Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

L'obiettivo generale del seguente esperimento è convertire un saggio Eliza pre-ottimizzato per la citochina TNF Alfa alla piattaforma Xap, valutando al contempo coppie di anticorpi alternative. Questo viene ottenuto accoppiando l'anticorpo di cattura del kit ELIZA, insieme ad altri tre anticorpi di cattura candidati, a quattro diversi set di microsfere o perline miscelati tra loro. Questi quattro set consentono il test simultaneo di tutti e quattro i candidati con quattro anticorpi di rilevamento separati, al fine di determinare la migliore coppia di anticorpi.

I successivi due saggi Xap vengono realizzati utilizzando le due coppie di anticorpi più ottimali. Le prestazioni dei saggi vengono quindi confrontate con quelle del saggio EISA originale in termini di intensità del segnale, intervallo dinamico e sensibilità. I risultati mostrano che anticorpi simili possono comportarsi in modo molto diverso nelle stesse condizioni e che diversi anticorpi possono essere analizzati contemporaneamente mediante il saggio Luminex Xap, dimostrando che questo saggio presenta una sensibilità e un intervallo dinamico superiori rispetto all'EISA.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'EIS A è che i saggi immunoanalitici basati su xap permettono al ricercatore di testare più bersagli, o come in questo caso, di testare contemporaneamente più anticorpi. Per identificare l'anticorpo migliore dimostrato. La procedura sarà eseguita da Erica Lopez, scienziata associata presso Luminex Corporation.

Iniziare questo protocollo con la selezione e la preparazione di quattro anticorpi di cattura e quattro anticorpi di rilevamento specifici per il TNF alfa umano, come descritto nel protocollo scritto. Inoltre, preparare un anticorpo di conferma specifico per la specie ospite degli anticorpi di cattura. Portare i reagenti del kit di accoppiamento degli anticorpi a temperatura ambiente.

Etichettare quattro provette di reazione con i numeri delle regioni dei microsfera selezionati per la reazione di accoppiamento. Trasferire il contenuto delle quattro fiale di microsfere mag plex nelle quattro provette etichettate. Lavare ciascun set di microsfere due volte in 500 microlitri di tampone di attivazione e attivare ogni set di microsfere con le soluzioni di sulf ONHS e EDC come descritto nel kit di accoppiamento degli anticorpi.

Manuale d'uso dopo un'incubazione di 20 minuti su un agitatore rotante, ripetere il passaggio di lavaggio precedente con le perle ora attivate per un totale di tre volte con 500 microlitri di tampone di attivazione. Per ogni lavaggio, preparare quattro soluzioni separate da 500 microlitri, ciascuna contenente 7,5 microgrammi di anticorpo di cattura nel tampone di inattivazione.

Aggiungere queste quattro soluzioni di anticorpo di cattura ai rispettivi tubi di reazione. Vortexare immediatamente ogni tubo ed incubare per due ore su un agitatore rotante. Ripetere il passaggio di lavaggio con le perle ormai coniugate un totale di tre volte con 500 microlitri del tampone di lavaggio fornito con il kit di coniugazione degli anticorpi.

Dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio in ogni provetta di reazione per ottenere una concentrazione finale di 5 milioni di microsferette legate all'anticorpo per millilitro, vortexare e quindi sottoporre le provette di reazione a sonicazione per disperdere le microsferette. Contare il numero di microsferette recuperate dopo la reazione di accoppiamento utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Il recupero dalla reazione di accoppiamento è tipicamente superiore al 90%. Confermare che la reazione di accoppiamento sia avvenuta con successo preparando soluzioni di prova dei campioni di microsferette accoppiate per ogni serie, con una concentrazione finale di 100 microsferette per microlitro in tampone per saggio, e preparare un'opportuna diluizione dell'antisiero marcatore FICO eritinga.

Aliquotare 50 microlitri di ciascuna soluzione di prova in quattro pozzetti di una piastra rotonda da 96 pozzetti, per un totale di 16 pozzetti, utilizzando l'anticorpo di conferma IgG a quattro microgrammi per millilitro nel tampone di saggio. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di saggio in otto dei pozzetti per misurare il fondo, e 50 microlitri di anticorpo di conferma diluito negli otto pozzetti rimanenti. Mescolare delicatamente le reazioni aspirando e dispensando più volte con una pipetta multicanale.

Coprire la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore per piastre. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per uno o due minuti per far sedimentare le perle fuori dalla soluzione. Rimuovere quindi il liquido rovesciando con forza la piastra mentre si trova sul separatore sopra un contenitore per rifiuti.

Lavare ogni pozzetto due volte aggiungendo 100 microlitri di tampone per il saggio ed eliminando il SANE dalla piastra in modo analogo. Utilizzando il separatore magnetico per piastre, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone per il saggio pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta multicanale. Analizzare sullo strumento luminex xap, ad esempio lo strumento magix.

