Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare una rete vascolare umana in vivo. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule formanti colonie endoteliali derivate dal sangue umano e le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano. Entrambi i tipi di cellule vengono quindi miscelati in un gel a base di collagene, che viene iniettato per via sottocutanea in un topo immunodeficiente.

Sette giorni dopo, l'impianto viene prelevato e valutato per la formazione di una rete vascolare umana. In definitiva, la presenza di microvasi specifici umani all'interno degli impianti può essere verificata attraverso la sua istologia e immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto a un metodo acido come l'impianto chirurgico del costrutto è LED, è semplice e facile da eseguire e non richiede un intervento chirurgico.

Iniziare scongelando una fiala di E CFC e diluire immediatamente le cellule in un conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM. Far girare la sospensione della cella a 1200 giri/min per cinque minuti e Resus sospendere il pellet della cella in 10 millilitri di terreno caldo EGM two. Quindi trasferire le cellule in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri rivestita con gelatina all'1% e incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato.

La mattina seguente, aspirare delicatamente il terreno e le eventuali cellule non legate. Quindi nutrire le cellule legate con 10 millilitri di terreno fresco E GM two. Continuare questo processo nei giorni successivi fino a quando non si è formato un monostrato confluente.

Quindi lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Sostituire il PBS con due millilitri di tripsin EDTA e rimettere la piastra nell'incubatrice per cinque minuti. Dopo cinque minuti al microscopio, picchiettare delicatamente la piastra e controllare se le cellule si sono staccate.

In caso contrario, ripetere le brevi incubazioni con un leggero dondolio. Una volta che le cellule si sono completamente staccate, aggiungere otto millilitri di EGM due medium alle cellule e trasferire le cellule in un conico da 15 millilitri. Conta le celle e falle girare a 1200 giri/min per cinque minuti.

Ora piastrellate le cellule su piastre di coltura tissutale rivestite con gelatina all'1% a una densità di seduta di 5.000 cellule per centimetro quadrato. In EGM two medium, incubare le cellule e nutrirle ogni due o tre giorni con EGM two medium. Ripetere questa procedura per i passaggi successivi tra il quarto e l'ottavo.

Gli E CFC saranno pronti per l'uso. Questo protocollo può essere utilizzato anche per far crescere le MSC. Basta sostituire E GM two medium con M-S-C-G-M medium.

Utilizzare una piastra di coltura non rivestita. Iniziare la subcoltura all'80% di confluenza e la sottocoltura a una densità di semina di 10.000 cellule per centimetro quadrato. Questo esperimento richiede 800.000 E CFC e 1.200.000 MSC per impianto.

Generalmente vengono preparati cinque impianti contemporaneamente. Per iniziare, aspirare un terreno cellulare dalle piastre di coltura e lavare ogni piastra di cellule con 10 millilitri di PBS. Sostituire il PBS con due millilitri di tripsina EDTA e incubare le piastre con un leggero oscillamento.

Controllare le cellule al microscopio ogni due-cinque minuti fino a quando le cellule non si sono tutte staccate. Quindi aggiungere otto millilitri di DMEM e raccogliere la soluzione cellulare. In una conica da 15 millilitri, contare le cellule e trasferire abbastanza cellule per cinque impianti in una singola conica da 15 millilitri.

Quindi far girare le celle a 1200 giri/min per cinque minuti e rimuovere lo snat. Preparare con cura una miscela di fibrinogeno e collagene fibronectina con ghiaccio. Quindi risospendere molto delicatamente il pellet di cella nella miscela ghiacciata.

Evitando la formazione di bolle d'aria, caricare la sospensione cellulare in una siringa da un millilitro e collegare un ago calibro 26 con tappo. Tenere la siringa caricata sul ghiaccio fino a quando non viene iniettata la miscela cellulare. Anestetizzato quattro topi immunodeficienti nudi atimici di sei settimane utilizzando una camera al fluoro ISO.

Una volta che i topi sono anestetizzati e non rispondono al pizzicamento delle dita, procedere con le iniezioni per ogni topo. Utilizzare un ago calibro 30 per iniettare 50 microlitri di soluzioni di trombina per via sottocutanea nella regione dorsale superiore. Nella stessa posizione, iniettare 200 microlitri della miscela cellulare.

Utilizzando un ago calibro 26, le macromolecole iniettate gelificano e formano una piccola ma apprezzabile protuberanza sotto la pelle. Dopo l'iniezione, posizionare i topi su uno strato di garza per comfort e calore. Osservali fino a quando non diventano deambulanti.

Nei prossimi tre giorni, fai un'osservazione quotidiana della salute generale dell'animale. Una settimana dopo le iniezioni, sopprimere i topi con anidride carbonica e rimuovere chirurgicamente il tappo di gel. Una volta recuperati, fotografare i tappi di gel accanto a un righello, quindi posizionare ogni tappo di gel in una cassetta istologica e immergerli in formina tamponata neutra al 10% per una notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, lavare via la formina tamponata neutra al 10% con acqua distillata. Conservare le cassette in PBS a quattro gradi Celsius fino a quando non vengono valutate per la valutazione istologica. Realizzare sette sezioni micron dell'impianto incorporate nella paraffina.

Quindi quantificare la densità dei microvasi nella parte centrale degli impianti. Con l'aiuto di un punteggio di colorazione H ed e, il numero di vasi per millimetro quadrato per dimostrare la natura umana dei vasi microvascolari. Colorare le sezioni con un anticorpo anti-umano CD 31 disponibile in commercio con una diluizione da uno a 100.

Questa immagine a contrasto di fase mostra la caratteristica morfologia dei ciottoli delle cellule endoteliali in un tipico monostrato confluente di sangue cordonale derivato da e CFC. Questa immagine mostra la tipica morfologia a forma di fuso delle MSC derivate dal midollo osseo umano. Dopo una settimana di incubazione nell'ospite di topo, l'impianto contrassegnato da una linea tratteggiata gialla appariva molto diverso dai tessuti dell'ospite a un ingrandimento più elevato.

Sono stati rivelati più microvasi, le cui strutture luminali contengono globuli rossi e sono evidenziate dalle punte di freccia gialle. Quando i tappi sono stati esaminati immunoistochimicamente, il lume dei microvasi era reattivo a un anticorpo monoclonale contro il CD 31 umano. I nuclei cellulari erano controcolorati con l'ematina.

Una volta padroneggiata, questa tecnologia può essere eseguita entro un'oncia se eseguita correttamente.