Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare oggettivamente le risposte delle singole cellule quantificando specifiche intensità di marcatori fluorescenti dalle immagini del microscopio. Ciò si ottiene sottoponendo prima una cellula di coltura tissutale aderente al knockdown genico mediato da irna. Nella seconda fase, le cellule vengono colorate in modo fluorescente e quindi sottoposte a imaging per diversi marcatori di interesse.

Nella fase finale, l'espressione dei marcatori all'interno di specifiche regioni subcellulari è definita algoritmicamente, sono singole cellule. In definitiva, le risposte cellulari ai segnali biologici da knockdown genico possono essere analizzate misurando i livelli di espressione fluorescente dei marcatori di interesse e la loro traslocazione subcellulare. Sebbene questa procedura fornisca informazioni sulla regolazione del transito del ciclo cellulare G one in risposta ai siRNA.

Può anche essere applicato a studi che generano immagini cellulari fluorescenti, studiando il trasporto nucleare e l'omeostasi delle proteine. A dimostrare la procedura saranno Daniel Wek e Car K HO, colleghi postdoc del mio laboratorio. Iniziare dispensando 70 microlitri di irna 200 nanomolari, diluito un tampone irna nei pozzetti appropriati di una piastra sterile da 96 pozzetti in una cappa sterile per coltura tissutale. Quindi aggiungere 105 microlitri di lipide di trasfezione diluito in 40 volumi di terreno DMEM libero dal siero in ciascun pozzetto di sir e mescolare la piastra mediante una leggera vibrazione della temperatura ambiente, quindi dopo 10 minuti, suddividere i 175 microlitri risultanti in tre repliche da 50 microlitri per bersaglio in una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale opaca con una base trasparente.

Successivamente, erogare 8.000 cellule per pozzetto in 150 microlitri di DMEM con il 10% di siero direttamente sui complessi lipidici di irna da 50 microlitri senza mescolare. Quindi sigillare la piastra con una membrana traspirante adesiva sterile e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo, aspirare il fluido dalle piastre.

Quindi fissare le cellule in 100 microlitri di formaldeide tampone al 4% in una cappa aspirante a temperatura ambiente Dopo 10 minuti, aspirare il fissativo ed eseguire tre lavaggi da 100 microlitri con PBS dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il PBS e perforare le cellule con tre cicli di incubazione della soluzione di permeazione da 100 microlitri di 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente senza agitare. Dopo l'ultima incubazione, rimuovere la soluzione di permeazione e quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione in blocco per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi aspirare la soluzione a blocchi e sondare le cellule con 50 microlitri dell'anticorpo primario di interesse entro due settimane dalla marcatura del microscopio confocale uc con un obiettivo 20 x per acquisire immagini TIFF separate in scala di grigi a 16 bit in tre canali corrispondenti al colorante DNA GFP e alla colorazione immunologica. I Flora fours catturano molti set di immagini o fotogrammi non sovrapposti per visualizzare circa 1000-2000 cellule per pozzetto. Denominazione sistematica del file immagine con le informazioni sui metadati in modo che ogni nome di file sia una combinazione univoca di nome dell'esperimento, indirizzo del pozzo, numero di frame e identificatore del canale.

Quindi aprire il software del profilatore di celle e fare clic su file e importare la pipeline. Successivamente, in da file, selezionare il file file CP pipe della pipeline a tre canali, che contiene le istruzioni necessarie per il software per interpretare i metadati del file immagine dal nome file salvato Convention Cell Profiler può ora essere utilizzato per correlare le immagini, estrarre il DNA nucleare e le intensità degli anticorpi dai file e utilizzare il canale GFP per calcolare il rapporto tra l'intensità nucleare e quella del citoplasma. Per ogni cella rilevata, fare clic sul pulsante Visualizza impostazioni di output, quindi fare clic sulle cartelle di input e output predefinite.

