Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

L'obiettivo generale del seguente esperimento è convertire un test Eliza pre-ottimizzato per la citochina TNF Alpha sulla piattaforma Xap, valutando al contempo coppie di anticorpi alternativi. Ciò si ottiene accoppiando l'anticorpo di cattura del kit ELIZA, insieme ad altri tre anticorpi di cattura candidati, a quattro diversi set di microsfere o microsfere quando miscelati insieme. Questi quattro set consentono il test simultaneo di tutti e quattro i candidati con quattro anticorpi di rilevamento separati per determinare la migliore coppia di anticorpi.

I due saggi Xap successivi sono costruiti con le due coppie di anticorpi più ottimali. Le prestazioni dei saggi vengono quindi confrontate con quelle del test EISA originale per quanto riguarda la potenza del segnale, la gamma dinamica e la sensibilità. I risultati mostrano che anticorpi simili possono funzionare in modo molto diverso nelle stesse condizioni e che diversi anticorpi possono essere sottoposti a screening simultaneo utilizzando il test Luminex Xap, rivelando che il test ha una maggiore sensibilità e gamma dinamica rispetto all'EISA.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'EIS A è che i saggi immunologici basati su xap consentono al ricercatore di testare più bersagli o, come in questo caso, di testare più anticorpi contemporaneamente. Identificare il miglior anticorpo dimostrato. La procedura sarà Erica Lopez, scienziata associata presso Luminex Corporation.

Iniziare questo protocollo con la selezione e la preparazione di quattro anticorpi di cattura e quattro anticorpi di rilevamento specifici per il TNF alfa umano, come descritto nel protocollo scritto. Inoltre, preparare un anticorpo di conferma specifico per la specie ospite degli anticorpi di cattura. Portare i reagenti nel kit di accoppiamento anticorpale a temperatura ambiente.

Etichettare quattro provette di reazione con i numeri della regione del cordone selezionati per la reazione di accoppiamento. Trasferire il contenuto delle quattro fiale di microsfere a plesso magnetico nelle quattro provette di reazione marcate. Lavare due volte ciascuno dei set di microsfere in 500 microlitri di tampone di attivazione e attivare ogni set di microsfere con le soluzioni sulf ONHS e EDC come descritto nel kit di accoppiamento degli anticorpi.

Dopo un'incubazione di 20 minuti su un rotatore, ripetere la fase di lavaggio precedente con le perle ora attivate per un totale di tre volte con 500 microlitri di tampone di attivazione. Per ogni lavaggio, preparare quattro soluzioni separate da 500 microlitri. Ciascuno contiene 7,5 microgrammi di tampone di inattivazione degli anticorpi di cattura.

Aggiungere queste quattro soluzioni di anticorpi di cattura ai rispettivi tubi di reazione. Agitare immediatamente ogni provetta e incubare per due ore su un rotatore. Ripetere la fase di lavaggio con le perle ora accoppiate per un totale di tre volte con 500 microlitri del tampone di lavaggio incluso nel kit di accoppiamento degli anticorpi.

Dopo l'ultima fase di lavaggio, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio a ciascuna provetta di reazione per fornire una concentrazione finale di 5 milioni di perle accoppiate ad anticorpi per millilitro di vortice, quindi sonicare le provette di reazione per disperdere le perle. Contare il numero di perle recuperate dopo la reazione di accoppiamento utilizzando un contatore di cellule o un emocitometro. Il recupero dalla reazione di accoppiamento è in genere superiore al 90%Confermare che la reazione di accoppiamento ha avuto successo preparando soluzioni di prova delle perle accoppiate per ogni set con una concentrazione finale di 100 perle per microlitro nel tampone di saggio, preparare la diluizione delle specie antis etichettate con FICO erything.

Anticorpo di conferma IgG a quattro microgrammi per millilitro nel tampone di analisi aliquotare 50 microlitri di ciascuna soluzione di prova in quattro pozzetti di una piastra da 96 pozzetti a fondo tondo per un totale di 16 pozzetti. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di analisi in otto dei pozzetti per misurare il fondo e 50 microlitri di anticorpo di conferma diluito negli otto pozzetti rimanenti. Miscelare delicatamente le reazioni pipettando su e giù più volte con un pipettatore multicanale.

Coprire la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker per piastre. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per uno o due minuti per estrarre le perle dalla soluzione. Quindi rimuovere il liquido capovolgendo con forza la piastra mentre si trova sul separatore sopra un contenitore di scarico.

Lavare ogni pozzetto due volte aggiungendo 100 microlitri di tampone di analisi e rimuovendo SANE dalla piastra in modo simile. Utilizzando il separatore a piastre magnetiche, risospendere le microsfere in 100 microlitri di tampone di saggio pipettando delicatamente su e giù cinque volte con un pipettatore multicanale. Analizza su strumenti xap luminex come lo strumento magix.

