Name: Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri un flusso di lavoro informatico per l'analisi di immagini multiplex di cellule fluorescenti. Utilizza Cell Profiler e R Studio per quantificare marcatori nucleari e citoplasmatici e analizzare la loro traslocazione subcellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni CRUK 15043 e 14251 CRUK. Ringraziamo Daniel Wetterskog e Ka Ho Kei per l&#39;assistenza tecnica e la lettura critica del manoscritto.

1. sperimentale Perturbazione e etichettatura delle cellule per la risposta Markers (Schermo Reverse Transfection siRNA) <ol><li> In una sterile cultura del tessuto cappa pipetta 70 ml di 200 Nm siRNA in 1x tampone siRNA in pozzetti di una pianura 96 ​​piastra sterile, bene. Diluire transfezione lipidi in 40 volumi di supporti privi di siero DMEM ed erogare 105 ml in ciascun pozzetto contenente siRNA. NOTA: La diluizione 262,5 ml di lipidi in 10,5 ml di DMEM senza siero produce un master mix adatto per un intero 96 pozzetti di siRNA, offrendo 2,6 ml di lipidi per pozzetto. L&#39;utilizzo di 200 Nm a partire siRNA concentrazione in questa fase fornirà una soluzione di lavoro di 20 Nm nella fase 1.3, ma le procedure di lavoro per le concentrazioni di lavorare fino a 5 Nm, con la concentrazione di partenza adeguato di conseguenza (cioè 50 Nm). Concentrazione di lavoro inferiore può ridurre punteggi positivi falsi fuori bersaglio, anche se possono ridurre l&#39;entità della risposta on-target, che porta ad aumentare di on-target percentuali di falsi negativi. </li><li> Mescolare la piastra dolce vibrazione per dieci minuti a temperatura ambiente. Suddividere i risultanti 175 ml in tre 50 microlitri repliche per bersaglio su un, colture di tessuti opachi trattati, piastra a 96 pozzetti con una base trasparente. </li><li> Transfect Reverse erogando 8.000 cellule per pozzetto in 150 microlitri DMEM contenente 10% di siero direttamente sui complessi lipidi-siRNA 50 microlitri. Cellule colorettali umani Usa HCT116 esprimono stabilmente un marcatore GFP-tagged segnalazione dell&#39;attività CDK2 5,8. Nessun ulteriore miscelazione è necessario. Sigillare la piastra con una sterile, colla membrana traspirante per controllare l&#39;umidità e prevenire &#39;edge-effetti&#39; piatto e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2 per 48 ore. </li><li> Aspirare il supporto in modo che una piccola quantità residua di supporto rimane nei pozzetti. Fissare le cellule aggiungendo 100 ml di formaldeide al 4% tamponata ad ogni pozzetto ed incubare in una cappa aspirante per 10 min a camera temperature. </li><li> Rimuovere la soluzione di fissaggio aspirando la piastra. A questo punto o interrompere l&#39;esperimento lavando piastra tre volte con 100 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e quindi memorizzare sigillato, sotto 100 ml di PBS al buio a 4 ° C per un massimo di una settimana, o procedere con il permeabilizzazione delle cellule. NOTA: Si consiglia di lastre di lavorazione il più presto possibile dopo la fissazione, e in generale preferiscono lo stoccaggio delle lastre completamente trasformati. Conservanti biocidi, quali il thimerosal, azoturo di sodio, o alternative commerciali possono essere aggiunti per prevenire la crescita micoroganismal. L&#39;aggiunta di inibitori di fosfatasi aiuta a preservare fosfo-epitopi, e altri mezzi per conservare gli stati di modificazione delle proteine ​​può essere utile in importanti contesti di analisi </li><li> Rimuovere PBS dalla piastra e permeabilize le cellule aggiungendo 100 ml di soluzione di permeabilizzazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Aspirare la soluzione permeabilizzazione utilizzando un MulticanaleAnnel pipetta. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Bloccare le cellule aggiungendo 100 microlitri soluzione blocco per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione blocco aspirando la piastra, poi sondare con 50 ml di anticorpo anti RB1 P-S780 diluito 500 volte nella soluzione di blocco per 2 ore al buio a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di soluzione di lavaggio piastra, lasciando la soluzione sulla piastra per 5 minuti ogni volta. Sonda la piastra una notte al buio a 4 ° C con 50 microlitri fluorescenza-tagged anticorpo secondario diluito 1.000 volte in soluzione blocco integrato con 2 mM del colorante DNA specifico-cromatina Bisbenzimide. Lavare la piastra tre volte prima e deposito chiuso, in 100 microlitri di PBS al buio a 4 ° C. Immagine