14. </li><li> Acquisire FSC e SSC dati per tubo 1 utilizzando scale di visualizzazione lineari. Regolare l&#39;amplificazione di ogni rivelatore in modo che la popolazione linfocitaria cade nel quadrante in basso a sinistra del diagramma a punti, non è fuori scala in entrambi i parametri, e non è interrotta a causa di soglia. Raccogliere dati ungated FSC e SSC per tutti i campioni in Piazza di 3,3-3,7. </li><li> Acquisire dati per il tubo 1, senza utilizzare la compensazione del colore e scale di visualizzazione logaritmica per tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Regolare alta tensione ciascun sensore (HV) per posizionare l&#39;autofluorescenza di linfociti non colorati sulla scala con pochi / nessun accumulo di cellule nel primo canale. Impostare un limite di analisi per ogni istogrammacorrispondente al più luminoso del 2% delle cellule non colorati. </li><li> Utilizzo senza la compensazione del colore e le impostazioni HV con sede in Piazza di 3.2 e 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 2, la raccolta FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Per il rivelatore utilizzato per monitorare PKH26 fluorescenza, verificare che tutte le cellule PKH26 pos appaiono su scala come picco singolo simmetrica nella decade 3 ° -4 °, con poche cellule / no l&#39;ultimo canale. Se ci sono più picchi o la forma del picco è inclinata, ripetere il passaggio 1 con particolare attenzione al sale minimizzazione e la tecnica di miscelazione (Figura 2). Se necessario, regolare concentrazione di colorante. </li><li> Utilizzo delle impostazioni stabilite al punto 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 3, la raccolta di FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Per il rivelatore utilizzato per monitorare 7-AAD fluorescenza, verificare che 7-AAD cellule pos cadere al di sopra del limite del 2% stabilito al punto 3.3 (vale a dire, che non vitali delle cellule sono ben risoltivitali da 7-AAD cellule neg). </li><li> Utilizzo delle impostazioni stabilite al punto 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 4, la raccolta di FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Verificare che le cellule CD8 pos sono ben risolti da cellule non marcate (ad esempio, caduta sopra il limite del 2% stabilito al punto 3.3 per il rivelatore FITC). Ripetere con tubo 5 e verificare che le cellule CD8 pos sono ben risolti da cellule non marcate (ad esempio caduta sopra il limite del 2% stabilito al punto 3.3 per il rivelatore APC). </li><li> Impostazioni con sede in Fase 3.3, acquisire dati per i tubi 6, 7 e 8, raccogliendo FSC, SSC e segnali in tutte le quattro rivelatori di fluorescenza. </li><li> Utilizzare i file di elenco in modalità raccolti per le provette 1-5 e il software di compensazione del colore per stabilire un colore si sovrappongono matrice per ogni fluorocromo nei rivelatori utilizzati per monitorare i tre fluorocromi altri. Applicare questa matrice al file di elenco modalità per Campione 6 e verificare che la presenza di PKH26 labEling non altera la capacità di individuare 7-AAD cellule pos. </li><li> Applicare il colore si sovrappongono matrice dal punto 3.8 a il file elenco modalità di Campione 7 e verificare che: a) 3 sottopopolazioni ben risolte (CD3 CD4, CD3 neg neg pos neg CD4 e CD3 CD4 pos pos) possono essere identificati su un FITC vs APC dot plot, e b) la presenza di anticorpi anti-CD3-FITC e anti-CD4-APC non altera la capacità di individuare 7-AAD cellule pos. Se la presenza di anticorpi anti-CD3-FITC altera il limite superiore al 2% per i dati raccolti sul rivelatore PKH26, regolare il confine come richiesto. </li><li> Applicare la matrice colore sovrapposizione dal punto 3.8 a il file elenco modalità di Campione 8. Se la presenza di PKH26 etichettatura altera il limite del 2% per il FITC, 7-AAD o rivelatori di APC da quelle impostate utilizzando il controllo autofluorescenza al punto 3.3, regolare di nuovo il confine (i) in base alle esigenze utilizzando Tube 7 della tabella 1 e verificare che È ancora possibile distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, CD3 e CD4 neg neg cellule utilizzando il limite impostato (i). </li></ol> 4. Proliferazione Selezione del modello per il monitoraggio cellulare Divisione mediante diluizione Dye <ol><li> Determinare la spaziatura tra le generazioni, che dipende dal numero di canali e decenni logaritmiche sul citometro. Per gli strumenti digitali, questo valore, tipicamente 4 o 5 decenni, è determinato dal numero di bidoni nel processore di segnale digitale. Negli strumenti analogici, dove il numero di decenni, è raramente un numero intero, la modellazione accurata richiede il numero preciso di decenni per essere determinati sperimentalmente. Per fare questo, i dati da una miscela di grani calibrati fluorescenti con quelle-assegnate relative intensità viene acquisito le stesse impostazioni del rivelatore ad alta tensione utilizzati nell&#39;esperimento. La posizione dei picchi tallone consente la calibrazione della scala logaritmica in termini di intCampo