Un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali

Iniziamo con le cellule tumorali che trasportano IdU, un sostituto sintetico del nucleotide timidino, già integrato nel loro DNA. Quando queste cellule incontrano uno stress di replicazione, la loro sintesi del DNA si ferma, rivelando IdU all'interno di regioni di DNA a singolo filamento esposte.

Fissare le cellule e aggiungere molecole detergenti per rendere permeabile la membrana cellulare.

Aggiungere BSA per bloccare i siti di legame degli anticorpi non bersaglio.

Introdurre anticorpi anti-IdU che interagiscono con il DNA a filamento singolo marcato con IdU.

Aggiungere anticorpi secondari verdi marcati con fluoroforo che hanno come bersaglio gli anticorpi anti-IdU. Rimuovere gli anticorpi non legati.

Posizionare il vetrino coprioggetti su un vetrino contenente un mezzo di montaggio con un colorante fluorescente che colora i nuclei.

Al microscopio a fluorescenza, osservare i nuclei blu.

I focolai di fluorescenza verdi rappresentano gli anticorpi che si legano al DNA a singolo filamento.

Contare il numero di fuochi per quantificare il livello di stress di replicazione.

Aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare su vetrini coprioggetti di poli-L-lisina posizionati nei pozzett