Un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali

Iniziamo con le cellule tumorali che trasportano IdU, un sostituto sintetico del nucleotide timidino, già integrato nel loro DNA. Quando queste cellule incontrano uno stress di replicazione, la loro sintesi del DNA si ferma, rivelando IdU all'interno di regioni di DNA a singolo filamento esposte.

Fissare le cellule e aggiungere molecole detergenti per rendere permeabile la membrana cellulare.

Aggiungere BSA per bloccare i siti di legame degli anticorpi non bersaglio.

Introdurre anticorpi anti-IdU che interagiscono con il DNA a filamento singolo marcato con IdU.

Aggiungere anticorpi secondari verdi marcati con fluoroforo che hanno come bersaglio gli anticorpi anti-IdU. Rimuovere gli anticorpi non legati.

Posizionare il vetrino coprioggetti su un vetrino contenente un mezzo di montaggio con un colorante fluorescente che colora i nuclei.

Al microscopio a fluorescenza, osservare i nuclei blu.

I focolai di fluorescenza verdi rappresentano gli anticorpi che si legano al DNA a singolo filamento.

Contare il numero di fuochi per quantificare il livello di stress di replicazione.

Aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare su vetrini coprioggetti di poli-L-lisina posizionati nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti e far crescere le cellule nel terreno di coltura in condizioni standard. Dopo un raddoppio della popolazione, aspirare il terreno esistente dalla piastra e pulsare le cellule con 10 IdU micromolari per i due successivi raddoppi della popolazione.

Per raccogliere le cellule, sostituire il terreno con PBSTx ghiacciato allo 0,5% su ghiaccio per 5 minuti. Per la fissazione delle cellule, aspirare PBSTx e incubare le cellule per 15 minuti con paraformaldeide al 3% a temperatura ambiente. Dopo 3 o 4 lavaggi con PBS, mantenere le celle fisse a 4 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Dopo la fissazione, permeabilizzare le cellule utilizzando PBSTx allo 0,5% su ghiaccio per 5 minuti, assicurandosi di coprire l'intero vetrino coprioggetti. Dopo aver lavato le celle 3 o 4 volte con 1 millilitro di PBST allo 0,2% a temperatura ambiente, aspirare il PBST e bloccare i campioni, utilizzando il 5% di BSA prodotto in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.

Per l'immunocolorazione, preparare una camera umidificata mettendo un tovagliolo di carta bagnato su un Tupperware a fondo piatto. Coprire il coperchio della piastra a 24 pozzetti con parafilm. Posizionarlo nella camera umidificata e adagiare i vetrini coprioggetti sul coperchio del piatto. Aggiungere 60 microlitri di anticorpo primario di topo diluito anti-BrdU, sulla parte superiore del vetrino coprioggetti.

In alternativa, per ridurre l'essiccazione dell'anticorpo e utilizzare meno volume, posizionare una goccia di anticorpo diluito sul parafilm e capovolgere il vetrino coprioggetti su di esso. Quindi, incubare per 1 ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare l'anticorpo primario.

Rimettere i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti e lavarli con PBST allo 0,2% 4 volte. Aggiungere l'anticorpo secondario diluito sul vetrino coprioggetti, come dimostrato in precedenza, e incubare per un'ora al buio a temperatura ambiente. Etichettare un vetrino da microscopio e montare il vetrino coprioggetti sui vetrini con il mezzo di montaggio DAPI. Conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente per 24 ore se il mezzo di montaggio deve essere polimerizzato o indurito.