ensity per decade logaritmica. Specificamente, questo viene fatto disegnando il numero di canale per ogni tipo di tallone contro il registro del produttore-valore assegnato. La pendenza di un best-fit linea retta per i valori dei dati tallone dà il numero di unità di intensità relative per canale. Moltiplicato per il numero di canali, questo valore è quindi il numero di decenni di registro per il fondo scala, da cui il numero dei canali corrispondenti a una duplice riduzione dell&#39;intensità (cioè, la spaziatura generazione figlia) può essere calcolato 14. </li><li> Decidere se utilizzare una distanza fissa tra le generazioni o per consentire la spaziatura di galleggiare. A Standard (fisso) si avrà di utilizzare il valore di spaziatura generazionale determinato al punto 4.5 per assegnare la posizione di ogni generazione, e viene solitamente utilizzato quando l&#39;istogramma manca picchi distinti. Un&#39;impostazione galleggiante permette ad ogni posizione di picco generazionale deve essere determinato dalla forma dell&#39;istogramma e viene in genere utilizzato quando distinguishablpicchi elettronici generazionali sono evidenti. </li><li> Decidere se utilizzare una larghezza fissa di picco per tutte le generazioni o una larghezza variabile. Una larghezza fissa utilizza la SD calcolato per il campione di controllo non stimolato per modellare tutte le generazioni ed è di solito scelto quando il campione non ha distinguibili picchi generazionali. Una larghezza variabile consente al programma di variare indipendentemente l&#39;SD per ogni generazione e viene utilizzato al meglio con distinguibili picchi generazionali. </li><li> Eseguire un programma che contiene un modulo di analisi di proliferazione (qui ModFit LT versione 3.3). Caricare il file di pos PKH26 stimolato dal set di dati da analizzare (ad esempio, un stimolato 96 ore di cultura PKH26 cellule pos di contrasto come per tubo 8 della tabella 1). </li><li> Selezionare i parametri per l&#39;analisi, in questo caso PKH26 (585/42) con gate sui vitali (7-AAD neg) CD3 linfociti pos e FSC e SSC di escludere detriti piccoli e grandi aggregati (Figura 3). Nel definirequeste regioni attenzione per includere l&#39;area ad alta dispersione in avanti, dove esplosioni sono tipicamente presenti e si noti che CD3 espressione può essere down-modulata in colture stimolate. </li><li> Creare un nuovo modello di proliferazione utilizzando la procedura guidata proliferazione. Utilizzo del file Open Data (scheda Start), caricare il file di controllo non stimolato PKH26 pos e definire la posizione del canale di picco nella distribuzione dei genitori corrispondente alle cellule indivisi. </li><li> Analizzare il file per il controllo non stimolato PKH26 pos, rilevando i valori di posizione di picco dei genitori e la larghezza (deviazione standard). Se una larghezza fissa di picco (SD) si desidera, selezionare Blocco SD. </li><li> Caricare il neg PKH26 controllo (ad esempio, a 96 ore di coltura PKH26 cellule neg controcolorate come per Tube 7 in Tabella 1). Regolare il numero di generazioni impostando il canale di picco per la più debole generazione di sopra del neg PKH26 controllo. Questo determina il number delle generazioni figlie del modello può adattarsi con precisione ed è in genere 6-9 generazioni. </li><li> Aprire il file di dati per il campione stimolata (ad esempio, un stimolato 96 ore di cultura PKH26 cellule pos di contrasto come per tubo 8 della tabella 1) e confermare che le regioni per la posizione di picco dei genitori e del SD di cui al punto 4,7 rimangono invariati. Se la spaziatura fissa generazionale si desidera, selezionare l&#39;opzione Modello standard, altrimenti selezionare l&#39;opzione mobile. </li><li> Analizza ogni file sperimentale nel set di dati, utilizzando lo stesso modello definito al punto 4.9. Variare leggermente la posizione di picco dei genitori può essere necessario per la misura meglio definiti sia visivamente che dal ridotto chi quadrato (RCS) valore. </li><li> Registrare i parametri desiderati proliferazione derivanti dal best-fit per ogni file sperimentale nel set di dati. Per una descrizione completa dei parametri possibili, vedere rif. 22. </li></ol>

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</ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. e PK Wallace hanno ricevuto pre-commerciali reagenti cellulari di monitoraggio per la valutazione da Life Technologies, Inc. e BD Biosciences. AD Bantly e JS Moore hanno ricevuto pre-commerciali di monitoraggio cella reagenti per la valutazione da Life Technologies, Inc. e il finanziamento da PTI Research, Inc. per la pre-commerciale caratterizzazione di cellule CellVue vari monitoraggio coloranti. K. Muirhead è impiegato da SciGro, Inc., che fornisce servizi di consulenza per Phanos Technologies, Inc. (proprietario del PKH e coloranti CellVue) e fornisce il sostegno supporto tecnico per Sigma-Aldrich e molecolari tecnologie di targeting, Inc. (distributori di questi coloranti). Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Sigma-Aldrich.

