Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare e quantificare gli eventi di traduzione compartimentalizzati che si verificano durante le fasi iniziali dell'adesione cellulare. Questo metodo ha un'ampia applicazione. Utilizzarlo ogni volta che potrebbe essere un test di risposta rapida alla traduzione specifica, ad esempio quando si analizza la migrazione cellulare, l'adesione o la risposta precoce ai farmaci.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile, rapida ed economica. Richiede solo la puromicina, gli anticorpi diretti contro la puromicina e il sistema di imaging a scansione confocale standard. Per iniziare, fai una sospensione di cellule MRC-5.

Utilizzare la tripsinizzazione, seguita da centrifugazione, rimozione del surnatante, quindi risospensione in DMEM con il dieci percento di FBS, a 40 mila cellule per millilitro. Incubare la sospensione con una leggera rotazione per 20 minuti per dissociare completamente i complessi di adesione focale. Questo è fondamentale.

Successivamente, in due piastre con fondo di vetro da 35 millimetri, aggiungere due millilitri di aliquote di sospensione e incubarle per consentire l'adesione cellulare e la formazione di SiC. Dopo 40 minuti, trattare una piastra con cicloesimide e rimetterla nell'incubatrice. Questa piastra funzionerà come controllo negativo.

Dopo 55 minuti, applicare la puromicina su entrambe le piastre alla concentrazione predeterminata e incubare le piastre per altri cinque minuti. Dopo un'ora di semina e cinque minuti di puromicina in collaborazione, lavare ogni piastra due volte con due millilitri di PBS ghiacciato. Quindi fissare le cellule con un millilitro di formaldeide al quattro percento in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la fissazione, lavare le cellule tre volte con PBS, quindi permeabelizzare le cellule utilizzando 500 microlitri di tritone X-100 allo 0,5% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le piastre tre volte con PBS, quindi applicare 500 microlitri di BSA all'uno percento in PBS. Continuare l'incubazione a temperatura ambiente per altri 20 minuti.

Per rimuovere l'eccesso di BSA, lavare le cellule tre volte con lo 0,1% di Tween-20 in PBS. Ora, incubare le cellule con 300 microlitri di anticorpo anti-puromicina. Rimuovere l'anticorpo non legato utilizzando tre lavaggi con lo 0,1% di Tween-20.

Successivamente, applicare trecento microlitri di una miscela di due anticorpi secondari coniugati con fluorofori per visualizzare polipeptidi puromicolati e de factem. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo un'ora, lavare le piastre tre volte per rimuovere gli anticorpi non legati e quindi applicare trecento microlitri di soluzione Tween-20 allo 0,1%, integrata con DAPI.

Lasciare che il DAPI rimanga nelle celle per cinque minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare le celle altre quattro volte, terminando con un lavaggio in PBS puro. Quindi, conservare le cellule in due millilitri di PBS per l'imaging.

Utilizzando qualsiasi sistema di imaging confocale disponibile in commercio, determinare innanzitutto le impostazioni appropriate che massimizzano la gamma dinamica per la quantificazione. L'attenzione sulla quantificazione può essere ottenuta solo se si evita la saturazione della dimensione del picco e la concentrazione viene regolata correttamente. L'impostazione può essere ottenuta regolando attentamente il vantaggio di potenza e gli offset del laser.

Innanzitutto, regola il fattore di zoom e il numero di pixel per ottimizzare la dimensione dei pixel. Fallo secondo il teorema di Nyquist. Quindi, diminuire la velocità di scansione e utilizzare la media per migliorare il rapporto segnale/rumore.

Quindi, determinare manualmente i piani focali superiore e inferiore appropriati lungo l'asse Z e impostare la dimensione del passo calcolando la risoluzione assiale e dividendo questa distanza per 2,3. Il risultato tipico è da 20 a 25 livelli di immagine. Una volta ottimizzate le impostazioni, acquisisci un'immagine confocale di un'intera singola cella utilizzando un obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60x con un'apertura numerica di 1,42.

