Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

L'obiettivo generale di questo metodo è impiantare scaffold contenenti cellule umane in topi per creare nicchie di midollo osseo umanizzate e successivamente osservare in tempo reale il comportamento delle cellule umane all'interno degli impianti. Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'emopoiesi umana, poiché consente di riprodurre e visualizzare in tempo reale, con risoluzione a livello di singola cellula, diversi componenti del midollo osseo. La versatilità di questo sistema rappresenta uno dei suoi principali vantaggi, in quanto permette l'impianto di diversi componenti della nicchia, singolarmente o in combinazione.

Questa metodologia potrebbe potenzialmente essere applicata ad altri settori di ricerca, come lo studio delle metastasi tumorali o lo screening di farmaci. Utilizzando un'adeguata tecnica sterile, iniziare tagliando una spugna di gelatina sterilizzata in 24 pezzi di dimensioni simili. Ricostruire gli impalcature di gelatina immergendole in etanolo e successivamente in PBS.

Quindi tamponare delicatamente ciascun impalcatura con un tessuto sterile per rimuovere il liquido in eccesso e trasferire le impalcature in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti con adesione ultra bassa. Utilizzando una siringa per insulina, iniettare con attenzione da uno per 10 alla quinta a uno per 10 alla sesta cellule stromali in 50 microlitri di mezzo di coltura in ciascuna impalcatura e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Durante l'iniezione delle cellule nell'impalcatura, accertarsi che non vi siano fuoriuscite dall'impalcatura.

Dopo un'ora, riempire ogni pozzetto con tre millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco e riposizionare le impalcature nell'incubatore. Dopo 24 ore, iniettare una volta 10 alla quinta cellule ematopoietiche all'interno delle impalcature, seguito da incubazione e ulteriore aggiunta di mezzo, e da un'ulteriore incubazione di 24 ore come appena descritto. Per la preparazione di impalcature portatrici di proteina morfogenetica ossea umana ricombinante due, posizionare le impalcature ricostituite in pozzetti singoli di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U e aggiungere cinque microlitri di proteina morfogenetica ossea umana ricombinante due a ciascuna impalcatura.

Quindi coprire le impalcature con 20 microlitri di trombina e 20 microlitri di fibrinogeno. Per l'impianto chirurgico delle impalcature ingegnerizzate, rasare innanzitutto l'area chirurgica sul dorso del topo sperimentale e utilizzare un bastoncino di cotone immerso in clorhexidina diluita per pulire la superficie cutanea esposta tre volte in ogni direzione. Successivamente, utilizzare pinze sterili e un bisturi per praticare un'incisione da anteriore a posteriore lunga da 0,5 a 0,7 centimetri nel tessuto cutaneo e inserire le pinze sotto il tessuto sottocutaneo per creare una tasca.

Inserire l'impalcatura in profondità nella tasca e chiudere l'incisione con colla chirurgica. Lasciare sviluppare le impalcature impiantate per un periodo compreso tra otto e 24 settimane prima dell'espianto. Dopo la somministrazione endovenosa di sostanze fluorescenti e l'eutanasia degli animali, sterilizzare la pelle come appena dimostrato ed effettuare un'incisione cutanea longitudinale sul dorso dell'animale, vicino al sito originale di impianto.

Separare con attenzione la pelle dalla tasca sottocutanea in cui è stato impiantato lo scaffold, quindi utilizzare pinzette per afferrare delicatamente lo scaffold e tagliare con cura la membrana residua e i tessuti circostanti per recuperare la struttura. Utilizzare una colla adesiva a rapida presa per fissare lo scaffold a una piastra di Petri da 35 per 10 millilitri. Per gli scaffold con proteina morfogenetica ossea due, prima di riempire la piastra con PBS, utilizzare un microtrapano chirurgico sotto un microscopio microchirurgico per assottigliare la superficie ossea, consentendo la visualizzazione dei fluorocromi e l'acquisizione ad alta risoluzione delle immagini.

Prestare particolare attenzione durante il processo di trapanazione poiché lo spessore dell'osso varia tipicamente tra i diversi scaffold, ed è importante non rompere la superficie. Riempire la piastra con PBS a temperatura ambiente. Per l'acquisizione di immagini mediante microscopia a due fotoni degli scaffold ingegnerizzati, posizionare lo scaffold sul piatto del microscopio confocale e selezionare l'obiettivo ad immersione in acqua 20x 1,0 NA.