I metodi descritti qui sono quelli che si trovano nei nostri laboratori combinati per dare più affidabile risultati ottimali per l&#39;etichettatura hPBMC utilizzando coloranti membrana 13,16,18 e per fenotipizzazione sottoinsieme dei linfociti e la proliferazione di monitoraggio utilizzando membrana o proteine ​​coloranti 2,11,13,16, 18. Come illustrato nelle figure 1 e 2, luminoso un&#39;etichettatura uniforme è più facilmente ottenuta limitando la presenza di sali fisiologiche e utilizzando una tecnica di miscelazione che si traduce in un rapido, omogeneo esposizione delle cellule alla stessa concentrazione di colorante. Perché colorazione con coloranti membrana avviene suddividendo nel doppio strato lipidico, altre variabili che alterano libera concentrazione di colorante può anche avere un impatto efficienza etichettatura. Per esempio, l&#39;etichettatura rotonde risultati polistirolo fondo tubi in lavaggio meno efficiente di sali prima di risospensione in Diluente C e anche in ridotta concentrazione libera colorante per tingere adsorbimento sulle pareti del tubo, in particolarea basse concentrazioni di colorante. Entrambi i fattori tendono a dare distribuzioni colorazione più ampi rispetto a quando l&#39;etichettatura sono realizzate utilizzando tubi di polipropilene coniche inferiori (figure 3, 4 e risultati non pubblicati). Età del campione e il tipo può colpire anche ampiezza del picco, anche quando le procedure di colorazione ottimizzati vengono utilizzati. Ad esempio, il curriculum vitae PKH26 pos linfociti isolati dal campo di sangue appena prelevato 14-20% (Figura 3, rif. 13 e dati non pubblicati), mentre il curriculum vitae linfociti isolati da 24 campioni di sangue ore vecchi o TRIMA gamma pheresis filtri 25-30 % (Figura 4 e cod. 18). Colorazione uniformità e la misura in cui cellule non vitali possono essere esclusi dall&#39;analisi sia influenzare il fatto picchi distinguibili figlia sono evidenti nel profilo diluizione colorante, che a sua volta influenza la scelta di un modello di proliferazione per adattare i dati osservati (figure 5 e 6 </strong&gt;). Anche se ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) viene qui utilizzato come esempio di software utilizzato per generare metriche come indice di proliferazione e frequenza Precursore (figure 3, 5 e 6, Tabella 3), altri pacchetti contengono anche i moduli per l&#39;analisi dati proliferazione. Questi includono FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) e FlowJo (Albero Star, Inc., Ashland, OR). Tutti questi programmi utilizzano una non-lineare dei minimi quadrati per trovare iterativamente la soluzione migliore per i dati grezzi modificando la posizione, l&#39;altezza e SD (o larghezza) di picchi gaussiani che rappresentano generazioni figlia sequenziali. Indice di proliferazione (PI) e frequenza Precursore (PF) sono le misure più comunemente usati di estensione della proliferazione. PI, come definito da ModFit, è una misura di aumento del numero di cellule nel corso del saggio, analogo al &#39;indice di stimolazione&#39; di un saggio di timidina. PF restituisce la frazione di cellule nel popolate inizialeioni che hanno risposto allo stimolo alla proliferazione. Si consiglia cautela, tuttavia, quando leggendo la letteratura a partire dal terminologia varia un po &#39;tra i pacchetti software (ad esempio, FlowJo e ModFit utilizzare definizioni e calcoli diversi per ciò che si intende per &quot;indice di proliferazione&quot;) 22. Le criticità discusse qui per l&#39;etichettatura e l&#39;analisi proliferazione con coloranti membrana sono anche incontrato quando si utilizza coloranti proteine. Per esempio, attenzione alla tecnica di miscelazione deve anche osservare, con esclusione delle cellule morte / morenti, per ottenere distribuzioni uniformi e picchi distinguibili figlia utilizzando CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. Scelta appropriata di fluorocromi per fenotipizzazione e valutazione della redditività è importante anche al fine di evitare eccessive sovrapposizioni spettrali e l&#39;incapacità di riconoscere le cellule anticorpi positivi, in particolare con coloranti visibili proteine ​​che emettono come CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. La riduzione della concentrazione di colorante inseguimento diminuisce i problemi di compensazione in adiacenti canali spettrali, ma limita anche il numero di divisioni cellulari che possono essere monitorati prima di intensità cellula figlia iniziano a sovrapporsi con autofluorescenza. In alternativa, l&#39;uso di coloranti cellule più recenti di monitoraggio come il Claret emettitore rosso lontano CellVue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o viola emissione CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) possono ridurre i problemi di compensazione (Figura 6). Infine, sebbene coloranti membrana generalmente tendono a mostrare una minore tossicità 11,26, è possibile sovra-label cellule con o classe di colorante. È quindi sempre necessario verificare che la concentrazione del colorante tracciamento utilizzato non ha modificato la funzionalità delle cellule che devono essere monitorati (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Acquistabile </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcio e magnesio libero, senza rosso fenolo </td></tr><tr><td> IgG umane Cohn frazione II e III globuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-CD3 umana-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse anti-umani CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse anti-umani CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD8 umana-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; concentrazione di saturazione, come determinato mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD25-APC umana </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD3 umano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libero </td></tr><tr><td> Topo anti-CD28 umano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libero </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rosso fluorescente linker kit cella contenente 10-3M PKH26 in EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT o MINI26-1KT </td><td> Procedure in Fase 1 si applicano anchedi kit contenenti PKH67 o coloranti CellVue altri </td></tr><tr><td> CellVue Claret lontano rosso fluorescente linker kit cella contenente 10 3M Claret CellVue in EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT o MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-carbossifluoresceina diacetato, succinimmidil estere (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Non fluorescente; spaccati dalle esterasi membrana per formare fluorescente ammino-reattiva carbossifluoresceina succinimidyl estere (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Viola fissabile </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 12 x 75 mm conica tubi di polipropilene &amp; berretti </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Fornisce una migliore efficienza della membrana colorante colorazione (tintura ridotto assorbimento, meno perdita di cellule durante l&#39;aspirazione supernatante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round fondo polistirolo tubi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Qualsiasi citometro grado di rilevare FITC, PKH26, e 7-AAD (es. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm e 655 nm, rispettivamente) e APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CIANO </td><td> Qualsiasi citometro grado di rilevare FITC, PKH26, e 7-AAD (es. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm e 655 nm, rispettivamente) e APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Preparati in laboratorio, </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, madre alla concentrazione </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml in PBS. Congelare in aliquote e conservare a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worre magazzino </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 pg / ml in PBS; preparare tutti i giorni da 1 mg / ml di brodo congelato. </td></tr><tr><td> IgG blocco </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml di IgG umano Cohn frazione II e III globuline + 10 mg / ml di BSA. </td></tr></tbody></table>

ottimizzato metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti tracking cellulari

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Coloranti fluorescenti tracciamento cellulari, in combinazione con flusso e citometria immagine, sono potenti strumenti con cui studiare le interazioni ei destini di diversi tipi di cellule in vitro e in vivo. 1-5 Anche se ci sono letteralmente migliaia di pubblicazioni utilizzando questi coloranti, alcuni dei più comunemente riscontrate delle applicazioni di tracciamento cellulari include il monitoraggio di: <ol><li> stelo e cellule progenitrici quiescenza, la proliferazione e / o differenziazione 6-8 </li><li> antigen-driven trasferimento membrana 9 e / o la proliferazione di cellule precursori 3,4,10-18 e </li><li> funzione immunitaria delle cellule di regolamentazione e effettore 1,18-21. </li></ol> Disponibili in commercio coloranti tracciamento cellulari variano ampiamente nella loro composizione chimica e proprietà di fluorescenza, ma la caduta grande maggioranza in una delle due classi base al loro meccanismo di marcatura delle cellule. &quot;Coloranti membrana&quot;, caratterizzato da PKH26, sono coloranti altamente lipofile tcappello partizione stabilmente ma non covalente nelle membrane cellulari 1,2,11. &quot;Coloranti proteine&quot;, caratterizzata da CFSE, sono amino-reattivi coloranti che formano legami covalenti stabili con le proteine ​​cellulari 4,16,18. Ogni classe ha i suoi vantaggi e limitazioni. La chiave per la loro corretta applicazione, in particolare negli studi multicolor in cui vengono utilizzati coloranti diversi per monitorare diversi tipi di cellule, è quindi quello di comprendere le criticità che consentono un uso ottimale di ogni classe 2-4,16,18,24. I protocolli inclusi qui sottolineare tre cause più comuni di risultati mediocri o variabile durante l&#39;uso delle cellule-tracking coloranti. Questi sono: <ol><li> Il mancato raggiungimento luminoso, uniforme, etichettatura riproducibile. Questo è un punto di partenza indispensabile per qualsiasi studio di monitoraggio delle cellule, ma richiede attenzione a diverse variabili quando si utilizza coloranti membrana di quando si usa coloranti proteine ​​o reagenti equilibrio vincolanti come gli anticorpi. </li><li> Ottimali combinazioni di fluorocromind / o mancata includere controlli di compensazione critici. Monitoraggio fluorescenza colorante è tipicamente 10 Febbraio - 10 marzo volte più luminoso di fluorescenza degli anticorpi. È pertanto indispensabile per verificare che la presenza di colorante tracciamento non compromette la possibilità di rilevare altre sonde utilizzate. </li><li> Il mancato ottenimento di una buona misura con software di modellazione di picco. Tale software consente di confronto quantitativo delle risposte proliferative in diverse popolazioni o stimoli in base al numero precursore o altre metriche. Ottenere una buona misura, tuttavia, richiede l&#39;esclusione di morti / cellule morenti che possono distorcere i profili di diluizione colorante e la congruenza delle ipotesi alla base del modello con le caratteristiche del profilo osservato diluizione colorante. </li></ol> Esempi qui riportati illustrano come queste variabili possono influenzare risultati usando membrane e / o coloranti proteiche per monitorare la proliferazione cellulare.

