Un test immunologico multiplex basato su microsfere per quantificare più bersagli di citochine

Prendi una piastra multipozzetto con filtri alla base.

Aggiungere un campione di prova contenente diverse citochine.

Aggiungere diversi set di microsfere differenziate per dimensione e intensità di fluorescenza interna.

Ogni set è coniugato a un anticorpo che ha come bersaglio una specifica citochina.

Incubare la piastra al buio sotto agitazione.

Gli anticorpi si legano alle loro citochine bersaglio, immobilizzandole sulle microsfere.

Applicare un vuoto per rimuovere le citochine non legate. Le citochine legate alle microsfere vengono mantenute a causa della dimensione più piccola dei pori della membrana.

Aggiungere un cocktail di anticorpi di rilevamento coniugati con biotina che si legano alle citochine legate alla microsfera.

Aggiungere una streptavidina fluorescente coniugata con reporter e incubare al buio sotto agitazione. La streptavidina si lega alla biotina, immobilizzando il reporter sul complesso di microsfere.

Rimuovere le molecole non legate e risospendere le microsfere.

Utilizzando la citometria a flusso, identificare le citochine legate determinando le dimensioni e la fluorescenza interna delle microsfere.

Per determinare la quantità di una citochina specifica, misurare l'intensità della fluorescenza del reporter.

Per eseguire il test, lasciare che tutti i reagenti si riscaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.

In questa dimostrazione vengono utilizzate piastre filtranti in polipropilene. È assolutamente essenziale che la piastra sia mantenuta in posizione verticale durante l'intera procedura di analisi, comprese le fasi di lavaggio, per evitare di perdere le perle.

Pre-bagnare la carta da filtro aggiungendo 100 microlitri di 1x tampone di lavaggio a ciascun pozzetto e lasciare riposare la piastra per 1 minuto a temperatura ambiente. Rimuovere il volume del tampone utilizzando il collettore del vuoto. Eliminare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra premendo la piastra su una pila di salviette di carta pulite. Quindi posizionare la piastra sopra il coperchio della piastra rovesciata.

Per i campioni di surnatante per colture cellulari, aggiungere 25 microlitri di tampone per il saggio a tutti i pozzetti. Aggiungere 25 microlitri di ogni standard ai pozzetti standard. Infine, aggiungere 25 microlitri di ciascun campione ai pozzetti del campione. Agitare le perle miste per 30 secondi. Quindi, aggiungere 25 microlitri di perline mescolate a ciascun pozzetto, agitando il flacone di perline a intermittenza per evitare che le perle si depositino.

Sigillare la piastra con un sigillante per piastre. Una volta sigillata, avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio. Posizionare la piastra su uno shaker, fissarla e agitare a circa 500 giri/min per due ore a temperatura ambiente. Senza invertire, posizionare la piastra sul collettore del vuoto e applicare il vuoto come prima. Quindi, aggiungere 200 microlitri di 1x tampone di lavaggio in ogni pozzetto.

Rimuovere il contenuto dei pozzetti della piastra di saggio mediante filtrazione sotto vuoto. Tamponare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra con un tampone assorbente o della carta assorbente prima di ripetere questo passaggio ancora una volta. Quindi, aggiungere 25 microlitri di anticorpi di rilevamento a ciascun pozzetto. Dopo aver sigillato la piastra con un sigillante per piastre nuovo, avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio.

Posizionare la piastra su uno shaker per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente. Senza passare l'aspirapolvere, aggiungere 25 microlitri di reagente streptavidina ficoeritrina direttamente in ciascun pozzetto. Sigillare e avvolgere il piatto come prima. Allora. posizionare la piastra su uno shaker per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver ripetuto due volte la fase di filtrazione sottovuoto, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1x a ciascun pozzetto. Risospendere le perle su uno shaker per 1 minuto. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni dalla piastra filtrante alle provette FACS per leggere i campioni su un citometro a flusso.