Name: Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dellimmunosorbente per umana dellinterferone-α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri lo sviluppo di un saggio digital ELISA a singola molecola per la rilevazione ultrasensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani. Questo metodo avanzato consente la scoperta di biomarcatori per malattie autoimmuni.

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DD e YJC riconoscere sostegno da ANR (progetto IFNX, no. CE17001002) e ImmunoQure AG per la fornitura di anticorpi monoclonali. Ringraziamo Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier per la fornitura di campioni clinici. YJC riconosce il Consiglio europeo della ricerca (GA 309449: Fellowship a YJC) e una sovvenzione di stato gestito dall'agenzia di ricerca nazionale (Francia) nell'ambito del programma "Investimenti per il futuro" recanti il riferimento ANR-10-IAHU-01.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto lo sviluppo e la convalida di una singola molecola altamente riproducibili, ultrasensibile matrice digitale ELISA per diretta quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani (passaggi riepilogati nella tabella 1). Una delle fasi più critiche nello sviluppo del saggio è la scelta di coppia anticorpo16, con le caratteristiche in termini di cinetica ed epitopo essendo chiave per un'analisi di successo. È importante evitare l'uso di anticorpi monoclonali accoppiati che target l'epitopo stesso o che causano impedimento sterico. Anticorpi policlonali potrebbero essere utilizzati come anticorpi di rilevamento per superare tali limiti. Se in un determinato passaggio la sensibilità desiderata non viene raggiunta, ulteriori possibilità di ottimizzazione dovrebbe essere considerato. Questo può includere l'uso di coppie di anticorpo alternativi, cambiamenti nei parametri quali tipo di proteine (ad es. BSA < caseina), pH (6.0-8.5), forza ionica, capacità tampone (ad esempio le concentrazioni di NaCl e fosfato), perle di vettore e/o presenza di tensioattivi. Una vasta gamma di parametri con essere ottimizzato durante lo sviluppo di un'analisi di matrice singola molecola. Tuttavia, nel complesso, le condizioni che danno rapporti di alto segnale: priorità bassa e minima LODs sono quelli preferiti (Vedi Figura 1, Figura 2e Figura 3).
Per quanto riguarda la specificità, il dosaggio di IFN-α ha mostrato alcuna reattività crociata per qualsiasi altri IFNs non testato (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) ed era in grado di rilevare tutti i 13 sottotipi di IFN-α (Figura 4b). Tuttavia, l'analisi ha mostrato una minore affinità per il sottotipo di IFN-α2, (Figura 4b e complementare tabella 4). È interessante notare che, sensibilità diverse per le diverse classi di IFN-α2 (a, b, c) inoltre sono stati osservati, che può essere dovuto le procedure di fabbricazione distinti o sequenze di aminoacidi diversi, come i sottotipi di IFN-α2 sono stati ottenuti da commerciale differente fornitori. Con la sola eccezione, tutte le specie di IFN-α ha dato risposte molto simili. La specificità del dosaggio è stata ulteriormente dimostrata dal pre-trattamento dei campioni con l'anti-IFN-α un clone, che ha abrogato il segnale (Figura 6 e complementare tabella 6).
Uno dei principali vantaggi di questa tecnologia è che qualsiasi analita di interesse può potenzialmente essere mirati16. Inoltre, diversi campioni biologici possono essere testati, come siero, plasma, liquido cerebrospinale, lisati cellulari, cultura surnatanti31 e respiro anche32. Di solito, una diluizione di 1:3 di plasma viene eseguita per evitare potenziali intasamento dell'analizzatore matrice singola molecola. Tuttavia, l'analita di interesse potrebbe essere presente a concentrazioni molto basse nel campione biologico rilevante e le più alte concentrazioni del campione potrebbero essere necessario (a seconda della sensibilità del test)33. Anche se c'è potenziale per multiplexing pur mantenendo buona sensibilità34, è un processo più impegnativo e saggi per la misurazione maggiore di 6 proteine entro gli stessi esperimenti hanno ancora essere sviluppato35.