la piastra entro due settimane. </li></ol> 2. Imaging e segmentazione di immagini <ol><li> Utilizzare un microscopio confocale o spinning-disk di fluorescenza con un obiettivo 20X per prendere parte 16-bit, immagini TIFF in scala di grigi a tre canali corrispondenti al colorante DNA, GFP e fluorofori immuno-colorazione. Cattura molti set di immagini non sovrapposte, di cui qui come cornici, per l&#39;immagine di circa 1.000-2.000 cellule per bene. </li><li> Nome i file di immagine in modo sistematico in modo che ogni nome di file è una combinazione unica di &#39;nome dell&#39;esperimento&#39;, &#39;beh indirizzo&#39;, &#39;numero di telaio&#39; e &#39;identificatore di canale&#39;, in questo ordine (Figura 3). Il set di dati di esempio utilizza &quot;Blue&quot; (cromatina colorazione DNA) o &quot;Green&quot; (GFP) o &quot;Red&quot; (il fluoroforo immuno-tinto) come identificatori di canale. L&#39;indirizzo ben, numero di fotogramma e il canale identificatore sono ulteriormente denominato metadati dell&#39;immagine. Utilizzare il simbolo di sottolineatura per evitare confusione bene e telaio metadati. </li><li> Nome i file con questi elementi di metadati nell&#39;ordine specificato. Ciò è necessario per garantire che i passi successivi software Correset di gruppo ctly di immagini per l&#39;analisi. </li><li> Scaricare e installare il Profiler cella freeware, attivo Perl Community Edition, R ambiente di programmazione statistica e rstudio. Accettare tutte le opzioni di default durante l&#39;installazione; Gli utenti PC che installano attivo Perl dovrebbero consentire a tutti possibilità per PATH, associazione di file di estensione e la mappatura script in cui viene richiesto. Attivo Perl è facoltativo per gli utenti Mac, ma saranno di necessità di eseguire lo script Perl in fase 3.2 dalla riga di comando del terminale piuttosto che utilizzare l&#39;icona clic. </li><li> Aprire il software Profiler cellulare, fare clic su &#39;File&#39;, &#39;Import Pipeline&#39; poi &#39;Da file&#39; e selezionare il file 3_channels_pipeline.cppipe (Figure S1A e S1B). Il file contiene le istruzioni necessarie per il software di interpretare l&#39;immagine metadati del file dalla convenzione nome del file descritto. Profiler cellulare riguarda ora le immagini, estrae il DNA nucleare e intensità di anticorpi da these e utilizza il canale GFP per calcolare il rapporto di intensità rispetto nucleare citoplasma per ogni cella rilevati (figure 4 e 5). </li><li> Fare clic sul &#39;impostazioni di uscita View&#39; pulsante nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra Profiler cella. Nella parte superiore del nuovo schermo sono caselle di testo etichettati &#39;cartella predefinita Input&#39; e &#39;cartella di destinazione predefinita&#39;. Uno alla volta, fare clic sulla cartella-icone a destra di queste caselle e selezionare il percorso dei file di immagine per l&#39;analisi e la destinazione dei dati estratti, rispettivamente (Figura S1C). </li><li> Iniziare l&#39;analisi delle immagini, premendo il pulsante &#39;analizzare le immagini &quot;nell&#39;angolo in basso a sinistra del Profiler Cell. Nella parte inferiore dello schermo osservare il tempo rimanente per l&#39;estrazione dei dati, &#39;Stop Analysis&#39; e pulsanti &quot;Pausa&quot;. Se necessario sospendere l&#39;analisi selezionando il tasto &#39;Pause&#39; in qualsiasi momento, il che è utilequando si guardano le immagini in fase di analisi (descritto al punto 2.8). </li><li> Facoltativamente, aprire le finestre per una qualsiasi delle fasi di analisi dell&#39;immagine facendo clic oculari icone nel pannello all&#39;estrema sinistra della finestra del programma (Figura S1D). Osservare la finestra &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; e quelli per &#39;secondari&#39; e &#39;Oggetti Terziario&#39; per verificare che le impostazioni attuali Profiler cellulare per effettuare la segmentazione di immagini adatte (vedi Figura 1 e discussione per consigli sulla modifica di queste impostazioni). </li><li> Fare clic su &#39;Ok&#39; nella finestra di messaggio che appare quando l&#39;analisi è completa. Vai alla posizione &#39;Default Output Folder&#39;, dove tutti i file di dati con i risultati vengono salvati come valori separati da virgole-(.csv) i file (Figura S2A). </li></ol> 3. Estrazione dei dati <ol><li> Trovare il nuovo file &#39;Nuclei.csv&#39;, che è inclusa tra iUscita dal Profiler cellulare. Questo file contiene i dati delle singole celle per fluorescenti