Induzione dell'enterocolite necrotizzante in un modello enteroide epiteliale umano

Ottenere cripte derivate dal tessuto intestinale tenue umano: invaginazioni tubulari contenenti cellule staminali e vari tipi di cellule epiteliali.

Aggiungi le cripte intestinali in una matrice seminterrato raffreddata.

Trasferire questa miscela in una piastra multipozzetto, creando una cupola tridimensionale.

Aggiungere il terreno di coltura e incubare.

Le cellule staminali si auto-organizzano, proliferano e si differenziano in più tipi di cellule intestinali, formando enterosfere.

Nel corso del tempo, le enterosfere maturano in enteroidi, strutture tridimensionali che si autorinnovano, simili alle cripte intestinali.

Aggiungere lipopolisaccaridi, o LPS, un'endotossina batterica, nel pozzetto contenente enteroidi e incubare.

Le molecole di LPS si legano al recettore toll-like nell'enteroide, avviando una risposta pro-infiammatoria, con conseguente accumulo di specie reattive dell'ossigeno. Questo innesca una cascata di eventi che portano all'apoptosi.

Di conseguenza, l'integrità dell'enteroide è compromessa, portando alla penetrazione di LPS nel lume, intensificando ulteriormente la risposta infiammatoria.

Questo imita lo sviluppo dell'enterocolite necrotizzante, una grave infiammazione nell'intestino dei neonati prematuri.

Al momento del prelievo in sala operatoria, posizionare il campione di tessuto intestinale tenue umano in DPBS freddo. Lavare il campione nel DPBS freddo fino a quando non è privo di sangue e feci.

Conservare il campione in terreno RPMI 1640 a quattro gradi Celsius fino al momento dell'isolamento della cripta. Quando si è pronti a procedere, controllare nuovamente per assicurarsi che il campione sia privo di feci e sangue. Utilizzando le forbici da dissezione delicate, rimuovere il grasso in eccesso o le clip e le graffette chirurgiche. Pesare l'esemplare e puntare a un pezzo che pesa circa 0,75-2,5 grammi.

Quindi, tagliare il tessuto in pezzi di 0,5 centimetri e metterli in una provetta contenente 30 millilitri di tampone chelante #1. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, filtrare il tessuto attraverso un colino cellulare da 100 micrometri e scartare il flusso.

Aggiungere il tessuto filtrato in una provetta contenente 30 millilitri di tampone chelante #2. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Filtrare il tessuto attraverso un filtro da 100 micrometri ed eliminare il flusso.

Successivamente, scongelare 500 microlitri di matrice della membrana basale su ghiaccio per un uso successivo. Aggiungere un po' di tessuto a 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico da 50 millilitri e agitare energicamente con le mani per 10 secondi. Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso. Mantieni questo tubo sul ghiaccio.

Aggiungere un po' di tessuto ad altri 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico separato da 50 millilitri e agitare energicamente a mano per 10 secondi. Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso.

Ripetere questo processo altre due volte fino a quando non ci sono quattro tubi conici contenenti il flusso passante etichettati da uno a quattro. Quindi, filtrare la soluzione nella provetta numero uno attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e trasferire il flusso in una provetta conica da 15 millilitri, anch'essa etichettata come numero uno. Ripetere questo processo per i tubi da due a quattro.

Centrifugare le provette da 15 millilitri a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il surnatante da ciascun tubo e gettarlo. Evita di interrompere la nuvola di tessuto immediatamente sopra il pellet, anche se ciò significa lasciare dietro di sé un po' di surnatante. In ogni provetta, pipettare lentamente su e giù per mescolare il pellet con il surnatante rimasto.

Trasferire la miscela da ogni provetta in una singola provetta conica da 2 millilitri e centrifugare a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di matrice di membrana basale pre-scongelata.

Utilizzare un puntale per pipetta refrigerato per applicare 50 microlitri di questa sospensione al centro di un pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Questo campione dovrebbe apparire a forma di cupola. Ripetere questo processo di applicazione nove volte per riempire 10 pozzetti totali.

Trasferire la piastra a 24 pozzetti in un incubatore ad anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura mini-intestinale umano completo in ogni pozzetto. Continuare l'incubazione nelle stesse condizioni, assicurandosi di sostituire questo terreno ogni due giorni.