La capacità di rilevare e quantificare citochine e altre proteine biologiche pertinenti a tali concentrazioni basse si apre tutta una nuova serie di applicazioni33,36. È noto che numerose proteine esercitano i loro effetti anche a concentrazioni molto basse, che fino ad ora erano inferiori al limite di rilevazione delle migliori ELISAs37. Mentre altre tecnologie di immunoassay offrono vantaggi rispetto ai convenzionali ELISA19, dimostriamo qui che la singola molecola matrice digitale ELISA è una piattaforma robusta e riproducibile per la rilevazione ultrasensibile di bassa concentrazione di citochine in campioni umani. Come tale, questa tecnologia offre un enorme potenziale per la scoperta del biomarcatore e una migliore gestione del paziente di una vasta gamma di malattie.

Tipo I IFNs sono una famiglia di citochine che svolgono un ruolo centrale nell'orchestrare la risposta immunitaria antivirale. Essi sono stati scoperti da Isaacs e Lindenmann 60 anni fa1,2 e ora è conosciuto che questa famiglia eterogenea di polipeptidi comprende 14 diverse sottoclassi (13 sottotipi di IFN-α e IFN-1 beta). Tipo I IFNs sono essenziali per la liquidazione delle infezioni virali, ma inoltre sono stati implicati nella patologia di una varietà di Stati di malattia umana, compreso i disordini autoimmuni lupus eritematoso sistemico (Les), dermatomyositis giovanile (JDM), e il tipo Ho interferonopathies in quale tipo costitutivo ho indotta da IFN segnalazione provoca patologia3,4,5,6,7.
Studiare proteine IFN di tipo I livelli nei campioni biologici è stato impegnativo dal suo iniziale identificazione come una "sostanza di interferire"1,2. Attualmente, sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) è il metodo più utilizzato per il rilevamento della proteina di IFN-α. Pur essendo specifico, semplice e rapida, tipo I presenti limitazioni importanti IFN ELISAs, quali sensibilità limitata. Inoltre, la misurazione di tutti i sottotipi di IFN-α richiede l'uso di saggi multipli ogni con la propria sensibilità e capacità di rilevamento. Mentre ci sono ELISAs commerciale che rilevano diversi sottotipi di IFN-α, la loro sensibilità è limitata (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL e 12,5 pg/mL, rispettivamente) che spesso non è sufficiente per rilevare la proteina di IFN-α in campioni biologici. Per ovviare a questa limitazione, proxy biologici diversi saggi sono stati sviluppati per quantificare tipo I IFN misurando l'espressione genica indotta o attività funzionale8,9,10,11, 12 , 13 , 14. ciò nonostante, questi test non forniscono una misura diretta della proteina IFN-α.
In questo studio, tecnologia di singola molecola matrice digitale ELISA è stata utilizzata per sviluppare un test per l'identificazione delle singole molecole di proteina di IFN-α. ELISA digitale utilizza la stessa chimica di base come ELISA convenzionale, tuttavia, la reazione avviene nelle matrici composto da 50.000 individuale 46 femtoliter dimensioni pozzi15,16. Singole molecole proteiche sono catturati dai branelli paramagnetiche rivestite con anticorpo ed etichettati con un anticorpo di rilevazione biotinilato, seguito dall'associazione di un coniugato enzimatico, streptavidina-β-galattosidasi (SBG). Successivamente, le perle sono sospesi con un enzima-substrato fluorogenic, Resorufina-β-D-galattopiranoside (RGP), in matrici di singola molecola. Diminuendo il volume reazione 2 miliardi di volte17, un'alta concentrazione locale di segnale fluorescente è raggiunto e conteggi di singola molecola diventati fattibili, come ogni molecola genera un segnale che ora può essere attendibilmente misurato18. In sostanza singola molecola matrici sono in grado di conteggio singoli immunocomplessi e determinare un numero medio di enzimi al tallone (AEB). Contando i micropozzetti in cui viene rilevato un segnale permette la quantificazione/digitalizzazione delle molecole proteiche, come c'è una correlazione diretta tra la concentrazione nella proteina e il rapporto tra immunocomplexed-perline e un numero totale di perline presenti nel Le camere di dimensioni femtoliter.