intensità anticorpo nucleare, intensità DNA nucleare e valori del rapporto giornalista GFP-CDK2 (Figure 6A e S2A). NOTA: Numerosi laboratori vorranno elaborare questo tipo di dati in base alla natura dei loro saggi. Suggerito per i dati attuali è il gating delle cellule di ogni condizione di trattamento in base ai dati di anticorpi ei valori giornalista GFP-CDK2 utilizzando lo script Perl fornito &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Copiare il file script Perl fornito &#39;2_gate_classifier.pl&#39; nella stessa cartella del file di dati del &#39;Nuclei.csv&#39; (Figura S2A). Fare doppio clic sull&#39;icona per lo script Perl e, quando richiesto, digitare il nome completo del file di dati seguito da un &#39;.csv&#39; nome nome del file in cui le cellule devono essere recintato e infine i valori di gate per l&#39;anticorpofluorescenza e dati giornalista GFP-CDK2. NOTA: Come determinare principalmente impostazioni del gate e applicare questi per l&#39;analisi dei dati sono discussi di seguito nella sezione Dati rappresentativi e figura 6 (per analizzare i dati forniti utilizzo &#39;0.004&#39; e &#39;1.5&#39;, rispettivamente). Gli utenti Mac devono eseguire lo script Perl dalla riga di comando del terminale digitando: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Osservare il file appena creato, che unisce i valori grezzi singoli test cellule dai dati originali Profiler cellulare con etichette sub-popolazione che mostrano come ogni cellula da ogni pozzetto esegue contro entrambe le porte (Figura 6c). </li><li> Tracciare i dati per ogni condizione sperimentale utilizzando le singole etichette sottopopolazione di cellule aprendo il software rstudio. Fare clic su &#39;File&#39; e &#39;Apri File&#39;, quindi selezionare il file fornito &#39;analysis.r&#39;. Osservare i comandi per tracciare figure 6B, <strong&gt; 7 e 8 nella finestra superiore sinistra rstudio (Figura S2B). Nella finestra in alto a sinistra, tra i simboli doppi apici sulle linee 5 e 6, digitare l&#39;indirizzo del computer della cartella contenente i dati gated. Includere la lettera di unità e il nome del file stesso, rispettivamente, (ad esempio, &quot;C: / cartella di Analisi / output di analisi&quot; e &quot;nuclei_gated.csv&quot;). NOTA: Se rstudio viene utilizzato per la prima volta su un determinato computer, il pacchetto grafico R &#39;ggplot2&#39; dovrà essere installato prima. Questa è una volta solo passo per una nuova installazione di rstudio, dopo che questo passo diventa ridondante. Per installare &#39;ggplot2&#39;, fare clic sulla scheda denominata &quot;pacchetti&quot; sopra la finestra nell&#39;angolo in basso a destra della rstudio, fare clic sul pulsante &#39;Install Packages &quot;che appare sotto questo. Apparirà una nuova finestra. Tipo &#39;ggplot2&#39; (omettendo quotazioni) in &#39;pacchetti&#39; sritmo in questa nuova finestra e, infine, cliccare sul pulsante &#39;Install&#39; per chiudere la finestra, installare le funzioni ggplot2 necessarie e tornare alla finestra rstudio principale per continuare dal passaggio 3.6. </li><li> Evidenziare le linee da 1 a 17 nella finestra in alto a sinistra di rstudio, quindi fare clic sul pulsante &#39;Run&#39;. Ciò inserire i dati sperimentali, valori soglia e dettagli della posizione e in R (Figura S2C). R ora memorizzare temporaneamente i dati rilevanti per la stampa. </li><li> Evidenziare singoli blocchi di codice rimanente sotto la linea 17 e creare le trame corrispondenti facendo clic sul pulsante &#39;Run&#39; come prima. Osservare le trame nella finestra in basso a destra della rstudio e salvare il numero di formati facendo clic sul pulsante &#39;Export&#39; (Figura S2D). </li><li> Mentre la chiusura rstudio, fare clic su &#39;Non salvare&#39; quando richiesto. Questo impedisce la confusione sul prossimo utilizzo di rstudio, che altrimenti contenere datidalla sessione precedente. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11(2013).</li>
<li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li>
<li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content%2C+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692(2011).</li>
<li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692(2012).</li>
<li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li>
<li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+siRNA+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li>