Il successo delle tinture di tracciamento cellulari per monitorare la funzione immunitaria e la proliferazione cellulare coinvolge diversi passaggi critici. Si descrivono metodi per: 1) ottenendo luminoso, uniforme, riproducibile etichetta-re con coloranti membrana; 2) selezionando fluorocromi e condizioni di acquisizione dati, e 3) la scelta di un modello per quantificare la proliferazione cellulare basata sulla diluizione colorante.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

I coloranti fluorescenti per il tracciamento cellulare, in combinazione con la citometria a flusso e l'imaging citometrico, rappresentano strumenti potenti per studiare le interazioni e il destino di...

L'obiettivo generale di questo metodo è utilizzare coloranti per il tracciamento cellulare per quantificare direttamente il grado di divisione cellulare per diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno di popolazioni complesse. Questo viene ottenuto etichettando innanzitutto la popolazione parentale di cellule con un colorante fluorescente noto per legarsi stabilmente alle proteine cellulari o per intercalarsi in modo non covalente nelle membrane cellulari, al fine di tracciare le cellule marcate con il colorante che rispondono a stimoli. Successivamente, si esegue la colorazione con anticorpi fluorescenti e l'analisi mediante citometria a flusso multiparametrica, consentendo la rilevazione di risposte differenziali tra i tipi di cellule immunitarie di interesse stimolate. Tuttavia, vengono utilizzati controlli non marcati con il colorante di tracciamento per stabilire l'intensità minima di fluorescenza delle cellule figlie distinguibile dalla autofluorescenza. Controlli marcati con il colorante di tracciamento ma non stimolati vengono poi impiegati per stabilire l'intensità di fluorescenza alla quale verranno rilevate le cellule non divise. La stimolazione determina tipicamente un ampio intervallo di intensità, poiché le cellule che proliferano in risposta diventano progressivamente più deboli, mentre le cellule non rispondenti no.In definitiva, l'uso di software di modellazione dei picchi per stimare la frequenza relativa delle cellule in diverse generazioni consente un confronto quantitativo delle risposte proliferative tra diverse popolazioni o stimoli, utilizzando parametri come l'indice di proliferazione o la frequenza dei precursori. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione di timidina triziata o l'espressione di KI-67, è che la diluizione del DI fornisce una misura diretta della divisione cellulare che può essere combinata con altre analisi citofluorimetriche come l'immunofenotipizzazione e la produzione di citochine. Una dimostrazione visiva del metodo di colorazione con coloranti di membrana è utile poiché l'assorbimento del colorante da parte delle cellule è estremamente rapido.Di conseguenza, una buona tecnica è fondamentale per ottenere una colorazione omogenea e intensa. Dopo aver isolato le cellule mononucleate del sangue periferico umano, centrifugare per cinque minuti a 300 ×g e a temperatura ambiente per minimizzare la contaminazione da piastrine. Successivamente, risospendere il pellet a 10⁷ cellule per millilitro in HBSS più 1% BSA e porre in ghiaccio.Rimuovere e conservare 500 microlitri di Eloqua, quindi trasferire un altro aliquota di 500 microlitri di cellule in un tubo conico in polipropilene da 12 per 75 millimetri. Aggiungere 3,5 millilitri di HBSS e centrifugare le cellule per cinque minuti a 400 × g e a temperatura ambiente. Durante il lavaggio, aggiungere 0,5 millilitri del veicolo di marcatura diluente C dal kit PKH26 GL in un altro tubo conico in polipropilene da 12 per 75 millimetri. Aspirare con attenzione il soprannatante lasciando non più di 15-25 microlitri di fluido residuo, avendo cura di non rimuovere alcuna cellula. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri del veicolo di marcatura diluente C al pellet cellulare e aspirare e dispensare la soluzione diverse volte per ottenere una sospensione di cellule singole.Ora preparare il stock 2X aggiungendo due microlitri di PKH 26 al tubo contenente il diluente C. Solo ora pipettare immediatamente la sospensione cellulare nella soluzione appena preparata di colorante 2X PKH 26 ed aspirare e dispensare contemporaneamente la miscela diverse volte per disperdere uniformemente le cellule in tutto il colorante. Dopo un minuto, aggiungere un millilitro di siero inattivato termicamente per arrestare l'assorbimento del colorante nelle membrane cellulari. Dopo aver centrifugato le cellule, aspirare con attenzione il soprannatante senza rimuovere il pellet.Quindi disperdere il pellet in quattro millilitri di mezzo completo contenente siero inattivato termicamente al 10% e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta in polipropilene. Lavare le cellule due volte in HBSS più BSA all'1%; le cellule adeguatamente colorate mostreranno una