Yeung et al. effettuato uno studio di vasta valutazione multi-piattaforma utilizzando nove diverse tecnologie e quattro test immunologici di citochina con l'obiettivo di comparare dosaggio precisione, sensibilità e correlazione dei dati tra le diverse piattaforme19. Uno dei risultati chiavi dello studio era che matrici di singola molecola e singola molecola contando immunoassay ha presentato la più alta sensibilità per il rilevamento delle citochine nel siero umano all'interno della gamma di concentrazione di sub-pg/mL. I dosaggi di singola molecola matrice digitali ELISA citochina sono stati usati per studiare il ruolo di TNF-α e IL-6 in Crohn malattia20, IFN-α in interferonopathy e auto-immuni pazienti 7, e le diverse modificate traduzionalmente forme di C-X-C Motif chemokine 10 (CXCL10) nell'epatite cronica e donatori in buona salute che ricevono sitagliptin21,22. Altre applicazioni includono la misura della rodopsina in pazienti con retinopatia diabetica23; lo studio delle patologie cerebrali attraverso misure di siero/plasma del neurofilamento luce24 e β-amiloide 1-42 peptide25, nel contesto della sclerosi multipla e morbo di Alzheimer, rispettivamente. Saggi di matrice singola molecola possono essere utilizzati anche per il rilevamento del patogeno migliorata come caratterizzazione del serbatoio virale HIV26e anche per la rilevazione di DNA27 e micro RNAs28. Dei principali vantaggi della tecnologia matrice singola molecola è questa elevata versatilità, in quanto un'analisi contro qualsiasi analita di interesse può essere sviluppata se una coppia di anticorpo specifico è disponibile. Inoltre, i corredi di analisi homebrew sono commercialmente disponibili, permettendo lo sviluppo di nuovi test, il protocollo di cui è dettagliato in una forma modificata qui sotto.
Qui, una descrizione dettagliata dei passaggi lo sviluppo e la convalida per un dosaggio di matrice singola molecola è presentata che risulta in una maggiore sensibilità per il rilevamento di proteine IFN-α. Anticorpi per singola molecola matrice analisi dovrebbero essere altamente specifici, evitando la cross-reattività con le proteine correlate (con specificità di specie considerate se pertinenti). Idealmente, dovrebbero essere scelti gli anticorpi con KD inferiore a 10-9 M; alta affinità assicura forte legame, con la produzione di un segnale più alto. La cinetica del legame dell'anticorpo-antigene sono anche importanti e veloce Ksu e lento Koff favorirà assiemi complessi antigene-anticorpo. A partire con un paio di anticorpo che ha una buona prestazione in ELISA classica, con un limite di rilevabilità (LOD) di 1-100 pg/mL, aumenta le possibilità di ottenere un'analisi di matrice singola molecola altamente sensibili. Chang e colleghi effettuati dettagliati studi cinetici delle interazioni biomolecolari che accade ad ogni singolo passo, proponendo una serie di equazioni per predire la sensibilità analitica18. Hanno mostrato tale matrice di singola molecola ELISA digitale sembra essere efficace all'interno di una vasta gamma di affinità dell'anticorpo (KD ~ 1011 - 10− 9 M), come pure quella generazione di segnale dipende più il tasso di anticorpi.