<li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Damage+Foci.+Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pRB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li>
<li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+imaging+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li>
<li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchwartz%2C+RL+%22Learning+Perl+-+Making+Easy+Things+Easy+and+Hard+Things+Possible%22">Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible</a>. , 6th ed, O'Reilly Media. 1-363 (2011).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer. New York. 978-970 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Il flusso di lavoro descritto costituisce una procedura di perturbazione multipozzetto di cellule utilizzando siRNA, successiva rivelazione marcatore e infine uso di una serie di procedure del software supportato per facilitare l&#39;estrazione dei dati quantitativi risultanti dalle immagini al microscopio a fluorescenza. L&#39;approccio è focalizzato sulla consegna di valori di intensità nucleari e citoplasmatici per singole celle, che ha ampia applicazione pratica in molte applicazioni basati su celle. I dati di esempio utilizzati qui è stato generato in un ambiente schermo siRNA in cui due saggi fluorescenti per il transito ciclo cellulare fase G1 sono testati e correlati tornare a una misura più diretta biofisica del contenuto di DNA nucleare. L&#39;uso di un colorante fluorescente per DNA immagine DNA nucleare è un passo indispensabile nel processo di segmentazione dell&#39;immagine in quanto consente l&#39;identificazione delle singole cellule e la conseguente &#39;maschera Nuclei&#39; serve come punto di partenza per identificare corrispondente cytoplasmiregioni c. Il CDK2 giornalista GFP-tag, che è stabilmente espressa nelle cellule, dà una variabile ancora costantemente superiore segnale di fondo nel citoplasma con cui questo vano può essere delineata. La stessa analisi condotta dovrebbe essere applicabile all&#39;analisi degli eventi proteine ​​traslocazione con altri reporter fluorescenza legati adatti e la loro risposta alla perturbazione. Inoltre, sostituendo il reporter GFP-CDK2 con coloranti fluorescenti specifici citoplasma consentirebbe l&#39;uso alternativo di questo algoritmo per misurare le dimensioni del citoplasma e le dimensioni relative delle cellule nelle immagini. Un&#39;altra considerazione di progetto nella strategia di segmentazione dell&#39;immagine qui descritto è l&#39;uso di Profiler cellulare per fornire valori di intensità integrati per la quantificazione del DNA. Integrazione dell&#39;intensità valori per il DNA nucleare dati colorazione permettono di possibili variazioni nelle dimensioni nucleo, e rappresenta un fiammifero vicino per i profili di quantificazione vistoper propidio ioduro macchiato FACS dati. Tuttavia, l&#39;intensità integrata non può fornire uno strumento adeguato per valutare la funzione della proteina dove la concentrazione media, esemplificato da intensità media di antigene di fluorescenza, è biologicamente più rilevante rispetto alla quantità totale integrata di proteine ​​(e fluorescenza associata) all&#39;interno di un compartimento cellulare. Quindi significa valori di intensità sono stati utilizzati per la P-S780 RB1 e dati GFP. L&#39;opzione per alterare tra le due modalità (media o integrato) di valutazione dei dati si trova sul pannello &#39;ExportToSpreadsheet&#39; del software Profiler cella. Le impostazioni di analisi nel file 3_channels_pipeline.cppipe sono ottimizzati per le immagini del set di dati di esempio. Analisi di nuove immagini set con questo protocollo sarà necessario che i nomi dei file adottano la convenzione di denominazione sopra descritto (Figura 3). Inoltre, la sensibilità valori in base alla luminosità della colorazione del DNA nucleare e le soglie per lo sfondointensità dei nuovi set di immagini potrebbe essere necessario regolare all&#39;interno delle impostazioni Profiler cellulare. Dato il ruolo chiave della colorazione DNA contiene per costruire le varie maschere di segmentazione dell&#39;immagine, l&#39;applicazione di impostazioni di sensibilità corrette per questo canale è essenziale all&#39;analisi successo di nuovi dati di immagine con il software Profiler cellulare. Il file di impostazioni Profiler cellulare fornito (3_channels_pipeline.cppipe) contiene note su dei parametri più utili per adattare l&#39;analisi di nuovi dati. Queste note sono nella casella di testo nella parte superiore dello schermo nella finestra principale Profiler cellulare e includono