tinta rosa distinta nel pellet. Dopo aver risospeso il pellet cellulare in un millilitro di HBSS più BSA all'1%, contare le cellule e quindi regolare il volume per ottenere una concentrazione finale di 10 alla settima cellule per millilitro. Dopo aver colorato le cellule secondo il protocollo di citometria a flusso indicato nella tabella, utilizzare le prime cinque provette per impostare i parametri di scattering anteriore e laterale e i segnali in tutti e quattro i rilevatori di fluorescenza.In particolare per il rilevatore utilizzato per monitorare la fluorescenza di PKH 26 nel tubo due. Verificare che tutte le cellule marcate con PKH 26 compaiano sulla scala come un singolo picco simmetrico nel terzo-quarto decennio, con poche o nessuna cellula nell'ultimo canale. Successivamente, utilizzare il software di compensazione del colore e i file in modalità elenco raccolti per i tubi da uno a cinque per stabilire una matrice di sovrapposizione cromatica per ciascun fluorocromo nei rilevatori utilizzati per monitorare gli altri tre fluorocromi.Applicare quindi questa matrice al file in modalità elenco per il campione sei. Per verificare che la presenza dell'etichettatura con PKH26 non alteri la capacità di rilevare cellule positive per sette A a D. Applicare ora questa matrice di sovrapposizione cromatica appena stabilita al file in modalità elenco per il tubo sette.Identificare le popolazioni CD tre positivo CD quattro negativo e CD tre positivo CD quattro positivo su un grafico FE contro PC. Verificare che la presenza di anti-CD tre, FE e anti-CD quattro A PC non alteri la capacità di rilevare cellule positive per sette A a D. Infine, applicare la matrice di sovrapposizione cromatica del tubo sette al file in modalità elenco del tubo otto.Ora aprire un programma contenente un modulo di analisi della proliferazione. Caricare il file colorato con PKH26 stimolato dal set di dati da analizzare. Successivamente, selezionare i parametri per l'analisi, in questo caso PKH26 selezionato su linfociti vitali, negativi per il sette a a d, positivi per cd3 e scatter anteriore rispetto a scatter laterale per l'esclusione di detriti piccoli e aggregati grandi.Nella definizione di queste regioni, prestare attenzione ad includere l'area ad alto scatter in avanti dove si trovano tipicamente i blast. Successivamente, aprire la procedura guidata per la proliferazione. Fare clic sulla scheda inizio per aprire il file di dati e quindi caricare il controllo positivo non stimolato PKH 26.Definire la posizione del picco parentale corrispondente alle cellule non divise. Analizzare il file annotando i valori relativi alla posizione e alla larghezza del picco parentale. Se si desidera una larghezza di picco fissa, selezionare l'opzione "lock SD", caricare il controllo negativo P KH 26 e regolare il numero di generazioni impostando il canale del picco per la generazione di cellule figlie dimus al di sopra delle cellule negative per PKH 26.Questo imposta il numero di generazioni figlie. Il modello può adattarsi accuratamente al termine. Ricaricare il file positivo per PKH26 stimolato.Se sono evidenti picchi generazionali distinguibili, selezionare l'impostazione floating nell'opzione del modello. Se le decadi logaritmiche non sono esattamente 4,0, regolare lo spaziamento generazionale come descritto nell'articolo. A questo punto, analizzare il campione stimolato e verificare che la regione corrispondente alla posizione del picco parentale rimanga invariata.Infine, selezionare "analizza" per ogni file sperimentale nel set di dati da applicare. Applicare il modello appena creato e registrare le metriche di proliferazione desiderate risultanti dall'adattamento migliore per ciascun file sperimentale nel set di dati. Questa prima serie di dati illustra l'effetto della tecnica di miscelazione sulle distribuzioni di fluorescenza di PKH26.Quando coltivate, le cellule mieloidi U 9 37 sono state colorate con il colorante per il tracciamento cellulare utilizzando il metodo appena descritto; questo primo istogramma mostra i dati del controllo non colorato. Le impostazioni del citometro sono state regolate in modo da posizionare l'autofluorescenza di queste cellule nel primo decennio, con nessuna o pochissime cellule che si accumulano nel primo canale. Questo secondo istogramma illustra una buona colorazione con PKH 26.La rapida miscelazione di due x cellule con due x colorante ha prodotto una distribuzione della fluorescenza intensa, omogenea e simmetrica, ma senza cellule fuori scala alle impostazioni dello strumento utilizzate per l'istogramma precedente. Quando due x cellule sono state aggiunte a due x colorante senza miscelazione immediata, si è ottenuta una distribuzione della fluorescenza più eterogenea. Questa piccola sottopopolazione di cellule debolmente marcate sarebbe stata interpretata erroneamente come cellule figlie se fosse stata presente in un successivo punto temporale