Per utilizzare ad alta affinità anticorpi che abbiamo approfittato degli anticorpi isolati da pazienti con la sindrome di poliendocrinopatia autoimmune tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED)29. Per ragioni che non sono ancora chiari, la grande maggioranza degli individui AIRE-carenti sviluppa un set di base di alta-avidità degli anticorpi contro tutti i sottotipi di IFN-α29, e abbiamo selezionato due cloni di anticorpo anti-IFN-α di affinità obbligatorie complementari per i diversi sottotipi di IFN-α, come valutato dai valori di IC50 . La combinazione di questi anticorpi ad alta affinità unici con la tecnologia array di singola molecola ha permesso la quantificazione diretta di IFN-α a concentrazioni di attomolar (fg/mL). Tale rilevazione di proteine IFN-α ultrasensibile contribuirà ad una migliore comprensione della natura, regolamento e impatto biologico della risposta indotta da IFN in impostazioni differenti di malattia.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo A (clone 8H1)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Non disponibile in commercio</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo B (clone 12H5)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Non disponibile in commercio</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo EBI-1 clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo BMS216BK clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Non un kit ELISA ma abs sfusi</td></tr><tr><td>IFN e alfa; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &alfa; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 2a</td><td>PeproTech</td><td>Non più disponibile</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN & beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN & gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Fu-GENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Saggio reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Sostituto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non più disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Provette per micocentrifuga Amicon - Filtri da 0,5 mL</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per coniugazione a perline</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Non può essere ordinato separatamente</td></tr><tr><td>Non codificato Perline paramagnetiche</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per il lavaggio delle perline</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Non ordinabile separatamente</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante per perline</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Non ordinabile separatamente</td></tr><tr><td>Tampone diluente per perline</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detector e campione Diluente</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di reazione di biotinilazione</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Non ordinabile separatamente</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per provette per microcentrifuga da 1,7 ml (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice da laboratorio standard (MS2 Minishaker)</td><td>Pipette IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 e 1000 &mu; l)</td><td>Suggerimenti Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 e 1000 &mu; l)</td><td>Provette</td> per microcentrifuga Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>da 1,7 ml,</td><td>separatore magnetico Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per provette da microcentrifuga da 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuga da banco (Galaxy MinisStar)</td><td>Miscelatore</td>/agitatore VWR <td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>(Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Reagenti Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Molecule Array (Simoa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, etichette con codici a barre per microsfere e rivelatori</td><td>Quanterix</td><td>101652</td> flaconi di reagenti Quanterix 102411 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastre per campioni Simoa a 96 pozzetti</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>dischi Simoa</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Punte conduttive Simoa 2.0</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette Simoa</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Simoa SBG</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Simoa RGP</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Olio sigillante</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore Simoa HD-1</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Array di molecole singole (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conteggio di singole molecole Sistemi di immunodosaggio Erenna</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

L'obiettivo principale di questo protocollo è di descrivere lo sviluppo e la convalida di un interferone (IFN)-saggio α singola molecola matrice digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Questo sistema consente la quantificazione della proteina umana di IFN-α con sensibilità senza precedenti e con nessuna reattività crociata per altre specie di IFN.
Il primo passo fondamentale del protocollo è la scelta della coppia di anticorpo, seguita dalla coniugazione dell'anticorpo di cattura a paramagnetici perline e biotinylation l'anticorpo di rilevazione. A seguito di questo passaggio, diversi parametri quali la configurazione di test, concentrazione di anticorpi del rivelatore e la composizione di buffer possono essere modificati finché sensibilità ottimale è raggiunto. Infine, specificità e riproducibilità del metodo sono valutati per garantire la fiducia nei risultati. Qui, abbiamo sviluppato un test di matrice singola molecola di IFN-α con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL utilizzando ad alta affinità autoanticorpi isolati da pazienti con mutazioni bialleliche nella proteina del regolatore autoimmune (AIRE) causando poliendocrinopatia autoimmune sindrome tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED). D'importanza, questi anticorpi abilitato il rilevamento di tutti i 13 sottotipi di IFN-α.
Questa nuova metodologia permette la rilevazione e la quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani alle concentrazioni di attomolar per la prima volta. Tale strumento sarà molto utile nel monitorare i livelli di questa citochina nella salute umana e Stati di malattia, la maggior parte in particolare infezione, autoimmunità e autoinflammation.

In sintesi, un'analisi della matrice pan-IFN-α singola molecola con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL, utilizzando una configurazione di 2-step con cattura perline rivestite con 0,3 mg/mL di anti-IFN-α un anticorpo e anti-IFN-α B rilevazione dell'anticorpo biotinilato ad un rapporto di biotina: anticorpo di 30 è stato sviluppato. Le concentrazioni utilizzate per l'anticorpo di rilevazione biotinilato e SBG erano 0,3 µ g/mL e 150 pM, rispettivamente. Questo test altamente specifico è in grado di rilevare tutti i sottotipi di IFN-α 13 e non reazione crociata con altri tipi di IFN. Così, anche se non è possibile identificare e quantificare ogni singola specie di IFN-α, tutti possono essere rilevati e misurati insieme dando un valore di concentrazione totale per IFN-α, che comprende 13 diverse sottoclassi.