L'intensità del segnale fluorescente di questa reazione è direttamente proporzionale alla quantità di proteine sulla superficie delle perline, fornendo una rapida valutazione della quantità relativa di proteine accoppiate alle perline. Per determinare la coppia di anticorpi più efficace nel test xap, preparare una miscela iniziale di tutti e quattro i set di microsfere aggiungendo 10 microlitri di ciascuno a 0,96 millilitri di tampone per il saggio. Preparare le soluzioni anticorpali di rilevazione diluendo ciascun anticorpo a un microgrammo per millilitro nel tampone di saggio.

Anche un tampone per il saggio. Preparare lo standard della proteina TNF alfa dei sistemi di ricerca e sviluppo a 2000 picogrammi per millilitro e diluire la streptavidina R FICO eryn a otto microgrammi per millilitro. Aggiungere 50 microlitri della miscela di perle accoppiate ad anticorpi a ciascuno dei 16 pozzetti di una piastra CoStar a fondo tondo da 96 pozzetti per il test di screening.

Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di analisi a otto dei 16 pozzetti per misurare il fondo. Quindi pipettare 50 microlitri dello standard TNF alfa negli altri otto pozzetti per misurare la risposta. Incubare per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce mentre si agita su un agitatore per piastre di saggio.

Quindi aggiungere 50 microlitri di ciascuno dei quattro anticorpi di rilevamento a quattro pozzetti, due dei quali sono pozzetti di fondo e due dei quali sono pozzetti di risposta. Incubare per 30 minuti nelle stesse condizioni dopo l'aggiunta di 50 microlitri di reagente SAPE a tutti i pozzetti. Incubare nuovamente per 15 minuti nelle stesse condizioni.

Posizionare la piastra su un separatore magnetico per un minuto. Quindi rimuovere il liquido capovolgendo con forza la piastra mentre si trova sul separatore sopra un contenitore di scarico. Pipettare 100 microlitri di tampone per il saggio in ciascuno dei 16 pozzetti.

Quindi rimuovere il liquido dalle perle utilizzando la separazione magnetica. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di analisi a ciascuno dei 16 pozzetti. Leggere la targhetta con lo strumento Luminex mag picks facendo riferimento al manuale d'uso per il corretto funzionamento.

Selezionare una coppia di anticorpi che soddisfi la potenza del segnale desiderata. Dopo aver selezionato il migliore per catturare l'anticorpo, diluire 100 microlitri di quell'anticorpo accoppiato a 10 millilitri con tampone di saggio. Aggiungere 50 microlitri di perle diluite a 78 pozzetti di due piastre CoStar a fondo tondo da 96 pozzetti.

Ogni piastra verrà utilizzata per valutare le prestazioni di un diverso anticorpo di rilevamento. Quindi, prepara una curva standard a 12 punti iniziando da 8.000 picogrammi per millilitro e terminando con quattro picogrammi per millilitro. Con i sistemi di ricerca e sviluppo.

Lo standard TNF Alpha aggiunge sei repliche da 50 microlitri di ciascuna diluizione a ciascuna delle piastre, oltre a sei pozzetti con 50 microlitri di tampone di analisi ciascuno come sfondo per un totale di 78 pozzetti per piastra. Incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce mentre si agitano su un agitatore per piastre di saggio. Quindi aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo di prima rilevazione a tutti i 78 pozzetti della prima piastra.

Ripetere l'operazione per il secondo anticorpo di rilevamento sulla seconda piastra. Incubare le piastre per 30 minuti nelle stesse condizioni. Quindi aggiungere i 50 microlitri del reagente SAPE in tutti i pozzetti di ciascuna piastra.

Dopo aver agitato le due piastre per 15 minuti al riparo dalla luce, posizionare le piastre sui separatori magnetici per un minuto. Rimuovere il liquido capovolgendo con forza la piastra mentre si trova sul separatore sopra un contenitore di scarico. Quindi, pipettare 100 microlitri di tampone di saggio in ciascuno dei 78 pozzetti sulle piastre prima di rimuovere il liquido dalle microsfere magnetiche.

Dopo aver aggiunto centinaia di microlitri di tampone di analisi alle perle in ciascuno dei 78 pozzetti sulle piastre, analizzare le piastre sullo strumento di prelievo magnetico facendo riferimento al manuale dell'utente per il corretto funzionamento. Seguendo le istruzioni incluse con i sistemi di ricerca e sviluppo, il TNF umano Alpha T NF SF one a DUO set ELI A kit. Misura la risposta generata dallo standard fornito con il kit r e d.

Ripetere il test ELI a altre tre volte, sostituendo gli anticorpi di cattura e rilevamento dei sistemi di ricerca e sviluppo con gli anticorpi degli altri fornitori. Per semplicità, abbinare gli anticorpi per fornitore, valutare ogni coppia in modo indipendente come richiesto dal formato EISA con ciascuno dei tre standard della proteina TNF Alfa. I saggi Luminex Xap sono stati eseguiti come multiplex per valutare tutti e quattro gli anticorpi di cattura come una miscela combinando quattro set di anticorpi TNF alfa accoppiati a microsfere Mag PLX, gli anticorpi di cattura sono stati valutati individualmente con ciascuno dei quattro anticorpi di rilevamento biotinilati, in modo tale che l'interazione di un anticorpo di rilevamento con ciascuno dei quattro anticorpi di cattura potesse essere determinata simultaneamente.

