Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di impiantare scaffold di vettori di cellule umane nei topi per creare nicchie di midollo osseo umanizzate e quindi visualizzare dal vivo il comportamento delle cellule umane all'interno degli impianti. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo ematopoietico umano perché consente di riprodurre e riprodurre immagini dal vivo alla risoluzione di una singola cellula diversi componenti del midollo osseo. La versatilità di questo sistema è uno dei suoi principali vantaggi, in quanto consente l'impianto di diversi componenti di nicchia uno per uno o in combinazione.

Questa metodologia potrebbe potenzialmente essere applicata ad altri campi di ricerca, come le metastasi tumorali o gli studi di screening farmacologico. Utilizzando la tecnica sterile appropriata, inizia tagliando una spugna di gelatina sterilizzata in 24 pezzi di dimensioni simili. Ricostituire gli scaffold di gelatina per immersione in etanolo e poi in PBS.

Quindi tamponare delicatamente ogni impalcatura su un fazzoletto sterile per rimuovere il liquido in eccesso e trasferire gli scaffold in pozzetti individuali di una piastra a 24 pozzetti con attacco ultra basso. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare con cautela una volta da 10 a una da 10 a una volta da 10 a una sesta cellule stromali in 50 microlitri di terreno di coltura in ciascuna impalcatura e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Quando si iniettano le cellule nell'impalcatura, assicurarsi che non vi siano perdite dall'impalcatura.

Dopo un'ora, riempire ogni pozzetto con tre millilitri di terreno di coltura cellulare fresco e rimettere gli scaffold nell'incubatore. Dopo 24 ore, iniettare una volta da 10 alla quinta cellula ematopoietica negli scaffold, seguita dall'incubazione e dall'ulteriore aggiunta di terreno e dall'incubazione di 24 ore come appena dimostrato. Per la generazione di due scaffold di supporto della proteina morfogenetica dell'osso umano ricombinante, posizionare gli scaffold ricostituiti in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U e aggiungere cinque microlitri di proteina morfogenetica ossea umana ricombinante due a ciascun scaffold.

Quindi coprire i ponteggi con 20 microlitri di trombina e 20 microlitri di fibrinogeno. Per l'impianto chirurgico degli scaffold bioingegnerizzati, radere prima l'area chirurgica sul retro del topo sperimentale e utilizzare una punta di cotone imbevuta di clorexidina diluita per pulire la superficie cutanea esposta tre volte in ciascuna direzione. Quindi, usa una pinza sterile e un bisturi per praticare un'incisione da 0,5 a 0,7 centimetri da anteriore a posteriore nella pelle e inserisci la pinza sotto il tessuto sottocutaneo per creare una tasca.

Inserisci l'impalcatura in profondità nella tasca e chiudi l'incisione con la colla chirurgica. Lasciare che gli scaffold impiantati si sviluppino per otto-24 settimane prima dell'espianto. Dopo la somministrazione endovenosa di sostanze fluorescenti e l'eutanasia degli animali, sterilizzare la pelle come appena dimostrato ed eseguire un'incisione cutanea longitudinale sul dorso dell'animale, vicino al sito di impianto originale.

Separare con cura la pelle dalla tasca sottocutanea in cui è stata impiantata l'impalcatura, quindi utilizzare una pinzetta per afferrare delicatamente l'impalcatura e tagliare con cura la membrana residua e i tessuti che circondano l'impalcatura per recuperare la struttura. Utilizzare colla adesiva ad azione rapida per fissare l'impalcatura a una piastra di Petri da 35 x 10 millilitri. Per la proteina morfogenetica ossea due scafffold, prima di riempire la piastra con PBS, utilizzare un microtrapano chirurgico al microscopio microchirurgico per assottigliare la superficie ossea, consentendo la visualizzazione dei fluorofori e l'acquisizione ad alta risoluzione delle immagini.

Prestare particolare attenzione durante il processo di perforazione perché lo spessore dell'osso varia tipicamente tra gli scaffold ed è importante non rompere la superficie. Riempi il piatto con PBS a temperatura ambiente. Per l'imaging al microscopio a 2 fotoni degli scaffold bioingegnerizzati, posizionare lo scaffold sul tavolino del microscopio confocale e selezionare la lente a immersione in acqua 20 volte 1,0 NA.