una guida su come modificare le impostazioni di sensibilità e regolazione del numero di canali da analizzare. Come incriminato nella sezione protocollo 2.8, per testare le impostazioni per i nuovi dati di immagine può essere necessario per osservare la segmentazione delle immagini durante l&#39;analisi delle immagini cliccando aprire le icone &#39;occhio&#39; per ciascuno dei &#39;Identificare ... Objects fasi di protocollo (Figura S1D </strong&gt;). In particolare, la visualizzazione dei dati di immagine attraverso &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; mostrerà se la maschera Nuclei è identificato correttamente dalle immagini della colorazione DNA. Nella pagina software Profiler cellulare per il modulo &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;è il fattore di correzione soglia. Tentativi ed errori regolazione di questo valore sarà risolvere la maggior parte degli errori di riconoscimento nucleari. I valori di equilibrio del canale DNA contro l&#39;intensità di sfondo per ogni immagine. Valori del fattore di correzione Soglia cerniera circa 1, dove più grande di questo è più spinto (buono per le immagini chiare) e meno di 1 è indulgente (adatti per le immagini con meno contrasto tra la colorazione e lo sfondo). L&#39;uscita dei dati grezzi singola cella da Profiler cellulare può essere analizzata in vari modi per soddisfare le esigenze di altri studi. Qui è illustrato l&#39;uso di uno script Perl per applicare porte a due dei parametri misurati per cella al fine di assistere l&#39;estrazione tendenze biologiche dalla un datod permesso incrociato delle sottopopolazioni individuate con ulteriori misurazioni. Anche se è ugualmente possibile includere elementi di gating nell&#39;ambito della Profiler Cell, il percorso alternativo usato qui fornisce una maggiore flessibilità e velocità, in particolare se grandi insiemi di dati devono essere valutate. La fase più lenta nelle fasi di acquisizione post-immagine del protocollo attuale è la gestione del software Profiler cella. Profiler cellulare qui viene eseguito senza imporre porte per produrre un insieme di dati grezzi non-gated che può essere rianalizzato con conseguente script Perl più rapidamente e, se necessario, iterativamente con diversi valori di gate. Non tutti gli studi conoscere in anticipo i valori di gate adatti come questo può variare con reagenti in un dato insieme di dati, e potenzialmente nel tempo. E &#39;, quindi, consigliabile per generare istogrammi raffiguranti la distribuzione dei dati grezzi ottenuti da Profiler cellulare per i controlli positivi e le cellule mock-perturbate al fine di individuare idonei valu cancelloes per i parametri di interesse. Sono scritti Gli script Perl ad accettare una struttura della colonna rigidamente definito di dati da Profiler cellulare e può smettere di funzionare se un utente modifica il numero di uscita parametri Profiler cellulare utilizzando le impostazioni della &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Per contribuire ad attuare la modifica delle impostazioni note sono inclusi all&#39;interno dei file di script Perl. Per vedere questi visualizzare lo script in un editor di testo, preferibilmente editor di testo per programmatori impostata codice colore elementi Perl (ad esempio, http://www.activestate.com/komodo-edit). Queste note indicano dove per regolare lo script di adattarsi ai cambiamenti nel formato dei dati. Simile agli script Perl, il file R-codice fornito (analysis.r), che contiene le istruzioni per tracciare i dati dai dati di analisi di immagine, può essere letto in un editor di testo o software rstudio vedere note aggiuntive sull&#39;uso e l&#39;adattamento. Queste note possono essere completato con i dettagli sulle espressioni regolari e Perl &lt;sup&gt; 12 e il pacchetto ggplot2 13 per R, entrambi i quali formano la base per come i dati vengono letti, annotato e tracciati rispettivamente. Nuovi studi usando la microscopia a fluorescenza, nonché dati grezzi depositati con le pubblicazioni open source sono suscettibili di metodi di analisi, come quelle qui descritte. La natura stessa dei dati ad alta contenuto si presta ad analisi ricorsiva con accentuazioni diverse analitiche a seconda degli interessi di ricerca di ogni osservatore. Anche se le domande che possono essere poste dei dati sono limitati dalle sonde utilizzate originariamente, i dati delle immagini possono essere spesso significato rianalizzati oltre l&#39;ambito degli studi che le hanno generate.