Selezionando rispettivamente la posizione dei file immagine per l'analisi e la destinazione dei dati estratti. Quindi, nella finestra dei moduli di analisi, fare clic sulle icone a forma di occhio appropriate per osservare le finestre di identificazione degli oggetti primari e degli oggetti terziari durante l'analisi e fare clic su analizza immagini al termine dell'analisi. Fare clic su OK nella finestra di messaggio e passare alla cartella di output predefinita Percorso in cui tutti i file di dati vengono salvati come file con valori separati da virgole.

Per eseguire l'estrazione dei dati, trovare il nuovo file CSV dei nuclei incluso nell'output del profilatore cellulare, che contiene i dati delle singole cellule per l'intensità degli anticorpi nucleari fluorescenti, l'intensità del DNA nucleare e i valori del rapporto reporter a due percentuali GFP CDK. Copiare il file di script del polso fornito nel classificatore dell'andatura PL nella stessa cartella del file di dati CSV dei nuclei. Quindi fare doppio clic sull'icona di Pearl Script.

Quando richiesto, digitare il nome completo del file di dati seguito da un nome di file CSV DOT per il file in cui le cellule devono essere controllate e i valori di gate per la fluorescenza dell'anticorpo e i dati del reporter G FP CDK two. Verificare che il file appena creato combini i valori grezzi del saggio delle singole cellule dal profilo cellulare originale dei dati con le etichette delle sottopopolazioni che mostrano le prestazioni di ciascuna cella di ciascun pozzetto rispetto a entrambi i cancelli. Ora apri il software R Studio per tracciare i dati per ogni condizione sperimentale utilizzando le etichette delle singole sottopopolazioni cellulari facendo clic su File e Apri file, quindi selezionando il file dot r di analisi fornito.

Digitare l'indirizzo del computer della cartella contenente i dati gestiti, inclusa la lettera dell'unità e il nome del file stesso. Quindi evidenzia le righe da uno a 17 nella finestra in alto a sinistra del nostro studio e fai clic sul pulsante Esegui per inserire i valori di soglia dei dati sperimentali e i dettagli sulla posizione del pozzo. Infine, evidenzia i singoli blocchi del codice rimanente sotto la riga 17 e fai clic sul pulsante Esegui per creare i grafici corrispondenti.

Osserva i grafici nella finestra nell'angolo in basso a destra del nostro studio, quindi fai clic sul pulsante di esportazione per salvarli in una varietà di formati. Il flusso di lavoro qui descritto analizza le immagini del microscopio a fluorescenza per produrre dati grezzi sotto forma di un elenco dettagliato di ciascuna cellula identificata e dei relativi valori di analisi. Esistono molte opzioni per l'analisi di questi dati.

Ad esempio, in questi grafici a istogramma, i valori del saggio per le cellule trattate con RNA di controllo consentono l'identificazione delle porte appropriate per la soglia di ciascun test. Le soglie di gating vengono quindi applicate utilizzando uno script a impulsi per etichettare ogni cellula nei dati grezzi in base al risultato del saggio. Questo approccio di etichettatura aiuta la valutazione visiva preliminare e automatizzata delle relazioni tra i trattamenti e la distribuzione della sottopopolazione di insiemi anche molto grandi di dati di singole cellule.

Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, le condizioni di knockdown di tre irna hanno portato a distribuzioni contrastanti delle cellule rispetto ai gate dei due saggi. I grafici R utilizzano le etichette per calcolare le distribuzioni percentuali delle celle in ciascun quadrante. Le etichette consentono inoltre di incrociare ulteriori misurazioni fluorescenti con i dati del saggio.

In questo esperimento, le sottopopolazioni di cellule trattate con SI CDK 6 sono state raggruppate in base alle rispettive etichette di saggio e tracciate come istogrammi di colorazione del DNA nucleare. L'uso delle etichette dei dati cellulari rivela la relazione tra i due saggi cellulari e il contenuto di DNA nelle cellule. Quando si esegue questa procedura, è sempre importante ricordare di testare e regolare i parametri di segmentazione dell'immagine quando si utilizza il profilatore di celle.

Ciò è particolarmente importante quando si utilizzano per la prima volta file immagine nuovi o non testati. Ok.