Analisi basata sulla citometria a flusso dell'attivazione delle cellule dendritiche mediante immunocomplessi

Inizia con una sospensione di cellule tumorali fissata chimicamente.

Aggiungere una concentrazione ottimale di immunoglobulina G legante il tumore che si lega agli antigeni della superficie delle cellule tumorali, formando complessi immunitari o IC.

Trasferire gli IC in una piastra di coltura contenente cellule dendritiche aderenti. Incubare.

La cellula dendritica riconosce l'IC, lo interiorizza e lo elabora in frammenti peptidici.

I frammenti vengono caricati su molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II o MHC-II e presentati sulla superficie cellulare, insieme alla molecola costimolatoria CD86.

Rimuovi i supporti. Aggiungere un tampone di dissociazione cellulare e pipettare energicamente per staccare le cellule.

Trasferire le cellule in una provetta.

Centrifugare e risospendere le cellule in una soluzione bloccante per bloccare le interazioni non specifiche.

Sovrapposizione con un cocktail di anticorpi marcati con fluoroforo mirati a MHC-II e CD86.

Aggiungere un colorante legante il DNA e incubare brevemente per colorare i nuclei delle cellule morte.

Utilizzando la citometria a flusso, identificare le cellule vive che co-esprimono MHC-II e CD86, confermando l'attivazione delle cellule dendritiche mediata da IC.

Innanzitutto, fissare le cellule in paraformaldeide tamponata all'1,8% per 10 minuti a temperatura ambiente. Seminare la sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a forma di U. Quindi, aggiungere diverse diluizioni di anticorpi leganti il tumore in ciascun pozzetto. Successivamente, incubare le cellule su ghiaccio per 15-20 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 150 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato, quindi centrifugare a 400 volte g per 5-10 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, espellere il surnatante e lavare le cellule due volte. Sciogliere le cellule in 100 microlitri di tampone FACS, contenente anticorpo secondario coniugato con fluoroforo. Quindi, incubare la piastra sul ghiaccio per 15-20 minuti.

Dopo 15-20 minuti, aggiungere 200 microlitri di tampone FACS per lavare le cellule. Centrifugare la piastra a 400 volte g per 5-10 minuti. Decantare il surnatante. Condurre la citometria a flusso per analizzare il legame del tumore e per determinare la concentrazione minima di immunoglobulina G necessaria per rivestire le cellule.

Una volta che le cellule sono rivestite con una concentrazione minima di immunoglobuline G, aggiungere l'immunocomplesso tumorale marcato con CFSE alle cellule dendritiche derivate dai monociti in un rapporto 1:5. Quindi, incubare la miscela per 12-16 ore durante la notte in un terreno completo. Eseguire l'analisi FACS dell'attivazione delle cellule dendritiche derivate dai monociti.