Cellule staminali base Immunità Engineered contro l'infezione da HIV nel modello umanizzato mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare topi umanizzati modificati con il recettore chimerico dell'antigene. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV e dell'immunologia per quanto riguarda la verifica dell'efficacia dell'immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro l'infezione da HIV e altre infezioni croniche e neoplasie. Come un meccanismo di insufficienza immunitaria e modi per migliorare il sistema immunitario e sviluppare una terapia per creare una migliore immunità antivirale o antitumorale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è in grado di eseguire una grande quantità di manipolazioni sperimentali. Il modello di topi BLT umanizzati imita l'immunità umana e in questo caso consente test preclinici per terapie geniche cellulari contro l'infezione da HIV. A dimostrare la procedura saranno Valerie Rezek e Brianna Lam, tecnici del mio laboratorio.

Inizia usando i bisturi per tagliare il timo in piccoli pezzi di circa un millimetro a cubetti in un piatto contenente un mezzo RPMI integrato. Quindi ho usato una pinza smussata curva per posizionare ogni singolo pezzo di timo in un singolo pozzetto su una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100-200 microlitri di terreno in tutti i pozzetti in modo che il tessuto non si asciughi.

Visualizzare il tessuto al microscopio per eliminare qualsiasi tessuto che potrebbe non essere timo o che ha tessuto connettivo attaccato. Quindi, rimuovere i pezzi confermati di timo e unirli in un pallone per colture cellulari T25. Aggiungere sette millilitri di terreno RPMI integrato con antibiotici al pallone e agitare delicatamente per mescolare.

Quindi posizionare il pallone nell'incubatore per colture tissutali. Questo passaggio impedisce la contaminazione batterica del tessuto. Iniziare l'isolamento delle HSC CD34 positive dal fegato fetale utilizzando due bisturi per tagliare il fegato in piccoli pezzi di circa tre millimetri cubi in un piatto contenente IMDM.

Rimuovere ed eliminare il tessuto connettivo bianco. Quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago smussato calibro 16 per estrarre i pezzi di fegato e il terreno e trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri. Prelevare ed espellere delicatamente altre cinque o sette volte per omogeneizzare completamente il tessuto.

Dopo aver preparato 10 millilitri di terreno IMDM, integralo con collagenasi, ialuronidasi, antibiotici, Dnasi e antimicotici. Passare il media attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi aggiungere il terreno filtrato alla sospensione epatica.

Dopo aver tappato il tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione epatica, sigillare ermeticamente con una pellicola autosigillante come il parafilm per evitare perdite. Ruotare in un rotatore di tubi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo l'incubazione, filtrare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare da 100 micron in una provetta fresca da 50 millilitri.

Aggiungi PBS alla sospensione per portare il volume totale fino a 50 millilitri. Dividi questo in due provette da 50 millilitri, ciascuna contenente 25 millilitri di sospensione cellulare. Rallentare e appoggiare delicatamente le cellule in ciascuna provetta con 10 millilitri di un mezzo di centrifugazione a densità, come il Ficoll.

Centrifugare a 1200 volte g per 20 minuti senza interruzioni. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela l'interfaccia da ciascuna provetta e trasferirla in due provette separate da 50 millilitri. Porta il volume di ogni tubo di interfaccia fino a 50 millilitri con PBS.

E poi centrifugare a 300 volte g per sette-10 minuti. Unire e lavare i pellet di cella tre volte con 50 millilitri di PBS contenente il due percento di FBS, centrifugando a 300 volte g per sette-10 minuti ogni volta. Dopo la centrifuga finale, risospendere il pellet in 50 millilitri di supporto RPMI più il 10% di FBS.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, ordina immediatamente le cellule CD34 positive utilizzando un kit di selezione CD34 secondo il protocollo del produttore e salva sia la frazione CD34 positiva che quella CD34 negativa. Versare i pezzi di timo e il terreno dal pallone in un piatto da 60 millimetri.

Raffreddare alcuni puntali per pipette a spostamento positivo mettendoli in provette sterili aperte da 1,5 millilitri con tappo a vite su ghiaccio. Inoltre, posizionare i pellet cellulari e un volume di miscela proteica gelatinosa come il matrigel sul ghiaccio. Anestetizzare i topi riceventi con un anestetico iniettabile secondo un protocollo animale approvato.

Controlla il livello di anestesia del topo stringendo una zampa. L'assenza di una reazione al pizzico indica un piano chirurgico di anestesia. Radere il lato sinistro di ogni topo dall'anca alla spalla tra il centro della schiena e lo stomaco.