L'intensità del segnale fluorescente di questa reazione è direttamente proporzionale alla quantità di proteina presente sulla superficie dei bead, fornendo una valutazione rapida della quantità relativa di proteina legata ai bead. Per determinare la coppia di anticorpi più efficace nel saggio xap, preparare una miscela iniziale di tutti e quattro i set di bead aggiungendo 10 microlitri di ciascun set a 0,96 millilitri di tampone per saggio. Preparare le soluzioni di anticorpo di rilevamento diluendo ciascun anticorpo a un microgrammo per millilitro nel tampone per saggio.

È anche un buffer per saggio. Preparare il campione standard della proteina TNF alfa a 2000 picogrammi per millilitro e diluire la streptavidina R FICO eryn a otto microgrammi per millilitro. Aggiungere 50 microlitri della miscela di microsferette coniugate con anticorpo in ciascuna delle 16 pozzette di una piastra 96 pozzette fondo tondo CoStar per il saggio di screening.

Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone per il saggio in otto dei 16 pozzetti per misurare il valore di fondo. Successivamente, pipettare 50 microlitri del campione standard di TNF alfa negli altri otto pozzetti per misurare la risposta. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetti dalla luce, agitando su un agitatore per piastre da saggio.

Quindi aggiungere 50 microlitri di ciascuno dei quattro anticorpi di rilevamento a quattro pozzetti, due dei quali sono pozzetti di controllo del fondo e due pozzetti di risposta. Incubare per 30 minuti nelle stesse condizioni dopo l'aggiunta di 50 microlitri del reagente SAPE a tutti i pozzetti. Incubare nuovamente per 15 minuti nelle stesse condizioni.

Posizionare la piastra su un separatore magnetico per un minuto. Successivamente, rimuovere il liquido capovolgendo con forza la piastra mentre si trova sul separatore sopra un contenitore per rifiuti. Pipettare 100 microlitri di tampone per il saggio in ciascuna delle 16 pozzette.

Quindi rimuovere il liquido dalle perle utilizzando la separazione magnetica. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone per saggio in ciascuna delle 16 pozzette. Leggere la piastra con lo strumento Luminex mag picks, seguendo il manuale dell'utente per il corretto funzionamento.

Selezionare una coppia di anticorpi che soddisfi l'intensità del segnale desiderata. Dopo aver selezionato l'anticorpo migliore per la cattura, diluire 100 microlitri della soluzione stock di perle coniugate con quell'anticorpo fino a 10 millilitri con il buffer per il saggio. Aggiungere 50 microlitri delle perle diluite in 78 pozzetti di due piastre 96 pozzetti rotonde fondo piatto CoStar.

Ogni piastra verrà utilizzata per valutare le prestazioni di un diverso anticorpo di rilevamento. Successivamente, preparare una curva standard a 12 punti che inizia a 8.000 picogrammi per millilitro e termina a quattro picogrammi per millilitro. Con i sistemi r e d.

Aggiungere lo standard di TNF Alfa: aggiungere sei replicati di 50 microlitri per ogni diluizione a ciascuna delle piastre, più sei pozzetti con 50 microlitri di tampone per saggio ciascuno come fondo, per un totale di 78 pozzetti per piastra. Incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, agitando su un agitatore per piastre da saggio. Successivamente, aggiungere 50 microlitri del primo anticorpo di rilevamento in tutti e 78 i pozzetti della prima piastra.

Ripetere per il secondo anticorpo di rilevamento sulla seconda piastra. Incubare le piastre per 30 minuti nelle stesse condizioni. Quindi aggiungere 50 microlitri del reagente SAPE in tutti i pozzetti di ciascuna piastra.

Dopo aver agitato le due piastre per 15 minuti al riparo dalla luce, posizionarle su separatori magnetici per piastre per un minuto. Rimuovere il liquido capovolgendo energicamente la piastra mentre si trova sul separatore, sopra un contenitore per rifiuti. Successivamente, pipettare 100 microlitri di buffer per saggio in ciascuna delle 78 pozzette delle piastre prima di rimuovere il liquido dai microsferette magnetiche come in precedenza.

Dopo aver aggiunto cento microlitri di tampone per saggio alle perle in ciascuna delle 78 pozzette sulle piastre, analizzare le piastre sull'apparecchio mag picks seguendo il manuale utente per il corretto funzionamento. Seguire le istruzioni incluse con il kit ELISA DUOset per TNF alfa umano TNFSF1A di R&D Systems. Misurare la risposta generata dallo standard fornito con il kit di R&D.

Ripetere il saggio ELI a tre ulteriori volte sostituendo gli anticorpi di cattura e rilevamento dei sistemi r e d con gli anticorpi degli altri fornitori. Per semplicità, accoppiare gli anticorpi per fornitore e valutare ogni coppia indipendentemente secondo le richieste del formato EISA con ciascuno dei tre standard proteici del TNF Alfa. I saggi Luminex Xap sono stati eseguiti in modalità multiplex per valutare tutti e quattro gli anticorpi di cattura come miscela, combinando quattro set di anticorpi anti-TNF alfa accoppiati a microsfere Mag PLX; gli anticorpi di cattura sono stati valutati con ciascuno dei quattro anticorpi di rilevamento biotinilati singolarmente, in modo da determinare simultaneamente l'interazione di un anticorpo di rilevamento con ciascuno dei quattro anticorpi di cattura.