nell'istogramma finale di questo esperimento. Una scarsa miscelazione si è verificata anche quando tre microlitri di soluzione concentrata di colorante in etanolo sono stati accidentalmente aggiunti direttamente a 0,5 millilitri di sospensione di due x cellule, producendo una distribuzione dell'intensità di fluorescenza estremamente debole e asimmetrica verso destra.Di seguito sono riportati risultati tipici di un esperimento di proliferazione in cui cellule mononucleate del sangue periferico umano marcate con PKH 20 sono state coltivate in presenza o assenza di agenti stimolanti. Sono mostrati gli anticorpi anti-CD3 e IL-2. Dopo 96 ore di coltura, le cellule sono state raccolte e sottoposte a colorazione secondaria con anti-CD3, FE anti-CD19 APC e 7AAD.Sono state confrontate due diverse strategie di gating. Nella prima strategia di gating, è stato utilizzato un dot plot di CD3 rispetto a CD7 per selezionare le cellule T vive, CD3 positive e negative per il marcatore 7-AAD. Successivamente, è stata utilizzata una regione di scatter anteriore e laterale per escludere grandi aggregati, mantenendo comunque i linfociti in fase di blastizzazione.Gli eventi selezionati per R uno più R due del controllo non colorato sono rappresentati dall'istogramma grigio, mentre le cellule colorate con PKH 26 ma non stimolate sono in blu; si noti la colorazione intensa, simmetrica e omogenea per le cellule T vitali ma non divise nel controllo non stimolato. Questi dati sono stati selezionati nello stesso modo della figura precedente, ma in questo caso le cellule sono state stimolate con anti-CD tre e IL due. L'istogramma di PKH 26 per gli eventi selezionati tramite R uno più R due contiene ora principalmente cellule divise, con intensità ridotta, rappresentate da picchi colorati per ogni generazione di cellule figlie.Sebbene alcune cellule luminose non divise siano ancora presenti nel picco parentale blu. Si noti che l'intensità delle cellule altamente divise non si sovrappone ancora alla regione in cui vengono misurate le cellule non colorate, il che potrebbe confondere la stima delle metriche basate sul numero di cellule nelle generazioni figlie di intensità più bassa qui considerate. Gli stessi dati sono stati analizzati come nei due precedenti insiemi di figure, ma solo lo scattering della luce e il CD tre sono stati utilizzati per selezionare le cellule T vitali.Questa strategia di gating esclude molte, ma non tutte, le cellule morte, come dimostrato dalla piccola popolazione residua di sette cellule morte positive per sette A a D ancora presenti nei dot plot di CD tre contro sette A a D. La scelta dei fluorocromi utilizzati per l'immunofenotipizzazione può creare problemi di compensazione complessi quando si impiegano coloranti per il tracciamento cellulare, poiché l'intensità di marcatura delle cellule non divise è estremamente elevata. In questo esperimento, cellule mononucleate del sangue periferico di 24 ore sono state marcate con PKH 26 e successivamente controstainate con anticorpi anti-CD tre e anti-CD quattro più un colorante di vitalità.In questa serie di dati, le cellule marcate con due micromolar di PKH 26 sono state controcolorate con anti-CD3 FZ7A6D e anti-CD4 APC, quindi analizzate utilizzando la stessa strategia di gating R1 più R2 usata in precedenza; poiché l'overlap del PKH 26 nel canale APC è minimo, gli eventi CD4 positivi e negativi sono stati chiaramente risolti, indipendentemente dall'applicazione della compensazione. Questi dati illustrano come le cellule T vive CD3 positive e CD4 positive siano rimaste ben distinte anche quando la concentrazione finale di PKH 26 è stata aumentata a quattro micromolar. L'uso di anti-CD4 PerCP in combinazione con anti-CD3 FE, PKH 26 a due micromolar e il colorante per la vitalità Pro3 ha prodotto risultati molto peggiori a causa dell'elevato overlap del PKH 26 nel canale PerCP.Le cellule CD4 positive e negative non sono state distinguibili l'una dall'altra nei dati non compensati ed erano appena distinguibili quando veniva applicata la compensazione. L'aumento della concentrazione finale di PKH26 a quattro micromolari ha determinato una perdita completa della capacità di distinguere gli eventi CD4 positivi da quelli CD4 negativi, anche dopo l'applicazione della compensazione. Si noti come i campioni contenenti o privi di anti-CD4 per CP fossero essenzialmente identici.Quando un profilo di diluizione del colorante viene analizzato mediante un software di modellizzazione dei picchi per stimare la frequenza delle cellule nelle successive generazioni di cellule figlie, le posizioni e/o le ampiezze dei picchi successivi possono essere fisse o variabili, in relazione ai valori del picco parentale. Questi valori vengono stimati dal controllo non stimolato.Ad esempio, questo profilo di intensità PKH26 proviene da una coltura non stimolata a 96 ore di un donatore moderato e è stato utilizzato per fornire