Quindi, nella modalità di acquisizione del software di imaging, selezionare la casella Mostra strumenti manuali. Nel menu del laser, accendere il laser a 2 fotoni e attendere che si riscaldi e si stabilizzi. Quando il laser è pronto, nel menu di configurazione dell'imaging, attivare la modalità canale e impostare il tracciamento per ogni fotogramma.

Nel menu del percorso della luce, selezionare "non descanned" e il divisore del fascio principale MBS 760 plus. Attivare i quattro rivelatori non descanned e impostare la configurazione come illustrato nello schema. Nel menu dei canali, impostare la lunghezza d'onda del laser a 890 nanometri e la potenza al 50%. Impostare il guadagno principale tra 500 e 600, l'offset digitale a zero e il guadagno digitale a 15 per ogni canale.

In modalità di acquisizione, impostare i parametri appropriati per ottenere immagini ad alta risoluzione senza danneggiare il tessuto e senza sbiancare i fluorocromi. Successivamente, impostare lo zoom a uno per la scansione iniziale dell'immagine. Una volta impostati tutti i parametri, abbassare l'obiettivo fino a farlo toccare la soluzione salina e impostare manualmente il fuoco dell'obiettivo utilizzando una lampada come sorgente luminosa.

Ora attivare il menu Z-stack e selezionare la funzione primo-ultimo. Impostare l'intervallo richiesto tra due sezioni consecutive e selezionare live per acquisire una scansione in tempo reale del campione, regolando il guadagno digitale e l'offset digitale secondo necessità per un'esposizione ottimale. Per visualizzare più canali contemporaneamente, selezionare la funzione split.

Nel menu delle fasi, in modalità live, scansionare l'immagine e delimitare le regioni di interesse, ad esempio la posizione delle cavità ossee. Al termine della scansione del campione, spostarsi sulla prima regione di interesse e utilizzare le funzioni imposta primo e imposta ultimo in modalità live per definire il limite superiore e inferiore dello stack Z 3D che racchiude l'area di interesse. Successivamente, impostare il centro, C, e fare clic sul pulsante avvia esperimento per iniziare l'acquisizione dell'immagine a stack Z della regione di interesse.

Al termine dell'acquisizione, salvare le immagini nella cartella designata e scansionare la successiva regione di interesse. In queste immagini rappresentative, è possibile osservare la morfologia macroscopica di diversi scaffold recuperati da topi NSG immunodeficienti otto settimane dopo l'impianto. La co-seminazione con cellule endoteliali umane aumenta la vascolarizzazione dello scaffold, mentre l'aggiunta della proteina morfogenetica ossea umana ricombinante due induce la formazione ossea.

Questi scaffold, analizzati mediante microscopia a due fotoni in tempo reale, rivelano la presenza di vasi sanguigni negli scaffold e l'attecchimento a lungo termine delle cellule ematopoietiche umane nel parenchima dello scaffold. Gli scaffold seminati con cellule endoteliali umane e cellule stromali mesenchimali illustrano il coinvolgimento delle cellule endoteliali umane nella formazione di vasi all'interno dello scaffold, dando origine a una vascolarizzazione quimera murino-umana. La formazione del tessuto osseo può essere visualizzata mediante microscopia a due fotoni, così come la formazione di cavità nella vascolarizzazione umanizzata nel tessuto endosteo, che presenta una notevole somiglianza con il tessuto endosteo del midollo osseo.

Inoltre, in due impalcature portatrici di proteina morfogenetica ossea umana ricombinante, la morfologia del tessuto all'interno dell'impalcatura ricorda il midollo osseo maturo con tessuto adiposo, suggerendo che le cellule staminali mesenchimali umane contribuiscano anche alla formazione del tessuto adiposo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di tutte le impalcature bioingegnerizzate e di quelle principali nei topi. Ricordare sempre di mantenere un ambiente asettico e prestare particolare attenzione durante la manipolazione delle impalcature.

Tenere presente i limiti associati a questo metodo, come ad esempio i chimere umano-murini dei tessuti. Ricordare che dopo l'acquisizione delle immagini, i campioni possono essere utilizzati per ulteriori studi, poiché le impalcature possono essere digerite e, di conseguenza, le cellule vive possono essere recuperate da esse.