Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla natura, la regolazione e l'impatto biologico delle risposte indotte dall'interferone in diversi contesti di malattia, tra cui l'autoimmunità e l'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua sensibilità presieduta. Questa tecnica ha un grande potenziale per la scoperta di biomarcatori per migliorare la gestione dei pazienti in molte malattie, in quanto può quantificare le citochine con una sensibilità senza precedenti.

Un passo importante con questo approccio è stato quello di neutralizzare le attività correlate ai pazienti con sistema poliindocrino autoimmune di tipo uno. Per iniziare, caricare 280 milioni di perline paramagnetiche in un tubo di microfuga, prendendo nota del volume. Quindi, centrifugare le perle a impulsi e mettere il tubo su un separatore magnetico per un minuto.

Rimuovere ed eliminare la soluzione diluente isolando così le perle. Successivamente, lavare le perline con BWB due volte e BCB due volte. Per ogni lavaggio, aggiungere 200 microlitri e agitare il tubo per cinque secondi.

Quindi separare le perle dalla soluzione utilizzando il separatore magnetico. Dopo un minuto di separazione, scartare il diluente. Quindi, aggiungere 190 microlitri di BCB per volume di perline.

Quindi agitare brevemente il tubo, far girare il tubo a impulsi e mettere le perle lavate sul ghiaccio. Per attivare le perle, unire un millilitro di BCB freddo con 10 milligrammi di EDC e agitare fino a ottenere una soluzione omogenea. Lavora in modo rapido e sicuro quando usi l'EDC, grazie alla sua instabilità intrinseca e alla soluzione equina.

Quindi aggiungere 10 microlitri di EDC freddo e diluito per volume di perlina alla sospensione del perlo e agitare brevemente le perle. Quindi, metti le perline su uno shaker a temperatura ambiente per 30 minuti. Per coniugare gli anticorpi alle perle, prima vortex e puls fanno girare le perle attivate.

Quindi mettere le perle in un separatore magnetico per un minuto e scartare il surnatante BCB. Quindi, rimuovi il tubo dal magnete e lava le perline due volte con 200 microlitri di BCB. Quindi vortice, pulsare e separare magneticamente le perle per rimuovere il tampone.

Quindi, aggiungere rapidamente 200 microlitri di anticorpo freddo a scambio tampone alle perle attivate. Dopo aver fatto vorticare le perle in soluzione, mettere la sospensione sull'agitatore a temperatura ambiente per due ore a 1.000 giri/min. Iniziare con la sospensione del cordone rivestita di anticorpo una rotazione dell'impulso, quindi utilizzare la colonna magnetica per rimuovere il tampone.

Quindi, controlla la concentrazione della proteina nel tampone. Utilizzare uno spettrofotometro a basso volume. A questo punto, gli anticorpi sono accoppiati alle perle e qualsiasi valore superiore a zero significa che le perle sono sature di anticorpi.

Ora, lava le perle con 200 microlitri di BWB, come eseguito in tutti i lavaggi precedenti. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta e controllare la concentrazione proteica. La quantificazione delle proteine rilasciate dalle microsfere consente di misurare l'accoppiamento degli anticorpi.

Quindi, lavare nuovamente le perline con 200 microlitri di BWB. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone blocca-microsfere, agitare il tubo per cinque secondi e trasferirlo nell'agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo 30 minuti le perline saranno bloccate.

Quindi, lavali una volta usando 200 microlitri di BWB, quindi lavali due volte con 200 microlitri di tampone diluente per perline per ogni lavaggio. Quindi, conservare le perle rivestite e bloccate in 200 microlitri di tampone diluente per perle a quattro gradi Celsius. Questa sezione del video suggerisce strategie su come modificare le condizioni del saggio utilizzando il software dell'analizzatore a matrice di molecole singole nella configurazione home brew.

Inizia con il test di diverse combinazioni di anticorpi di cattura, perle coniugate e anticorpi di rilevamento della biotinilazione in entrambe le combinazioni di anticorpi. Successivamente, testare le combinazioni delle tre diverse concentrazioni di anticorpi di cattura con due diversi rapporti di biotinilazione per il rilevamento e la cattura degli anticorpi e viceversa. Quindi scegli la combinazione che offre il livello di rilevamento più basso e usala per i passaggi successivi.

In questo caso, un rapporto di 30 a uno tra biotina e anticorpo fornisce il miglior limite di rilevamento. Quindi, confrontare una configurazione in due passaggi con una configurazione in tre passaggi. Le configurazioni a tre fasi hanno tre diverse fasi di incubazione.

Uno con l'anticorpo di cattura, uno con l'anticorpo di rilevamento e un ultimo, il terzo, per la marcatura dell'enzima SBG. Le configurazioni in due fasi combinano l'incubazione di cattura e di rilevamento. Eseguire l'analizzatore a matrice di singole molecole utilizzando le concentrazioni e le razioni di anticorpi di cattura e rivelatore selezionate nelle configurazioni a due e tre fasi, preconfigurate nell'analizzatore, seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi scegli la configurazione che consente la massima sensibilità e mantienila per i passaggi futuri. In questo caso, la configurazione a due fasi offre una sensibilità leggermente superiore in ogni punto di prova. Successivamente, ottimizzare le concentrazioni dell'anticorpo del rivelatore e dell'SBG.

Testare tre diverse concentrazioni di anticorpi rivelatori con tre diverse concentrazioni di SBG. Scegli le concentrazioni che danno la massima sensibilità e mantienile per i passaggi futuri. In questo caso, 0,3 microgrammi per millilitro di anticorpo e 150 pica molare SBG hanno il livello ottimale di rilevamento con bassi livelli di fondo con ampiezza media fortuita.

Per ulteriori passaggi di ottimizzazione, consultare il protocollo di testo. Sono previste procedure per ottimizzare la specificità e la riproducibilità del saggio e un test per la competizione proteica. Utilizzando un test ottimizzato per rilevare 13 sottoclassi di interferone-alfa, il plasma e il siero sono stati analizzati in pazienti con LES, pazienti con JDM e controlli sani.

Alti livelli di interferone-alfa sono stati rilevati in entrambe le coorti di malattia. La linea tratteggiata indica il livello di rilevazione di un Eliza convenzionale, disponibile in commercio, che non rileverebbe la proteina interferone-alfa in questi gruppi di pazienti, nonostante il ruolo noto di questa citochina in queste malattie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare e convalidare un saggio di array di singole molecole per l'analisi che preferisci.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che durante la scelta cellulare degli anticorpi è. Sin dal suo sviluppo, questo test ha permesso una migliore caratterizzazione del ruolo dell'interferone-alfa in una varietà di malattie e infezioni autoimmuni. Questo test è servito anche a monitorare le risposte a nuove terapie e a identificare gli attori cellulari responsabili di alcune malattie autoimmuni.