Cellule staminali base Immunità Engineered contro l'infezione da HIV nel modello umanizzato mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un topo umanizzato modificato con un recettore dell'antigene chimerico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori dell'HIV e dell'immunologia, in particolare per quanto riguarda la valutazione dell'efficacia dell'immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro l'infezione da HIV e altre infezioni croniche e malattie tumorali, come i meccanismi di fallimento del sistema immunitario e i modi per potenziare la risposta immunitaria e sviluppare terapie atte a migliorare l'immunità antivirale o antitumorale.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un ampio numero di manipolazioni sperimentali. Il modello di topi BLT umanizzati riproduce l'immunità umana e, in questo caso, permette test preclinici per terapie geniche cellulari contro l'infezione da HIV. A dimostrare la procedura saranno Valerie Rezek e Brianna Lam, tecnici del mio laboratorio.

Iniziare utilizzando bisturi per tagliare il timo in piccoli pezzi di circa un millimetro cubo in una piastra contenente mezzo RPMI integrato. Quindi, utilizzare pinze curve e smussate per posizionare ciascun pezzo di timo in una singola pozzetta di una piastra a 96 pozzette. Aggiungere da 100 a 200 microlitri di mezzo in tutte le pozzette in modo che il tessuto non si secchi.

Visualizzare il tessuto al microscopio per eliminare qualsiasi tessuto che potrebbe non essere timo o che presenta tessuto connettivo adiacente. Successivamente, rimuovere i frammenti di timo confermati e trasferirli in una fiasca da coltura cellulare T25. Aggiungere sette millilitri di mezzo RPMI integrato con antibiotici nella fiasca e agitare delicatamente per favorire il mescolamento.

Quindi posizionare il matraccio nell'incubatrice per colture cellulari. Questo passaggio previene la contaminazione batterica del tessuto. Iniziare l'isolamento delle HSC positive per CD34 da fegato fetale utilizzando due bisturi per tagliare il fegato in piccoli pezzi di circa tre millimetri cubi in una piastra contenente IMDM.

Rimuovere e scartare qualsiasi tessuto connettivo bianco. Quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago smussato da 16 gauge per prelevare i pezzi di fegato e il mezzo e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Aspirare e rilasciare delicatamente il campione altre cinque o sette volte per omogeneizzare completamente il tessuto.

Dopo aver preparato 10 millilitri di terreno IMDM, integrarlo con collaghenasi, ialuronidasi, antibiotici, Dnase e antimicotico. Far passare il terreno attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi aggiungere il terreno filtrato alla sospensione epatica.

Dopo aver chiuso il tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione epatica, sigillarlo ermeticamente con un film autoadesivo come il parafilm per prevenire fuoriuscite. Ruotare nel rotatore per provette all'interno dell'incubatore a 37 gradi celsius per 90 minuti. Al termine dell'incubazione, filtrare la sospensione cellulare digerita attraverso un setaccio cellulare da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Aggiungere PBS alla sospensione per portare il volume totale a 50 millilitri. Dividere questa in due provette da 50 millilitri, ciascuna contenente 25 millilitri di sospensione cellulare. Lentamente e delicatamente, sovrapporre le cellule in ciascuna provetta con 10 millilitri di un mezzo di centrifugazione a densità, come Ficoll.

Centrifugare a 1200 ×g per 20 minuti senza pausa. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione l'interfase da ogni tubo e trasferirla in due tubi separati da 50 millilitri. Portare il volume di ciascun tubo di interfase a 50 millilitri con PBS.

Quindi centrifugare a 300 × g per sette-dieci minuti. Raccogliere e lavare i pellet cellulari tre volte con 50 millilitri di PBS contenente il 2 percento di FBS, centrifugando a 300 × g per sette-dieci minuti ogni volta. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet in 50 millilitri di terreno RPMI aggiunto di FBS al 10 percento.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, separare immediatamente le cellule positive per CD34 utilizzando un kit di separazione per CD34 seguendo il protocollo del produttore e conservare entrambe le frazioni, positiva e negativa per CD34. Versare i pezzi di timo e il mezzo dal flacone in una piastra da 60 millimetri.

Raffreddare alcuni puntali per pipetta a spostamento positivo ponendoli in provette sterili da 1,5 millilitri con tappo a vite, aperte, e posizionate sul ghiaccio. Inoltre, mettere i pellet cellulari e un volume di miscela proteica gelatinosa, come matrigel, sul ghiaccio. Anestetizzare i topi riceventi con un anestetico iniettabile seguendo un protocollo per animali approvato.

Verificare il livello di anestesia del topo stringendo una zampa. L'assenza di reazione alla pressione indica un piano anestetico chirurgico. Depilare il lato sinistro di ogni topo dalla regione dell'anca fino a quella della spalla, tra il centro della schiena e l'addome.