Iniettare per via sottocutanea sei milligrammi per chilogrammo di carprofene diluito nella spalla o nel triangolo inguinale dell'animale. Lavare la cannula del trocar con PBS in un piatto da 60 millimetri. Usando un paio di pinze curve smussate, posizionare un pezzo di timo dal piatto da 60 millimetri appena all'interno dell'apertura della cannula, quindi tirare indietro il trocar per aspirare il tessuto nella cannula.

Quindi, utilizzare una pipetta a spostamento positivo e un puntale freddo per aggiungere cinque microlitri di miscela proteica gelatinosa fredda nella provetta con il pellet cellulare. E mescolare delicatamente per generare la sospensione cellulare. Pipettare la sospensione cellulare nell'apertura della cannula e tirare lentamente indietro il trocar per caricare l'ago.

Tamponare l'area rasata del topo con iodio povidone seguito da isopropenil tre volte. Determina la macchia più scura sotto la pelle che indica la posizione della milza. Il rene è di circa cinque millimetri dorsale alla milza.

Dopo aver assicurato un adeguato livello di anestesia grazie all'assenza di una reazione del pizzico della zampa, utilizzare una pinza curva per sollevare la pelle e utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione di 15 millimetri nella pelle parallela alla milza. Quindi fai un taglio simile nello strato di peritoneo sottostante. Nei maschi il rene è facilmente visibile, quindi estruso semplicemente premendo sull'addome.

Sostieni il rene con un emostatico o un paio di pinze smussate curve. Nelle femmine, le ovaie tendono a bloccare il rene da una facile estrazione. Usando un emostato, prelevare l'ovaio ed esporre con cura il rene.

Usa una pinza con punta ad ago per praticare un piccolo foro all'estremità posteriore della capsula renale. Far scorrere il trocar in questo foro e lungo il rene fino a quando l'apertura della cannula non è completamente coperta dalla capsula renale. Estrudere delicatamente il tessuto sotto la capsula renale ed estrarre il trocar.

Usa la pinza curva per assicurarti che il pezzo di timo non torni fuori con l'ago. Quindi, solleva il peritoneo con la pinza e usa delicatamente l'emostatico per spingere il rene di nuovo in posizione. Legare un punto a doppio nodo con sutura chirurgica nel peritoneo.

Posiziona anche due clip Avvolte Autoclips per chiudere la pelle. Ora mescola le cellule CD34 positive trasdotte e aspira 0,5 volte 10 nelle sei cellule in un volume di 100 microlitri in una siringa da insulina. Iniettare queste cellule nel topo attraverso l'iniezione di vena retroorbitale.

Dopo l'iniezione, tamponare una piccola goccia di lubrificante oculare su ciascun occhio e adagiare il topo su un fianco in una gabbia. Dopo aver impiantato tutti i topi, confermare che gli animali abbiano riacquistato coscienziosità e siano deambulanti prima di riportarli nella stanza di stabulazione. I topi sono stati sacrificati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico e sono stati prelevati sangue, milza, timo e midollo osseo.

Le cellule risultanti sono state colorate con anticorpi anti-umano CD45 e anti-umano CD4 e analizzate mediante citometria a flusso. Come si vede qui, le cellule modificate con il recettore dell'antigene chimerico CD4 possono essere rilevate in più tessuti linfoidi mediante citometria a flusso. Le cellule modificate con il recettore chimerico dell'antigene CD4 possono differenziarsi in più linee.

Qui, gli splenociti di topi modificati con il recettore dell'antigene chimerico CD4 sono stati raccolti e colorati per i marcatori delle cellule T e B. Le cellule negative per i marcatori delle cellule T e B erano positive per i marcatori di monociti e macrofagi e per le cellule natural killer. Gli splenociti di topi con recettore chimerico dell'antigene CD4 infetti da HIV sono stati stimolati con cellule T 1 infette o non infette da HIV ed è stata dimostrata la loro produzione intracellulare di citochine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire topi BLT umanizzati modificati con recettori chimerici dell'antigene. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare a un ritmo costante e prestare molta attenzione allo stato del mouse su cui si viene operati.

Per i principianti è importante praticare la chirurgia e le iniezioni oculari prima di lavorare con tessuti e cellule staminali più preziose. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV e di altre malattie infettive per esplorare la patogenesi della malattia e le terapie basate sul sistema immunitario nel modello murino umanizzato.