Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

L'obiettivo generale di questo metodo è utilizzare coloranti per il tracciamento cellulare per quantificare direttamente il grado di divisione cellulare per diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno di popolazioni complesse. Questo viene ottenuto etichettando innanzitutto la popolazione parentale di cellule con un colorante fluorescente noto per legarsi stabilmente alle proteine cellulari o per intercalarsi in modo non covalente nelle membrane cellulari, al fine di tracciare le cellule marcate con il colorante che rispondono a stimoli. Successivamente, si esegue la colorazione con anticorpi fluorescenti e l'analisi mediante citometria a flusso multiparametrica, consentendo la rilevazione di risposte differenziali tra i tipi di cellule immunitarie di interesse stimolate. Tuttavia, vengono utilizzati controlli non marcati con il colorante di tracciamento per stabilire l'intensità minima di fluorescenza delle cellule figlie distinguibile dalla autofluorescenza. Controlli marcati con il colorante di tracciamento ma non stimolati vengono poi impiegati per stabilire l'intensità di fluorescenza alla quale verranno rilevate le cellule non divise. La stimolazione determina tipicamente un ampio intervallo di intensità, poiché le cellule che proliferano in risposta diventano progressivamente più deboli, mentre le cellule non rispondenti no.

In definitiva, l'uso di software di modellazione dei picchi per stimare la frequenza relativa delle cellule in diverse generazioni consente un confronto quantitativo delle risposte proliferative tra diverse popolazioni o stimoli, utilizzando parametri come l'indice di proliferazione o la frequenza dei precursori. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione di timidina triziata o l'espressione di KI-67, è che la diluizione del DI fornisce una misura diretta della divisione cellulare che può essere combinata con altre analisi citofluorimetriche come l'immunofenotipizzazione e la produzione di citochine. Una dimostrazione visiva del metodo di colorazione con coloranti di membrana è utile poiché l'assorbimento del colorante da parte delle cellule è estremamente rapido.

Di conseguenza, una buona tecnica è fondamentale per ottenere una colorazione omogenea e intensa. Dopo aver isolato le cellule mononucleate del sangue periferico umano, centrifugare per cinque minuti a 300 ×g e a temperatura ambiente per minimizzare la contaminazione da piastrine. Successivamente, risospendere il pellet a 10⁷ cellule per millilitro in HBSS più 1% BSA e porre in ghiaccio.

Rimuovere e conservare 500 microlitri di Eloqua, quindi trasferire un altro aliquota di 500 microlitri di cellule in un tubo conico in polipropilene da 12 per 75 millimetri. Aggiungere 3,5 millilitri di HBSS e centrifugare le cellule per cinque minuti a 400 × g e a temperatura ambiente. Durante il lavaggio, aggiungere 0,5 millilitri del veicolo di marcatura diluente C dal kit PKH26 GL in un altro tubo conico in polipropilene da 12 per 75 millimetri. Aspirare con attenzione il soprannatante lasciando non più di 15-25 microlitri di fluido residuo, avendo cura di non rimuovere alcuna cellula. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri del veicolo di marcatura diluente C al pellet cellulare e aspirare e dispensare la soluzione diverse volte per ottenere una sospensione di cellule singole.

Ora preparare il stock 2X aggiungendo due microlitri di PKH 26 al tubo contenente il diluente C. Solo ora pipettare immediatamente la sospensione cellulare nella soluzione appena preparata di colorante 2X PKH 26 ed aspirare e dispensare contemporaneamente la miscela diverse volte per disperdere uniformemente le cellule in tutto il colorante. Dopo un minuto, aggiungere un millilitro di siero inattivato termicamente per arrestare l'assorbimento del colorante nelle membrane cellulari. Dopo aver centrifugato le cellule, aspirare con attenzione il soprannatante senza rimuovere il pellet.

Quindi disperdere il pellet in quattro millilitri di mezzo completo contenente siero inattivato termicamente al 10% e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta in polipropilene. Lavare le cellule due volte in HBSS più BSA all'1%; le cellule adeguatamente colorate mostreranno una tinta rosa distinta nel pellet. Dopo aver risospeso il pellet cellulare in un millilitro di HBSS più BSA all'1%, contare le cellule e quindi regolare il volume per ottenere una concentrazione finale di 10 alla settima cellule per millilitro. Dopo aver colorato le cellule secondo il protocollo di citometria a flusso indicato nella tabella, utilizzare le prime cinque provette per impostare i parametri di scattering anteriore e laterale e i segnali in tutti e quattro i rilevatori di fluorescenza.