Il lavoro qui presentato descrive l&#39;uso del software Profiler cella liberamente disponibili per eseguire ripartizione algoritmo guidata di immagini di microscopia a fluorescenza di cellule aderenti per identificare le singole cellule e regioni subcellulari definite. Questo approccio, denominato segmentazione di immagini, consente la successiva analisi multi-parametrica delle cellule immaginati quantificando marcatori fluorescente localizzate ad ogni cella o regione subcellulare (denominato oggetti segmentate). Questo flusso di lavoro costituisce la base per consentire l&#39;analisi ad alta contenuto e lo scopo di servire come uno strumento che può essere ulteriormente sviluppato e modificato per soddisfare multi-parametrica, analisi singola cellula in laboratorio senza accesso agli strumenti ad alto contenuto specializzati o software proprietario. I file forniti con questo manoscritto includono una serie di test di importanti dati di immagine grezzi, le impostazioni di algoritmo e script di supporto per generare l&#39;analisi descritto. La condizione impostazioni algoritmo fo Profiler cellulare sono ottimizzati per i set di dati di esempio ei dettagli sezione Discussioni quanto possono essere necessari aggiustamenti per consentire l&#39;uso dei dati di immagine provenienti da altri studi. Una volta dati quantitativi è stato estratto utilizzando Profiler cellulare, laboratori diversi possono avere esigenze diverse per come utilizzare le informazioni presentate dai valori delle celle individuali nei dati grezzi; mostrato qui è un approccio con cui porte vengono applicati ai dati grezzi per ogni test. Usando questi cancelli, i dati sono trasformati in termini binarie di risposta, consentendo la visualizzazione delle tendenze collegano diversi trattamenti con le sottopopolazioni di cellule in risposta definito dalle porte. Le porte sono impostati sulla base di osservazioni delle distribuzioni di dati ottenuti appropriati controlli negativi e positivi per ogni misura rilevante. L&#39;uso dei cancelli è solo un esempio di come gestire le misure, basati su celle prime. Anche qui mostrato è l&#39;uso di intensità DNA nucleare measurements nella loro forma grezza come un intervallo continuo di valori in combinazione con i dati gated. Altri approcci per la gestione dei dati di analisi di immagine devono essere considerati, a seconda della natura dello studio; alternative statistici all&#39;utilizzo cancelli per l&#39;assegnazione di celle a sottopopolazioni sono stati segnalati 2 e sistematiche confronto tra le strategie per riassumere i dati ad alta contenuto attraverso un gran numero di parametri sono stati segnalati 3. Analisi-alto contenuto di dati immagine hanno trovato impiego in studi cellulari di droga-risposta, invertire la genetica e stress ambientale segnalazione 4-6. Il merito di analisi ad alto contenuto di deriva dal fatto che l&#39;analisi algoritmica dei dati microscopia a fluorescenza permette parametri quantitativi e spaziali da considerare simultaneamente in singole celle 7. In questo modo, esiti cellulari per analisi multiple possono essere, comportamento differenziale incrociato dei test-dsottopopolazioni cellulari efined possono essere monitorati all&#39;interno di condizioni sperimentali e test possono includere la considerazione di variabili morfologiche. Il flusso di lavoro strategie e analisi discusso qui, come per altri approcci ad alto contenuto, sono in grado di fornire dati multiplex che sono riferimenti incrociati alle singole celle. Studi ad alto contenuto di metodi tuta che generano immagini al microscopio a fluorescenza e sono applicabili all&#39;analisi dei dati che vanno da decine di immagini prodotte in basso erogato microscopia convenzionale basato sulla fluorescenza attraverso le migliaia di immagini prodotte utilizzando piattaforme ad alto contenuto di screening automatizzati. Il flusso di lavoro è illustrata qui con i dati di esempio da cui test separati sono misurate in termini di intensità sia marcatori fluorescenti nucleari o traslocazione citoplasmatica / nucleare di una proteina reporter fluorescente, rispettivamente. Il flusso di lavoro è flessibile in quanto questi saggi possono essere considerati separatamente o in combinazione seconda each dato domanda di ricerca da diversi ricercatori. I dati di esempio sono prodotti come parte di una interferenza dell&#39;RNA (RNAi) esperimento (Figura 1). Piccoli oligonucleotidi RNA interferenti (siRNA) vengono utilizzati per atterramento specifiche proteine ​​in cellule di carcinoma colorettale umano HCT116 che danno luogo a cambiamenti per due reporter fluorescenti di chinasi (CDK) attività di ciclina-dipendente. La fosforilazione CDK6-dipendente della proteina