I risultati hanno indicato che la coppia di anticorpi del set DUO dei sistemi r e d ha ottenuto le prestazioni migliori, con una risposta risultante di 6.183 unità di intensità di fluorescenza mediana o MFI. È stato inoltre osservato che gli anticorpi di rilevamento di Millipore e ABAM hanno fornito una risposta accettabile nel saggio XAP quando combinati con l'anticorpo di cattura del sistema RD, mentre gli anticorpi di cattura di Millipore, ACAM e Novus hanno prodotto una risposta meno soddisfacente nel saggio XAP. Il protocollo del set DUO dei sistemi r e d è stato utilizzato per confrontare le quattro coppie di anticorpi in un formato EISA.

Il protocollo dei sistemi r e d è stato utilizzato con tutte le coppie di anticorpi perché rispecchia i protocolli EIA tipicamente impiegati oggi e perché è analogo ai protocolli utilizzati con la tecnologia xap. I test EISA hanno mostrato che la coppia di anticorpi dei sistemi r e d ha nuovamente fornito i migliori risultati. La coppia di anticorpi di Acam non ha prodotto alcuna risposta, mentre le coppie di anticorpi di Millipore e Novas hanno prodotto risposte modeste al fine di valutare eventuali variazioni nella reattività degli anticorpi.

Con lo standard, tutte e quattro le coppie di anticorpi sono state testate con tre diversi standard proteici ricombinanti di TNF alfa provenienti da tre fornitori diversi. I dati mostrano che gli standard proteici ricombinanti di TNF alfa dei tre fornitori hanno fornito risultati equivalenti. La proteina TNF alfa dei sistemi r e d è stata utilizzata per generare curve standard con i saggi ELSA e XAP.

Mentre il saggio ELI A è stato eseguito con la coppia di anticorpi del sistema r e d, i saggi xap hanno utilizzato l'anticorpo di cattura del sistema r e d e, come anticorpo di rilevamento, quello proveniente dal sistema r e d oppure da Millipore. La proteina TNF alpha del sistema r e d è stata diluita per ottenere una serie di concentrazioni comprese tra 8.000 e quattro picogrammi per millilitro esclusivamente. La coppia di anticorpi del sistema r e d ha prodotto l'esito previsto nel saggio Xap, con una risposta superiore a 20.000 MFI, come mostrato.

Quando l'anticorpo di rilevamento di Millipore è stato utilizzato con il saggio Xap al posto dell'anticorpo di rilevamento dei sistemi r e d, la risposta è stata circa il 30% di quella ottenuta con l'anticorpo di rilevamento dei sistemi RD. La linea verde su questo grafico rappresenta la curva standard dell'ELA, che aveva un intervallo raccomandato dal produttore per il TNF alfa compreso tra 16 e 1000 picogrammi per millilitro. A causa del limite dello spettrofotometro, non è stato possibile aumentare l'intervallo del saggio Eliza.

Inoltre, l'intervallo dinamico e la sensibilità di entrambi i metodi risultano meglio illustrati quando rappresentati su una scala logaritmica. È possibile osservare una chiara differenza tra la pendenza della risposta EISA e le risposte degli saggia xap, che indica ulteriormente una capacità più limitata di rilevamento del TNF alfa con l'EL iza sia a concentrazioni più elevate che più basse. I limiti di rilevamento, o LOD, per i due saggi funzionali xap del TNF alfa sono stati approssimati identificando la concentrazione più bassa di TNF alfa con un livello di risposta osservato superiore al valore di fondo, più tre volte la sua deviazione standard (SD) ottenuta da sei replicati.

Qui si può osservare che, utilizzando la coppia di sistemi r e d, la concentrazione più bassa di TNF alfa, pari a 3,91 picogrammi per millilitro, ha prodotto una risposta di 66 MFI, superiore alla risposta corrispondente al valore di fondo più tre deviazioni standard. Rispettando questo criterio, quando l'anticorpo di rilevamento Millipore è stato utilizzato insieme all'anticorpo di cattura dei sistemi r e d, il limite di rilevazione è risultato inferiore a 7,81 picogrammi per millilitro.

In questo caso, la seconda concentrazione più bassa di TNF alfa ha prodotto una risposta accettabile di 17 MFI superiore alla risposta della concentrazione più bassa di TNF alfa più tre volte il suo scarto tipo. Analogamente, si è stimato che il limite di rilevazione per il sistema duo set Eliza r e d fosse compreso tra 63 e 31 picogrammi per millilitro. Seguendo questa procedura, altri passaggi come il test, l'uso di diverse matrici campionarie o concentrazioni di anticorpo nel reporter possono essere eseguiti per ulteriormente ottimizzare il saggio xap.