In particolare per il rilevatore utilizzato per monitorare la fluorescenza di PKH 26 nel tubo due. Verificare che tutte le cellule marcate con PKH 26 compaiano sulla scala come un singolo picco simmetrico nel terzo-quarto decennio, con poche o nessuna cellula nell'ultimo canale. Successivamente, utilizzare il software di compensazione del colore e i file in modalità elenco raccolti per i tubi da uno a cinque per stabilire una matrice di sovrapposizione cromatica per ciascun fluorocromo nei rilevatori utilizzati per monitorare gli altri tre fluorocromi.

Applicare quindi questa matrice al file in modalità elenco per il campione sei. Per verificare che la presenza dell'etichettatura con PKH26 non alteri la capacità di rilevare cellule positive per sette A a D. Applicare ora questa matrice di sovrapposizione cromatica appena stabilita al file in modalità elenco per il tubo sette.

Identificare le popolazioni CD tre positivo CD quattro negativo e CD tre positivo CD quattro positivo su un grafico FE contro PC. Verificare che la presenza di anti-CD tre, FE e anti-CD quattro A PC non alteri la capacità di rilevare cellule positive per sette A a D. Infine, applicare la matrice di sovrapposizione cromatica del tubo sette al file in modalità elenco del tubo otto.

Ora aprire un programma contenente un modulo di analisi della proliferazione. Caricare il file colorato con PKH26 stimolato dal set di dati da analizzare. Successivamente, selezionare i parametri per l'analisi, in questo caso PKH26 selezionato su linfociti vitali, negativi per il sette a a d, positivi per cd3 e scatter anteriore rispetto a scatter laterale per l'esclusione di detriti piccoli e aggregati grandi.

Nella definizione di queste regioni, prestare attenzione ad includere l'area ad alto scatter in avanti dove si trovano tipicamente i blast. Successivamente, aprire la procedura guidata per la proliferazione. Fare clic sulla scheda inizio per aprire il file di dati e quindi caricare il controllo positivo non stimolato PKH 26.

Definire la posizione del picco parentale corrispondente alle cellule non divise. Analizzare il file annotando i valori relativi alla posizione e alla larghezza del picco parentale. Se si desidera una larghezza di picco fissa, selezionare l'opzione "lock SD", caricare il controllo negativo P KH 26 e regolare il numero di generazioni impostando il canale del picco per la generazione di cellule figlie dimus al di sopra delle cellule negative per PKH 26.

Questo imposta il numero di generazioni figlie. Il modello può adattarsi accuratamente al termine. Ricaricare il file positivo per PKH26 stimolato.

Se sono evidenti picchi generazionali distinguibili, selezionare l'impostazione floating nell'opzione del modello. Se le decadi logaritmiche non sono esattamente 4,0, regolare lo spaziamento generazionale come descritto nell'articolo. A questo punto, analizzare il campione stimolato e verificare che la regione corrispondente alla posizione del picco parentale rimanga invariata.

Infine, selezionare "analizza" per ogni file sperimentale nel set di dati da applicare. Applicare il modello appena creato e registrare le metriche di proliferazione desiderate risultanti dall'adattamento migliore per ciascun file sperimentale nel set di dati. Questa prima serie di dati illustra l'effetto della tecnica di miscelazione sulle distribuzioni di fluorescenza di PKH26.

Quando coltivate, le cellule mieloidi U 9 37 sono state colorate con il colorante per il tracciamento cellulare utilizzando il metodo appena descritto; questo primo istogramma mostra i dati del controllo non colorato. Le impostazioni del citometro sono state regolate in modo da posizionare l'autofluorescenza di queste cellule nel primo decennio, con nessuna o pochissime cellule che si accumulano nel primo canale. Questo secondo istogramma illustra una buona colorazione con PKH 26.

La rapida miscelazione di due x cellule con due x colorante ha prodotto una distribuzione della fluorescenza intensa, omogenea e simmetrica, ma senza cellule fuori scala alle impostazioni dello strumento utilizzate per l'istogramma precedente. Quando due x cellule sono state aggiunte a due x colorante senza miscelazione immediata, si è ottenuta una distribuzione della fluorescenza più eterogenea. Questa piccola sottopopolazione di cellule debolmente marcate sarebbe stata interpretata erroneamente come cellule figlie se fosse stata presente in un successivo punto temporale nell'istogramma finale di questo esperimento. Una scarsa miscelazione si è verificata anche quando tre microlitri di soluzione concentrata di colorante in etanolo sono stati accidentalmente aggiunti direttamente a 0,5 millilitri di sospensione di due x cellule, producendo una distribuzione dell'intensità di fluorescenza estremamente debole e asimmetrica verso destra.