Per quantificare e analizzare i segnali del fluroforo, aprire prima un'immagine corrispondente allo strato del piano z di interesse nell'immagine J.Quindi, utilizzando lo strumento di disegno, tracciare una linea attraverso la cella in cui si desidera la quantificazione. Quindi, modifica il soffio della linea facendo doppio clic su dritto. I valori di intensità saranno mediati attraverso la larghezza della linea, quindi utilizzare una linea più sottile per evitare la sovrapposizione del segnale da strutture diverse.

Quindi, profilare la densità del segnale lungo la linea. Ora, ripeti il processo di raccolta della densità del segnale lungo la stessa linea nel canale che corrisponde a un fluroforo. I valori saranno sempre ordinati utilizzando l'orientamento della linea.

Ora copia i dati del profilo e incollali in un foglio di calcolo per l'analisi. Ripetere questo processo di raccolta dei dati da ogni immagine del piano Z di interesse prima di procedere con l'analisi statistica. In alternativa, invece di raccogliere il segnale lungo un asse, il segnale può essere raccolto da un'area dell'immagine.

Per prima cosa utilizzare la funzione di forma geometrica per selezionare una regione di interesse. Quindi, regola il livello di soglia per evitare qualsiasi sfondo. Nell'istogramma delle intensità dei pixel, spostare il cursore per regolare quali pixel verranno inclusi nella quantificazione.

Imposta la soglia per eliminare tutti i pixel rossi all'esterno della cella. Ora, definisci i parametri di misura necessari per misurare il segnale di interesse e non il segnale di fondo. Alterna il limite alla soglia e le opzioni di densità integrata.

Quindi, usa il comando measure. Si aprirà una nuova finestra con i valori medi di grigio e il numero di pixel nell'area selezionata. Ora ripeti il processo, applicando la stessa soglia per determinare l'intensità del segnale nell'intera cella.

Quindi utilizzare questi dati per calcolare il rapporto tra il segnale nell'area selezionata e quello dell'intera cella. Per una misurazione accurata degli eventi di traslazione utilizzando l'incorporazione di purmicina, sono state prima valutate le condizioni ottimali per una misurazione assiale. È stato confrontato uno spettro di concentrazioni rispetto a un trattamento di cinque o dieci minuti.

La concentrazione accettabile di puromicina per le cellule MRC-5 e HeLa era leggermente superiore a quella necessaria per le cellule Huh-7. Le cellule trattate per dieci minuti con alte concentrazioni di puromicina hanno generato polipeptidi puromicolati per lo più più piccoli. I polipeptidi più piccoli si disinnescano più rapidamente e non sono desiderabili.

Il tempo di incubazione più breve è stato quindi ritenuto più desiderabile. Il trattamento con cicloesimide è un controllo negativo efficace e importante. Nelle cellule MRC-5, dopo il trattamento con cicloesimide è stato rilevato solo un debole segnale di puromicina.

Utilizzando la quantificazione assiale del segnale, la localizzazione generale dei polipeptidi puromicolati corrispondenti a proteine di nuova sintesi potrebbe essere valutata a diversi livelli all'interno della cellula. Era anche possibile una distribuzione quantitativa del segnale in tutta la cellula. Per entrambe le tecniche, era importante quantificare il segnale per ogni piano Z nello stack di immagini per valutare accuratamente gli eventi di traduzione in un'intera cellula.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come valutare l'evento di traduzione nel compartimento subcellulare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno, se eseguita correttamente. Quando si pensa a questa procedura, è importante ricordare che la concentrazione di puromicina e il suo tempo di incubazione sono importanti.

Per limitare la diffusione, è preferibile limitare il tempo di incubazione. È anche importante riconoscere che la qualità del tipo di acquisizione dell'immagine è fondamentale per ottenere buoni risultati. Non dimenticare che lavorare con la formaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa chimica.