retinoblastoma nucleare di serina 780 (P-S780 RB1) è valutata con anticorpi colorazione. Nelle stesse cellule, una proteina fluorescente-tag giornalista verde di attività CDK2 (GFP-CDK2 giornalista) è valutata dal nucleare rapporto citoplasmatica dove in assenza di attività CDK2 reporter risiede nel nucleo e su navette attivazione CDK2 nel citoplasma 8. Inoltre, il DNA nucleare di ciascuna cella viene tinto con un colorante-DNA intercalanti, Bisbenzimide, che serve come mezzo per identificare le cellule e definire i confini nuclei nelle immagini così unmisura sa dell&#39;abbondanza DNA fornire informazioni sulla posizione del ciclo di cella della cella (Figura 2). Le attività di CDK2 e CDK6 sono rilevabili come cellule transito da G1 alla fase S del ciclo cellulare 5 e succedono 9,10 e, come tale, stretta concordanza tra i due reporter in cellule singole è previsto. L&#39;insieme di dati di dimostrazione qui utilizzato analizza come esempio l&#39;effetto di siRNA obiettivi CDK6, proteina retinoblastoma (RB1) e un controllo negativo non-targeting (Tabella 1). Knockdown di CDK6 deve provocare sia una diminuzione della RB1 epitopo P-S780 e un accumulo di cellule in fase G1 del ciclo cellulare. Il knockdown RB1 serve da controllo reattivo per la specificità dell&#39;anticorpo fosfo-S780. Immagini al microscopio a fluorescenza da formalina fisso 11, colture cellulari HCT116 fluorescenti colorate vengono utilizzati per l&#39;analisi delle immagini algoritmica. I dati numerici risultante viene quindi utilizzato perriferimento incrociato i giornalisti e misurare l&#39;impatto dei diversi stati atterramento. La dimensione potenziale dei dati prodotti da questo tipo di analisi può presentare una sfida per normali strumenti di analisi. Ad esempio, i dati delle celle individuali possono essere più grandi di alcuni software foglio ospiterà. Incluso sono script Perl che eseguono semplici, altamente ripetitivo, lavorazione sotto la supervisione dei dati per aiutare l&#39;analisi di grandi set di dati. Gli script Perl sono scritti appositamente per i file di output prodotti da cellule Profiler, durante l&#39;elaborazione di file di immagini con una specifica convenzione di denominazione dei file (Figura 3), e consentono un numero variabile di campi per bene da utilizzare nell&#39;analisi. Spesso è importante dati del saggio cancello singola cella per monitorare tendenze sottopopolazioni di cellule 5 e qui illustrato è l&#39;uso di uno script Perl per contrassegnare ogni cella basata su un cancello insieme predeterminato per ogni tipo di saggio. Sono inclusi anche gli script opzionali Perlche riassumono l&#39;esito dei dati per i singoli pozzi (o condizioni), offrendo: percentuale di cellule all&#39;interno del cancello set ed i valori medi dei punteggi del test grezzi. Quest&#39;ultimo modo più omogenea visualizzazione dati, vale dove risposte influenzano tutti o la maggior parte delle cellule all&#39;interno di un pozzo. Come discusso sopra, tale valutazione è meno utile di quello previsto dalla persona gating dati cella in cui la risposta si limita a un sottogruppo di cellule all&#39;interno di una popolazione. L&#39;utilità del flusso di lavoro descritto non è limitato alle perturbazioni da siRNA o saggi marcatori descritti. Gli studi hanno utilizzato questo approccio per saggiare le risposte in tessuto esperimenti di coltura utilizzando combinazioni di siRNA, inibitori chimici e trattamento con radiazioni e per la valutazione dei marcatori diversi CDK6 e l&#39;attività CDK2 5. Concettualmente, la strategia sperimentale permette una varietà di regioni subcellulari biologicamente utili da registrare automaticamentein singole cellule presenti nelle immagini al microscopio a fluorescenza. Come tale, questo approccio può produrre, dati multiplex rivelare informazioni biologiche quantitative che possono perdere attraverso tecniche che si concentrano sulle popolazioni piuttosto che singole celle. Con piccole modifiche, il flusso di lavoro di avvicinamento e di analisi descritto può produrre, i dati delle singole celle quantitativi per le uscite di analisi basate sulla fluorescenza e le risposte delle cellule-biologica, in cui la valutazione quantitativa del contenuto di DNA, la quantificazione della fluorescenza nucleare o citoplasmatica o la spola di marcatori tra queste due scomparti singolarmente o in modo multiplex è di interesse. Come requisiti editrici tendono sempre più verso la presentazione dei dati grezzi apertamente accessibili, l&#39;accesso e la familiarità con strumenti gratuiti per l&#39;analisi di immagini di microscopia, come quelle descritte qui sarà anche di diretto interesse per i laboratori in cerca di rianalizzare i dati pubblicati.