Di seguito sono riportati risultati tipici di un esperimento di proliferazione in cui cellule mononucleate del sangue periferico umano marcate con PKH 20 sono state coltivate in presenza o assenza di agenti stimolanti. Sono mostrati gli anticorpi anti-CD3 e IL-2. Dopo 96 ore di coltura, le cellule sono state raccolte e sottoposte a colorazione secondaria con anti-CD3, FE anti-CD19 APC e 7AAD.

Sono state confrontate due diverse strategie di gating. Nella prima strategia di gating, è stato utilizzato un dot plot di CD3 rispetto a CD7 per selezionare le cellule T vive, CD3 positive e negative per il marcatore 7-AAD. Successivamente, è stata utilizzata una regione di scatter anteriore e laterale per escludere grandi aggregati, mantenendo comunque i linfociti in fase di blastizzazione.

Gli eventi selezionati per R uno più R due del controllo non colorato sono rappresentati dall'istogramma grigio, mentre le cellule colorate con PKH 26 ma non stimolate sono in blu; si noti la colorazione intensa, simmetrica e omogenea per le cellule T vitali ma non divise nel controllo non stimolato. Questi dati sono stati selezionati nello stesso modo della figura precedente, ma in questo caso le cellule sono state stimolate con anti-CD tre e IL due. L'istogramma di PKH 26 per gli eventi selezionati tramite R uno più R due contiene ora principalmente cellule divise, con intensità ridotta, rappresentate da picchi colorati per ogni generazione di cellule figlie.

Sebbene alcune cellule luminose non divise siano ancora presenti nel picco parentale blu. Si noti che l'intensità delle cellule altamente divise non si sovrappone ancora alla regione in cui vengono misurate le cellule non colorate, il che potrebbe confondere la stima delle metriche basate sul numero di cellule nelle generazioni figlie di intensità più bassa qui considerate. Gli stessi dati sono stati analizzati come nei due precedenti insiemi di figure, ma solo lo scattering della luce e il CD tre sono stati utilizzati per selezionare le cellule T vitali.

Questa strategia di gating esclude molte, ma non tutte, le cellule morte, come dimostrato dalla piccola popolazione residua di sette cellule morte positive per sette A a D ancora presenti nei dot plot di CD tre contro sette A a D. La scelta dei fluorocromi utilizzati per l'immunofenotipizzazione può creare problemi di compensazione complessi quando si impiegano coloranti per il tracciamento cellulare, poiché l'intensità di marcatura delle cellule non divise è estremamente elevata. In questo esperimento, cellule mononucleate del sangue periferico di 24 ore sono state marcate con PKH 26 e successivamente controstainate con anticorpi anti-CD tre e anti-CD quattro più un colorante di vitalità.

In questa serie di dati, le cellule marcate con due micromolar di PKH 26 sono state controcolorate con anti-CD3 FZ7A6D e anti-CD4 APC, quindi analizzate utilizzando la stessa strategia di gating R1 più R2 usata in precedenza; poiché l'overlap del PKH 26 nel canale APC è minimo, gli eventi CD4 positivi e negativi sono stati chiaramente risolti, indipendentemente dall'applicazione della compensazione. Questi dati illustrano come le cellule T vive CD3 positive e CD4 positive siano rimaste ben distinte anche quando la concentrazione finale di PKH 26 è stata aumentata a quattro micromolar. L'uso di anti-CD4 PerCP in combinazione con anti-CD3 FE, PKH 26 a due micromolar e il colorante per la vitalità Pro3 ha prodotto risultati molto peggiori a causa dell'elevato overlap del PKH 26 nel canale PerCP.

Le cellule CD4 positive e negative non sono state distinguibili l'una dall'altra nei dati non compensati ed erano appena distinguibili quando veniva applicata la compensazione. L'aumento della concentrazione finale di PKH26 a quattro micromolari ha determinato una perdita completa della capacità di distinguere gli eventi CD4 positivi da quelli CD4 negativi, anche dopo l'applicazione della compensazione. Si noti come i campioni contenenti o privi di anti-CD4 per CP fossero essenzialmente identici.

Quando un profilo di diluizione del colorante viene analizzato mediante un software di modellizzazione dei picchi per stimare la frequenza delle cellule nelle successive generazioni di cellule figlie, le posizioni e/o le ampiezze dei picchi successivi possono essere fisse o variabili, in relazione ai valori del picco parentale. Questi valori vengono stimati dal controllo non stimolato.