Quindi, nella modalità di acquisizione del software di imaging, selezionare la casella Mostra strumenti manuali. Nel menu del laser, accendere il laser a 2 fotoni e lasciare che il laser si riscaldi e si stabilizzi. Quando il laser è pronto, nel menu di configurazione dell'imaging, attivare la modalità canale e cambiare traccia ogni fotogramma.

Nel menu del percorso della luce selezionare il divisore di fascio principale MBS 760 plus non descannedato. Attivare i quattro rivelatori non descanned e impostare la configurazione come illustrato nello schema. Nel menu dei canali, impostare la lunghezza d'onda del laser su 890 nanometri e la potenza su 50%Impostare il master del guadagno su 500 a 600, l'offset digitale su zero e il guadagno digitale su 15 per ciascun canale.

Nella modalità di acquisizione, impostare i parametri appropriati per ottenere immagini ad alta risoluzione senza danneggiare il tessuto e sbiancare i fluorofori. Quindi impostare lo zoom su uno per la scansione iniziale dell'immagine. Quando tutti i parametri sono stati impostati, abbassare l'obiettivo fino a toccare la soluzione salina e impostare manualmente la messa a fuoco dell'obiettivo utilizzando una lampada come sorgente luminosa.

Ora attiva il menu Z-stack e seleziona la penultima funzione. Impostare l'intervallo richiesto tra due sezioni successive e selezionare dal vivo per acquisire un'immagine dal vivo del campione, regolando il guadagno digitale e l'offset digitale secondo necessità per un'esposizione ottimale. Per visualizzare più canali contemporaneamente, selezionare la funzione split.

Nel menu stage, in modalità live, eseguire la scansione dell'immagine e contrassegnare le regioni di interesse, ad esempio la posizione delle cavità ossee. Al termine della scansione del campione, passare alla prima regione di interesse e utilizzare le funzioni Imposta prima e Imposta ultimo in modalità live per impostare la parte superiore e inferiore dello Z-stack 3D che circonda l'area di interesse. Quindi imposta il centro, C, e fai clic sul pulsante di avvio dell'esperimento per avviare l'acquisizione dell'immagine Z-stack della regione di interesse.

Al termine dell'acquisizione, salvare le immagini nella cartella designata ed eseguire la scansione della regione di interesse successiva. In queste immagini rappresentative, si può osservare la morfologia macroscopica di diversi scaffold recuperati da topi NSG immunodeficienti otto settimane dopo l'impianto. La co-semina con cellule endoteliali umane aumenta la vascolarizzazione dello scaffold, mentre l'aggiunta della proteina morfogenetica ossea umana ricombinante due induce la formazione ossea.

Questi scaffold ripresi mediante microscopia a 2 fotoni dal vivo rivelano la presenza di vasi sanguigni negli scaffold e l'attecchimento a lungo termine delle cellule ematopoietiche umane nel parenchima dello scaffold. Gli scaffold seminati con cellule stromali endoteliali e mesenchimali umane illustrano la partecipazione delle cellule endoteliali umane alla formazione di vasi all'interno dello scaffold, risultando in una vascolarizzazione chimerica murino-umana. La formazione del tessuto osseo può essere visualizzata mediante microscopia a 2 fotoni, così come la formazione di cavità nel sistema vascolare umanizzato nel tessuto endostale, che assomiglia molto al tessuto endostale del midollo osseo.

Inoltre, negli scaffold portanti della proteina morfogenetica dell'osso umano ricombinante, la morfologia del tessuto all'interno dell'impalcatura assomiglia al midollo osseo maturo con il tessuto adiposo, suggerendo che anche le cellule stromali mesenchimali umane contribuiscono alla formazione del tessuto adiposo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di tutti i bioingegneri e dei principali scaffold murini. Ricorda sempre di mantenere un ambiente ascetico e presta particolare attenzione durante la manipolazione delle impalcature.

Tenete a mente le limitazioni associate a questo metodo, come le chimere uomo-topo dei tessuti. Ricorda che dopo l'imaging, i campioni possono essere utilizzati per ulteriori studi, poiché gli scaffold possono essere digeriti e quindi le cellule vive possono essere recuperate da essi.