Per esplorare il potenziale valore diagnostico di questa analisi di recente sviluppato, IFN-α proteina in plasma e siero da individui sani erano misurati e confrontati con campioni provenienti da pazienti affetti da SLE e JDM. Come illustrato nella Figura 7, alti livelli di IFN-α proteina sono stati rilevati nelle due coorti di malattia rispetto ai controlli sani. La linea tratteggiata indica il livello di dettaglio di una convenzionale ELISA disponibile in commercio, che illustra come questo approccio potrebbe non rilevare la proteina di IFN-α in questi gruppi di pazienti nonostante le associazioni note di questa citochina con questi fenotipi. Inoltre, IFN-α può essere quantificata sopra 5 registri di grandezza, che illustra l'ampia gamma dinamica del dosaggio, con livelli rilevabili tra 1-10. fg/mL, confermando la natura altamente sensibile del dosaggio.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: quantificazione della proteina di IFN-α in plasma e siero dalle coorti di pazienti. Questa figura è stata modificata da Rodero et al. 2017. plasma da controlli sani (n = 20) e pazienti affetti da SLE (n = 72) e JDM (n = 43) sono stati testati con il test di matrice singola molecola pan-IFNα. Analisi è stata eseguita utilizzando il test ANOVA unidirezionale (Kruskal-Wallis) e di Dunn più confronto test tra gruppi. Mediana è raffigurato. Linea tratteggiata indica LOD di una riferimento umano anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Considerazioni</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. scelta di coppia anticorpo</td>
			<td>Epitopi diversi target</td>
			<td rowspan="3">Tabella 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta affinità</td>
		</tr>
<tr>
<td>Veloce Ksu / lento Kfuori
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientamento di coppia anticorpo</td>
			<td rowspan="3">Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. acquisire la concentrazione di anticorpi</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. rapporto di anticorpo biotina: rivelatore</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-passo configurazione</td>
			<td>Scegli la condizione con il più alto rapporto di segnale: sfondo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentrazione di anticorpi rivelatore</td>
			<td rowspan="2">Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentrazione di SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificità</td>
			<td>Valutare la reattività crociata</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilità</td>
			<td>Valutare il riconoscimento dei sottotipi (se applicabile)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. riproducibilità</td>
			<td>Valutare la variabilità di analisi</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: riepilogo dei passaggi per lo sviluppo e l'ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola. Questa tabella riassume i diversi passaggi necessari per lo sviluppo e l'ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola, dalla scelta iniziale di coppia anticorpo fino alla valutazione della riproducibilità.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigene</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2,99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3,03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28,65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12,87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: selezione dell'anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinato utilizzando l'elemento di risposta dell'interferone-stimolata (ISRE)-analisi di Luciferase neutralizzazione. Tabella mostra i valori di IC50 di mAbs utilizzato nell'analisi di singola molecola matrice per tutti i sottotipi di IFN-α. 10.000 cellule HEK 293 MSR sono state seminate in piastre da 96 pozzetti metà-zona bianche e reverse-transfected con 50 ng premiscelato ISRE-Firefly luciferase reporter e costrutti di luciferasi Renilla utilizzando reagenti di transfezione secondo le istruzioni del produttore. Il costrutto che esprimono luciferasi servito come un controllo di normalizzazione interna. Le cellule sono state incubate durante la notte nel ridotto del siero supplementato con aminoacidi non essenziali di 0,1 mM, piruvato di sodio di 1 mM, 0,5% di siero bovino fetale a 37 ° C, 5% CO2 in atmosfera umidificata. Dopo una notte di incubazione, le cellule sono state stimolate per 24 h con medie contenenti miscele di IFN-α ricombinante umano con o senza anticorpi monoclonali anti-IFN-α o controllo IgG che erano stati preincubati per 1h a 37 ° C. Dopo 24 h di stimolazione, dual luciferasi reporter analisi sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. «-» Non determinato. Sifalimumab è un pienamente umana, immunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonale che si lega a e neutralizza la maggior parte dei sottotipi di IFN-α; Rontalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato contro IFN-α. Adattato da Meyer et al 2016 e Rodero et al. 2017.