al wizard di adattamento modulare della proliferazione la prima stima della posizione e larghezza del picco rappresentante le cellule parentali non divise. L'uso di un'impostazione fissa per la posizione del picco richiede che la media di ciascun picco generazionale sia esattamente la metà dell'intensità di fluorescenza del picco precedente. Un'impostazione mobile per la posizione del picco consente alle posizioni finali dei picchi generazionali di variare rispetto alle intensità attese, secondo necessità, al fine di ottenere l'adattamento migliore.In modo analogo, un'impostazione fissa per la larghezza del picco richiede che la larghezza di ciascun picco generazionale sia uguale a quella del picco di controllo parentale o non stimolato. Un'impostazione variabile per la larghezza del picco consente di modificare autonomamente le larghezze finali secondo necessità, al fine di ottenere il miglior adattamento possibile in questa tabella. I risultati delle analisi delle figure precedenti per due donatori diversi sono mostrati per questi donatori nei casi in cui erano evidenti picchi generazionali distinguibili.I valori migliori di chi quadrato ridotto si sono ottenuti quando sia la posizione del picco che la larghezza sono state lasciate libere di variare, nei profili di proliferazione in cui non sono evidenti picchi generazionali distinti; in tali casi, si raccomanda un'impostazione fissa per la posizione del picco. Questi dati illustrano l'uso di due coloranti traccianti per monitorare separatamente le storie di proliferazione di diversi tipi di cellule immunitarie in un saggio citofluorimetrico di soppressione immunitaria. Le cellule T effettrici mostrate in verde sono state marcate con CFSE e le cellule T regolatorie mostrate in blu sono state marcate con cell view.Popolazioni cellulari etichettate in color borgogna sono state mescolate in rapporti variabili e coltivate in presenza di anti-CD3, anti-CD28 e cellule accessorie irradiate per 96 ore. Successivamente, le cellule sono state raccolte e marcate con anti-CD4, PE-Cy7 e violetto esclusione vitalità. Qui, vengono mostrati dati rappresentativi per un rapporto Treg a linfociti T effetori di 0,25 a 1, dopo aver escluso le cellule positive al violetto esclusione vitalità.È stato applicato un gate basato sulla diffusione della luce che includeva linfociti e blasti, escludendo aggregati e detriti, seguito da un gate per includere gli eventi CD4 positivi. La colorazione con cell view claret ha permesso di distinguere facilmente le cellule Treg vitali dalle cellule T effettrici vitali, altamente proliferate, e quindi i profili di proliferazione CFSE dim per le cellule T effettrici CFSE positive e le cellule Treg positive per cell view claret sono stati analizzati mediante software di modellizzazione dei picchi ModFit. Sono stati analizzati circa 25.000 eventi.Di queste, il 48% erano linfociti T effettrici vitali, il 6% erano linfociti T regolatori vitali, mentre il resto era costituito da cellule morte, cellule accessorie e detriti. L'indice di proliferazione calcolato, che riflette l'aumento multiplo del numero di cellule durante il periodo del saggio, era di 3,85 per i linfociti T effettrici e di 1,83 per i Treg. Qui viene mostrato l'effetto della concentrazione delle cellule Treg sull'indice di proliferazione delle cellule T effettrici, calcolato in base al profilo di diluizione del colorante CFSE.I risultati sono stati gli stessi, indipendentemente dal fatto che le cellule Treg fossero marcate con Cell View Claret o lasciate non colorate, indicando che la funzione delle Treg non era alterata dalla colorazione. Come previsto con il tracciamento, il grado di proliferazione delle cellule T effettrici è aumentato all'aumentare della concentrazione delle cellule Treg. Gli indici di proliferazione delle cellule Treg sono stati inoltre calcolati dai profili di diluizione del colorante Cell View Claret a diversi rapporti tra Treg e T effettori.Come previsto, le cellule Treg hanno mostrato una proliferazione minima in assenza di cellule T effettrici, mentre la proliferazione delle cellule Treg è aumentata all'aumentare della concentrazione delle cellule T effettrici. Dopo aver visto il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare con successo i coloranti per il tracciamento cellulare per monitorare la proliferazione cellulare, di come scegliere fluorocromi e controlli di compensazione del colore appropriati e di come selezionare un modello adeguato per quantificare la divisione cellulare in base al diluimento del colorante.Insieme a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per rispondere a domande sperimentali, come la colorazione di cellule T specifiche per antigeni o il sorting in flusso per il recupero di cellule con caratteristiche staminali che sono quiescenti o si dividono lentamente. Grazie mille per aver guardato.

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