Ad esempio, questo profilo di intensità PKH26 proviene da una coltura non stimolata a 96 ore di un donatore moderato e è stato utilizzato per fornire al wizard di adattamento modulare della proliferazione la prima stima della posizione e larghezza del picco rappresentante le cellule parentali non divise. L'uso di un'impostazione fissa per la posizione del picco richiede che la media di ciascun picco generazionale sia esattamente la metà dell'intensità di fluorescenza del picco precedente. Un'impostazione mobile per la posizione del picco consente alle posizioni finali dei picchi generazionali di variare rispetto alle intensità attese, secondo necessità, al fine di ottenere l'adattamento migliore.

In modo analogo, un'impostazione fissa per la larghezza del picco richiede che la larghezza di ciascun picco generazionale sia uguale a quella del picco di controllo parentale o non stimolato. Un'impostazione variabile per la larghezza del picco consente di modificare autonomamente le larghezze finali secondo necessità, al fine di ottenere il miglior adattamento possibile in questa tabella. I risultati delle analisi delle figure precedenti per due donatori diversi sono mostrati per questi donatori nei casi in cui erano evidenti picchi generazionali distinguibili.

I valori migliori di chi quadrato ridotto si sono ottenuti quando sia la posizione del picco che la larghezza sono state lasciate libere di variare, nei profili di proliferazione in cui non sono evidenti picchi generazionali distinti; in tali casi, si raccomanda un'impostazione fissa per la posizione del picco. Questi dati illustrano l'uso di due coloranti traccianti per monitorare separatamente le storie di proliferazione di diversi tipi di cellule immunitarie in un saggio citofluorimetrico di soppressione immunitaria. Le cellule T effettrici mostrate in verde sono state marcate con CFSE e le cellule T regolatorie mostrate in blu sono state marcate con cell view.

Popolazioni cellulari etichettate in color borgogna sono state mescolate in rapporti variabili e coltivate in presenza di anti-CD3, anti-CD28 e cellule accessorie irradiate per 96 ore. Successivamente, le cellule sono state raccolte e marcate con anti-CD4, PE-Cy7 e violetto esclusione vitalità. Qui, vengono mostrati dati rappresentativi per un rapporto Treg a linfociti T effetori di 0,25 a 1, dopo aver escluso le cellule positive al violetto esclusione vitalità.

È stato applicato un gate basato sulla diffusione della luce che includeva linfociti e blasti, escludendo aggregati e detriti, seguito da un gate per includere gli eventi CD4 positivi. La colorazione con cell view claret ha permesso di distinguere facilmente le cellule Treg vitali dalle cellule T effettrici vitali, altamente proliferate, e quindi i profili di proliferazione CFSE dim per le cellule T effettrici CFSE positive e le cellule Treg positive per cell view claret sono stati analizzati mediante software di modellizzazione dei picchi ModFit. Sono stati analizzati circa 25.000 eventi.

Di queste, il 48% erano linfociti T effettrici vitali, il 6% erano linfociti T regolatori vitali, mentre il resto era costituito da cellule morte, cellule accessorie e detriti. L'indice di proliferazione calcolato, che riflette l'aumento multiplo del numero di cellule durante il periodo del saggio, era di 3,85 per i linfociti T effettrici e di 1,83 per i Treg. Qui viene mostrato l'effetto della concentrazione delle cellule Treg sull'indice di proliferazione delle cellule T effettrici, calcolato in base al profilo di diluizione del colorante CFSE.

I risultati sono stati gli stessi, indipendentemente dal fatto che le cellule Treg fossero marcate con Cell View Claret o lasciate non colorate, indicando che la funzione delle Treg non era alterata dalla colorazione. Come previsto con il tracciamento, il grado di proliferazione delle cellule T effettrici è aumentato all'aumentare della concentrazione delle cellule Treg. Gli indici di proliferazione delle cellule Treg sono stati inoltre calcolati dai profili di diluizione del colorante Cell View Claret a diversi rapporti tra Treg e T effettori.

Come previsto, le cellule Treg hanno mostrato una proliferazione minima in assenza di cellule T effettrici, mentre la proliferazione delle cellule Treg è aumentata all'aumentare della concentrazione delle cellule T effettrici. Dopo aver visto il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare con successo i coloranti per il tracciamento cellulare per monitorare la proliferazione cellulare, di come scegliere fluorocromi e controlli di compensazione del colore appropriati e di come selezionare un modello adeguato per quantificare la divisione cellulare in base al diluimento del colorante.

Insieme a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per rispondere a domande sperimentali, come la colorazione di cellule T specifiche per antigeni o il sorting in flusso per il recupero di cellule con caratteristiche staminali che sono quiescenti o si dividono lentamente. Grazie mille per aver guardato.