Complementare tabella 1: selezione dell'orientamento dell'anticorpo, catturare concentrazione di anticorpi perline e rapporto di biotinilazione. Le due possibili configurazioni differenti sono state provate, usando la A anti-IFN-α come anticorpo di cattura e anti-IFN-α B come rilevazione dell'anticorpo (A) e vice versa (B). IFNα - 2C è stato usato come antigene. Le concentrazioni nell'anticorpo di cattura differenti così come i rapporti di biotina: anticorpo (B:A) inoltre sono stati provati per entrambe le configurazioni. Saturazione (sab). Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 2: Test di configurazione 3-passaggio 2 vs. Le configurazioni di passaggio 2 e 3 - sono state valutate usando IFNα - 2C come antigene. AEB valori anche come segnale/rumore (S/B) di razioni sono indicati per entrambe le condizioni. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 3: ottimizzazione di concentrazione di rivelatore e SBG. Tre differenti concentrazioni di anticorpo biotinilato di rivelatore (0,1 e 0,3 0,6 µ g/mL) insieme a tre diverse concentrazioni di SBG (50, 150 e 250 pM) sono stati valutati. AEB valori sono indicati per le nove condizioni testate. Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 4: specificità e sensibilità del dosaggio di matrice di singola molecola IFNα ottimizzato. Enzima medio per valori di perline sono mostrati quando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω e IFN-γ proteine ricombinanti sono stati testati (A), insieme con i 16 sottotipi di IFN-α (B). «-» Non determinato. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 5: riproducibilità ottimizzata IFNα singola molecola matrice. I valori medi di AEB per tutte le tre esecuzioni indipendenti sono mostrati fino alla concentrazione di 10.000 fg/mL. «-» Non determinato. Saturazione (sab). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 6: analisi della proteina di concorrenza. Enzima medio per perline valori sono indicati per tutte le condizioni testate. Misure sono state fatte in duplice copia. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla natura, la regolazione e l'impatto biologico delle risposte indotte dall'interferone in diversi contesti di malattia, tra cui l'autoimmunità e l'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua sensibilità presieduta. Questa tecnica ha un grande potenziale per la scoperta di biomarcatori per migliorare la gestione dei pazienti in molte malattie, in quanto può quantificare le citochine con una sensibilità senza precedenti.Un passo importante con questo approccio è stato quello di neutralizzare le attività correlate ai pazienti con sistema poliindocrino autoimmune di tipo uno. Per iniziare, caricare 280 milioni di perline paramagnetiche in un tubo di microfuga, prendendo nota del volume. Quindi, centrifugare le perle a impulsi e mettere il tubo su un separatore magnetico per un minuto.Rimuovere ed eliminare la soluzione diluente isolando così le perle. Successivamente, lavare le perline con BWB due volte e BCB due volte. Per ogni lavaggio, aggiungere 200 microlitri e agitare il tubo per cinque secondi.Quindi separare le perle dalla soluzione utilizzando il separatore magnetico. Dopo un minuto di separazione, scartare il diluente. Quindi, aggiungere 190 microlitri di BCB per volume di perline.Quindi agitare brevemente il tubo, far girare il tubo a impulsi e mettere le perle lavate sul ghiaccio. Per attivare le perle, unire un millilitro di BCB freddo con 10 milligrammi di EDC e agitare fino a ottenere una soluzione omogenea. Lavora in modo rapido e sicuro quando usi l'EDC, grazie alla sua instabilità intrinseca e alla soluzione equina.Quindi aggiungere 10 microlitri di EDC freddo e diluito per volume di perlina alla sospensione del perlo e agitare brevemente le perle. Quindi, metti le perline su uno shaker a temperatura ambiente per 30 minuti. Per coniugare gli anticorpi alle perle, prima vortex e puls fanno girare le perle attivate.Quindi mettere le perle in un separatore magnetico per un minuto e scartare il surnatante BCB. Quindi, rimuovi il tubo dal magnete e lava le perline due volte con 200 microlitri di BCB. Quindi vortice, pulsare e separare magneticamente le perle per rimuovere il tampone.Quindi, aggiungere rapidamente 200 microlitri di anticorpo freddo a scambio tampone alle perle attivate. Dopo aver fatto vorticare le perle in soluzione, mettere la sospensione sull'agitatore a temperatura ambiente per due ore a 1.000 giri/min. Iniziare con la sospensione del cordone rivestita di anticorpo una rotazione dell'impulso, quindi utilizzare la colonna magnetica per rimuovere il tampone.Quindi, controlla la concentrazione della proteina nel tampone. Utilizzare uno spettrofotometro a basso volume. A questo punto, gli anticorpi sono accoppiati alle perle e qualsiasi valore superiore a zero significa che le perle sono sature di anticorpi.Ora, lava le perle con 200 microlitri di BWB, come eseguito in tutti i lavaggi precedenti. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta e controllare la concentrazione proteica. La quantificazione delle proteine rilasciate dalle microsfere consente di misurare l'accoppiamento degli anticorpi.Quindi, lavare nuovamente le perline con 200 microlitri di BWB. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone blocca-microsfere, agitare il tubo per cinque secondi e trasferirlo nell'agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo 30 minuti le perline saranno bloccate.Quindi, lavali una volta usando 200 microlitri di BWB, quindi lavali due volte con 200 microlitri di tampone diluente per perline per ogni lavaggio. Quindi, conservare le perle rivestite e bloccate in 200 microlitri di tampone diluente per perle a quattro gradi Celsius. Questa sezione del video suggerisce strategie su come modificare le condizioni del saggio utilizzando il software dell'analizzatore a matrice di molecole singole nella configurazione home brew.Inizia con il test di diverse combinazioni di anticorpi di cattura, perle coniugate e anticorpi di rilevamento della biotinilazione in entrambe le combinazioni di anticorpi. Successivamente, testare le combinazioni delle tre diverse concentrazioni di anticorpi di cattura con due diversi rapporti di biotinilazione per il rilevamento e la cattura degli anticorpi e viceversa. Quindi scegli la combinazione che offre il livello di rilevamento più basso e usala per i passaggi successivi.In questo caso, un rapporto di 30 a uno tra biotina e anticorpo fornisce il miglior limite di rilevamento. Quindi, confrontare una configurazione in due passaggi con una configurazione in tre passaggi. Le configurazioni a tre fasi hanno tre diverse fasi di incubazione.Uno con l'anticorpo di cattura, uno con l'anticorpo di rilevamento e un ultimo, il terzo, per la marcatura dell'enzima SBG. Le configurazioni in due fasi combinano l'incubazione di cattura e di rilevamento. Eseguire l'analizzatore a matrice di singole molecole utilizzando le concentrazioni e le razioni di anticorpi di cattura e rivelatore selezionate nelle configurazioni a due e tre fasi, preconfigurate nell'analizzatore, seguendo le istruzioni del produttore.Quindi scegli la configurazione che consente la massima sensibilità e mantienila per i passaggi futuri. In questo caso, la configurazione a due fasi offre una sensibilità leggermente superiore in ogni punto di prova. Successivamente, ottimizzare le concentrazioni dell'anticorpo del rivelatore e dell'SBG.Testare tre diverse concentrazioni di anticorpi rivelatori con tre diverse concentrazioni di SBG. Scegli le concentrazioni che danno la massima sensibilità e mantienile per i passaggi futuri. In questo caso, 0,3 microgrammi per millilitro di anticorpo e 150 pica molare SBG hanno il livello ottimale di rilevamento con bassi livelli di fondo con ampiezza media fortuita.Per ulteriori passaggi di ottimizzazione, consultare il protocollo di testo. Sono previste procedure per ottimizzare la specificità e la riproducibilità del saggio e un test per la competizione proteica. Utilizzando un test ottimizzato per rilevare 13 sottoclassi di interferone-alfa, il plasma e il siero sono stati analizzati in pazienti con LES, pazienti con JDM e controlli sani.Alti livelli di interferone-alfa sono stati rilevati in entrambe le coorti di malattia. La linea tratteggiata indica il livello di rilevazione di un Eliza convenzionale, disponibile in commercio, che non rileverebbe la proteina interferone-alfa in questi gruppi di pazienti, nonostante il ruolo noto di questa citochina in queste malattie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare e convalidare un saggio di array di singole molecole per l'analisi che preferisci.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che durante la scelta cellulare degli anticorpi è. Sin dal suo sviluppo, questo test ha permesso una migliore caratterizzazione del ruolo dell'interferone-alfa in una varietà di malattie e infezioni autoimmuni. Questo test è servito anche a monitorare le risposte a nuove terapie e a identificare gli attori cellulari responsabili di alcune malattie autoimmuni.

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