I risultati hanno indicato che la coppia di anticorpi del set DUO dei sistemi r e d ha ottenuto i risultati migliori con una risposta risultante a 6.183 unità di fluorescenza mediana o MFI. È stato anche osservato che gli anticorpi di rilevamento di Millipore e ABAM hanno fornito una risposta ragionevole nel test XAP quando, combinati con gli anticorpi di cattura dei sistemi RD, gli anticorpi di cattura di Millipore, ACAM e Novus hanno prodotto una risposta meno desiderabile nel test XAP. Il protocollo DUO set di r and d systems è stato utilizzato per confrontare le quattro coppie di anticorpi in un formato EISA.

Il protocollo dei sistemi di ricerca e sviluppo è stato utilizzato con tutte le coppie di anticorpi perché riflette i tipici protocolli EIA ampiamente utilizzati oggi ed è analogo ai protocolli utilizzati con la tecnologia xap. I test EISA hanno dimostrato che la coppia di anticorpi dei sistemi r e d ha dato ancora una volta i migliori risultati. La coppia di anticorpi di Acam non ha prodotto alcuna risposta, mentre le coppie di anticorpi di Millipore e Novas hanno prodotto risposte modeste al fine di valutare qualsiasi variazione nella reattività anticorpale.

Con lo standard, tutte e quattro le coppie di anticorpi sono state testate con tre diversi standard di proteina TNF alfa ricombinante di tre diversi fornitori. I dati mostrano che gli standard della proteina ricombinante TNF alfa dei tre fornitori hanno dato risultati equivalenti. La proteina TNF alfa dei sistemi r e d è stata utilizzata per generare curve standard con i saggi ELSA e XAP.

Mentre il test ELI A è stato eseguito con la coppia di anticorpi del sistema r e d, i test xap hanno utilizzato l'anticorpo di cattura del sistema r e d e l'anticorpo di rilevamento dei sistemi r e d o di Millipore. La proteina TNF alfa dei sistemi r e d è stata diluita per produrre un intervallo di concentrazioni da 8.000 a quattro picogrammi per millilitro. La coppia di anticorpi dei sistemi r e d ha prodotto l'esito atteso nel test Xap con una risposta superiore a 20.000 MFI, come mostrato.

Quando l'anticorpo di rilevazione di Millipore è stato utilizzato con il test Xap al posto dell'anticorpo di rilevazione dei sistemi di ricerca e sviluppo, la risposta è stata di circa il 30% della risposta ottenuta con l'anticorpo di rilevazione dei sistemi di ricerca e sviluppo. La linea verde su questo grafico rappresenta la curva standard dell'ELA, che aveva un intervallo di TNF alfa raccomandato dal produttore da 16 a 1000 picogrammi per millilitro. A causa del limite dello spettrofotometro, non è stato possibile aumentare la portata del test Eliza.

Inoltre, la gamma dinamica e la sensibilità di entrambi i metodi sono meglio illustrate quando vengono tracciate in una scala logaritmica. Si può notare una chiara distinzione tra la pendenza della risposta EISA e le risposte dei saggi xap e indica ulteriormente una capacità più limitante per la rilevazione del TNF alfa con l'EL iza sia a concentrazioni più alte che più basse. I limiti di rilevazione o LOD per i due saggi funzionali di TNF alfa xap sono stati approssimati identificando la concentrazione più bassa di TNF alfa con un livello di risposta osservato maggiore del fondo, più tre volte la sua deviazione standard o SD da sei repliche.

Qui si può osservare che quando si utilizza la coppia di sistemi r e d, la più bassa concentrazione di TNF alfa a 3,91 picogrammi per millilitro ha prodotto una risposta di 66 MFI, che è maggiore della risposta per il fondo più tre SD che si incontrano. Questo criterio. Quando l'anticorpo di rilevamento dei millipori è stato utilizzato con l'anticorpo di cattura dei sistemi r e d, il limite di rilevamento era inferiore a 7,81 picogrammi per millilitro.

In questo caso, la seconda concentrazione più bassa di TNF alfa ha prodotto una risposta accettabile di 17 MFI maggiore della risposta della concentrazione più bassa di TNF alfa più tre volte la sua deviazione standard. Allo stesso modo, il limite di rilevamento per il duo di sistemi di ricerca e sviluppo Eliza è stato stimato tra 63 e 31 picogrammi per millilitro. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre fasi come il test, varie matrici di campioni o concentrazioni di anticorpi nel reporter al fine di ottimizzare ulteriormente il test xap.