Iniettare sottocutaneamente sei milligrammi per chilogrammo di Carprofen diluito nel triangolo scapolare o inguinale dell'animale. Lavare la cannula del trocar con PBS in una piastra da 60 millimetri. Utilizzando una pinza curva smussata, posizionare un frammento di timo proveniente dalla piastra da 60 millimetri appena all'interno dell'apertura della cannula, quindi arretrare il trocar per aspirare il tessuto all'interno della cannula.

Successivamente, utilizzare una pipetta a spostamento positivo e una punta fredda per aggiungere cinque microlitri di miscela proteica gelatinosa fredda nel tubo contenente il pellet cellulare. Mescolare delicatamente per ottenere la sospensione cellulare. Pipettare la sospensione cellulare nell'apertura della cannula e tirare lentamente indietro il trocar per caricare l'ago.

Pulire con un tampone la zona rasata del topo con iodopovidone seguito da isopropenile per tre volte. Individuare il punto più scuro sotto la pelle che indica la posizione della milza. Il rene si trova approssimativamente a cinque millimetri in direzione dorsale rispetto alla milza.

Dopo aver verificato un adeguato livello di anestesia attraverso l'assenza di reazione alla compressione della zampa, utilizzare pinze curve per sollevare la cute e forbici chirurgiche per praticare un'incisione di 15 millimetri parallela alla milza. Successivamente, effettuare un taglio analogo nello strato peritoneale sottostante. Nei maschi, il rene è facilmente visibile e può essere semplicemente espulso premendo sull'addome.

Supportare il rene con una pinza emostatica o con un paio di pinze curve a punta ottusa. Nelle femelle, le ovaie tendono a ostacolare l'estrazione del rene. Utilizzando una pinza emostatica, afferrare l'ovaia ed esporre con attenzione il rene.

Utilizzare pinzette con punta aghiforme per praticare un piccolo foro all'estremità posteriore della capsula renale. Inserire il trocar in questo foro e farlo scorrere lungo il rene fino a quando l'apertura della cannula non sia completamente coperta dalla capsula renale. Espellere delicatamente il tessuto situato sotto la capsula renale ed estrarre il trocar.

Utilizzare la pinza curva per assicurarsi che il frammento di timo non fuoriesca nuovamente con l'ago. Successivamente, sollevare il peritoneo con la pinza ed usare delicatamente l'emostatico per riportare il rene nella sua posizione. Fare un punto annodato con doppio nodo utilizzando un filo chirurgico nel peritoneo.

Posizionare anche due clip per ferite Autoclips per chiudere la cute. Ora mescolare le cellule CD34 positive transdotte ed aspirare 0,5 volte 10 alla sesta cellule in un volume di 100 microlitri in una siringa per insulina. Iniettare queste cellule nel topo mediante iniezione attraverso la vena retro-orbitale.

Dopo l'iniezione, applicare una piccola goccia di lubrificante oculare su ciascun occhio e posizionare il topo su un fianco nuovamente nella gabbia. Dopo aver impiantato tutti i topi, verificare che gli animali abbiano riacquistato coscienza e siano in grado di muoversi prima di riportarli nella stanza di allevamento. I topi sono stati sacrificati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico e sono stati prelevati sangue, milza, timo e midollo osseo.

Le cellule risultanti sono state sottoposte a colorazione con anticorpi anti-CD45 umano e anti-CD4 umano ed analizzate mediante citometria a flusso. Come mostrato qui, le cellule modificate con recettore chimerico dell'antigene CD4 possono essere rilevate in diversi tessuti linfoidi mediante citometria a flusso. Le cellule modificate con recettore chimerico dell'antigene CD4 possono differenziarsi in diversi linaggi.

Qui, sono stati prelevati splenociti da topi modificati con recettore dell'antigene chimerico CD4 e colorati per marcatori di cellule T e B. Le cellule negative per i marcatori di cellule T e B risultavano positive per i marcatori di monociti e macrofagi e per le cellule natural killer. Gli splenociti provenienti da topi infettati con HIV e portatori del recettore dell'antigene chimerico CD4 sono stati stimolati con cellule T1 infette o non infette da HIV e ne è mostrata la produzione intracellulare di citochine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire topi BLT umanizzati modificati con recettori chimerici dell'antigene. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare a un ritmo costante e prestare molta attenzione allo stato del topo su cui si sta operando.

Per i principianti è fondamentale esercitarsi nella chirurgia e nelle iniezioni oculari prima di lavorare con tessuti e cellule staminali più preziosi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV e di altre malattie infettive per esplorare la patogenesi delle malattie e le terapie basate sul sistema immunitario nel modello di topo umanizzato.