Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una rete vascolare umana in vivo. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando cellule endoteliali progenitrici derivate dal sangue umano e cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano. Successivamente, entrambi i tipi cellulari vengono mescolati in un gel a base di collagene, che viene iniettato per via sottocutanea in un topo immunodeficiente.

Sette giorni dopo, l'impianto viene prelevato e valutato per la formazione di una rete vascolare umana. In definitiva, la presenza di microvasi specifici dell'uomo all'interno degli impianti può essere verificata mediante istologia e immunohistochimica. Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto a un metodo invasivo come l'impianto chirurgico di un costrutto è rappresentato dal LED, che è semplice e facile da eseguire, e non richiede interventi chirurgici.

Iniziare scongelando una provetta di E CFCs e diluire immediatamente le cellule in un conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM. Centrifugare la sospensione cellulare a 1200 giri/min per cinque minuti e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di mezzo EGM due caldo. Trasferire quindi le cellule in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri rivestita con gelatina al 1% e incubare le cellule durante la notte in un incubatore umidificato.

La mattina seguente, aspirare delicatamente il mezzo e tutte le cellule non legate. Quindi nutrire le cellule legate con 10 millilitri di mezzo E GM due fresco. Continuare questo processo nei giorni successivi fino a quando si sarà formato un monolayer confluito.

Quindi lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Sostituire il PBS con due millilitri di tripsina EDTA e reinserire la piastra nell'incubatore per cinque minuti. Dopo cinque minuti, osservare al microscopio, battere delicatamente sulla piastra e verificare se le cellule si sono staccate.

Se necessario, ripetere le brevi incubazioni con agitazione delicata. Una volta che le cellule si sono completamente staccate, aggiungere otto millilitri di mezzo EGM-2 alle cellule e trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule e centrifugarle a 1200 giri al minuto per cinque minuti.

Adesso seminare le cellule su piastre per coltura tissutale rivestite con gelatina al 1% a una densità di semina di 5.000 cellule per centimetro quadrato. Nel mezzo EGM due, incubare le cellule e rinnovare il mezzo ogni due o tre giorni con EGM due. Ripetere questa procedura per i passaggi successivi compresi tra il quarto e l'ottavo passaggio.

Le E CFC saranno pronte per l'uso. Questo protocollo può essere utilizzato anche per coltivare le MSC. Basta sostituire il mezzo E GM due con il mezzo M-S-C-G-M.

Utilizzare una piastra da coltura non rivestita. Iniziare il sottocoltivo all'80% di confluenza e sottocoltivare a una densità di semina di 10.000 cellule per centimetro quadrato. Questo esperimento richiede 800.000 E CFC e 1.200.000 MSC per impianto.

Generalmente vengono preparati contemporaneamente cinque impianti. Per iniziare, aspirare il mezzo cellulare dalle piastre di coltura e lavare ogni piastra con 10 millilitri di PBS. Sostituire il PBS con due millilitri di tripsina EDTA e incubare le piastre con un leggero movimento oscillatorio.

Controllare le cellule al microscopio ogni due-cinque minuti finché non si sono staccate tutte. Quindi aggiungere otto millilitri di DMEM e raccogliere la soluzione cellulare. In un tubo conico da 15 millilitri, contare le cellule e trasferire un numero sufficiente di cellule per cinque innesti in un singolo tubo conico da 15 millilitri.

Quindi centrifugare le cellule a 1200 giri/min per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Preparare con attenzione una miscela di fibrinogeno e fibronectina collagene su ghiaccio. Successivamente, risospendere molto delicatamente il pellet cellulare nella miscela fredda di ghiaccio.

Evitando la formazione di bolle d'aria, caricare la sospensione cellulare in una siringa da un millilitro e applicare un ago da 26 gauge con tappo. Mantenere la siringa caricata sul ghiaccio fino all'iniezione della miscela cellulare. Anestetizzare quattro topi nudi atimici immunodepressi di età compresa tra quattro e sei settimane utilizzando una camera contenente isoflurano.

Una volta che i topi sono anestetizzati e non reagiscono alla compressione delle dita dei piedi, procedere con le iniezioni per ogni topo. Utilizzare un ago da 30 gauge per iniettare 50 microlitri di soluzione di trombina per via sottocutanea nella regione dorsale superiore. Nello stesso punto, iniettare 200 microlitri della miscela cellulare.

Utilizzando un ago da 26 gauge, le macromolecole iniettate si geleranno e formeranno un piccolo rigonfiamento apprezzabile sotto la pelle. Dopo l'iniezione, posizionare i topi su uno strato di garza per comfort e calore. Osservarli fino a quando non riacquistano la capacità di deambulare.

Nel corso dei tre giorni successivi, effettuare un'osservazione giornaliera dello stato di salute generale dell'animale. Una settimana dopo le iniezioni, eutanasia i topi con anidride carbonica ed estrarre chirurgicamente il tappo di gel. Dopo il recupero, fotografare i tappi di gel posizionandoli accanto a un righello, quindi inserire ciascun tappo di gel in una cassetta istologica e immergerli in formalina neutra tamponata al 10% per tutta la notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, lavare via il formalina neutra tamponata al 10% con acqua distillata. Conservare le cassette in PBS a quattro gradi Celsius fino alla valutazione istologica. Preparare sezioni di sette micron dell'impianto incorporato in paraffina.

Quindi quantifichi la densità dei microvasi nella parte centrale degli impianti. Con l'aiuto di una colorazione H e E, valuti il numero di vasi per millimetro quadrato per dimostrare la natura umana dei vasi microvascolari. Colori le sezioni con un anticorpo anti-CD31 umano disponibile in commercio in un rapporto di diluizione 1:100.

Questa immagine a contrasto di fase mostra la tipica morfologia a selciato delle cellule endoteliali in un monolayer confluenziale caratteristico delle eCFC derivate dal sangue del cordone. Questa immagine mostra la morfologia tipica a forma di fuso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo osseo umano. Dopo un'incubazione di una settimana nell'ospite murino, l'impianto contrassegnato da una linea tratteggiata gialla appariva molto diverso dai tessuti dell'ospite a ingrandimento maggiore.

Erano presenti numerosi microvasi che mostravano le loro strutture luminari contenenti globuli rossi, evidenziati dalle frecce gialle. Quando le sezioni sono state esaminate mediante immunostaining, il lume dei microvasi risultava reattivo verso un anticorpo monoclonale anti-CD31 umano. I nuclei cellulari sono stati contrastati con ematina.

Una volta padroneggiata, questa tecnologia può essere eseguita entro un'oncia se viene effettuata correttamente.