<table><tbody><tr><td>AllStars siRNA a controllo negativo</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>SiRNA a controllo negativo.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Sintesi personalizzata</td><td>NA</td><td>Sequenza antisenso: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Sintesi personalizzata</td><td>NA</td><td>Sequenza antisenso: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x tampone siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Da diluire con acqua priva di nucleasi, non trattata con DEPC.</td></tr><tr><td>Acqua priva di nulcease (non-DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>Per la diluizione del tampone siRNA.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Lipidi di trasfezione.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>il piruvato e i terreni di coltura tissutale integrati ad alto contenuto di glucosio.</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti per la miscelazione parallela e compartimentalizzata di complessi di trasfezione.</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>piastra TC a 96 pozzetti con base ottica su cui le cellule vengono trasfettate, coltivate, fissate e infine visualizzate. Fornito con guarnizioni per piastre adesive opache, che vengono utilizzate durante lo stoccaggio delle lastre usate.</td></tr><tr><td>Membrana traspirante</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Membrana adesiva sterile, permeabile ai gas.</td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra, fissativo</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% formalina (4% formaldeide) utilizzato puro nel protocollo.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Detergente</td></tr><tr> non ionico<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma base (tris(idrossimetil)amminometano)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Per soluzione di lavaggio delle piastre.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-P-S780 RB1</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Coniglio monoclonale</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito in modo incrociato, marcato in fluorescenza.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimmide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Colorante fluorescente, intercalante della cromatina, colorante al DNA.</td></tr><tr><td>Soluzione di permeabilizzazione</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1% Triton X-100 in soluzione salina tamponata con Tris da 50 mM, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio per piastre</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Soluzione salina tamponata con tris contenente lo 0,1% di Tween-20.</td></tr><tr><td>Blocco della soluzione</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5% di latte in polvere in soluzione salina tamponata con Tris e 0,1% di Tween-20. Per il blocco della piastra prima dell'immunocolorazione e della diluizione degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>l'ambiente di programmazione R</td><td>Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro per high-contenuti, quantificazione singola cella di fluorescenti marcatori da universal microscopio dati, supportati da open source software

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

I progressi nella comprensione dei meccanismi di controllo che disciplinano il comportamento delle cellule in coltura di tessuti aderenti modelli mammiferi stanno diventando sempre più dipendenti dalle modalità di analisi singola cellula. Metodi che forniscono i dati compositi che riflettono i valori medi dei biomarcatori di popolazioni cellulari rischiano di perdere dinamiche sottopopolazione che riflettono l&#39;eterogeneità del sistema biologico studiato. In linea con questo, gli approcci tradizionali vengono sostituiti da, o supportati con forme più sofisticate di test cellulari sviluppati per consentire la valutazione al microscopio ad alto contenuto. Questi test potenzialmente generare un gran numero di immagini di biomarcatori fluorescenti, che hanno permesso accompagnando pacchetti di software proprietario, consente per le misure multi-parametriche per cella. Tuttavia, i costi relativamente elevati di capitale e superspecializzazione di molti di questi dispositivi hanno impedito la loro accessibilità a molti ricercatori. Descritto qui è unworkflow universalmente applicabili per la quantificazione di più intensità marcatori fluorescenti da specifiche regioni subcellulare di cellule singole adatti per l&#39;uso con le immagini dalla maggior parte microscopi a fluorescenza. La chiave di questo flusso di lavoro è l&#39;implementazione del software Profiler cellulare liberamente disponibile da 1 a distinguere le cellule individuali in queste immagini, li segmento in regioni subcellulari definite e fornire intensità marcatore di fluorescenza valori specifici di queste regioni. L&#39;estrazione dei singoli valori di intensità di cellule dai dati immagine è lo scopo centrale di questo flusso di lavoro e verrà illustrato con l&#39;analisi dei dati di controllo da una schermata di siRNA per G1 regolatori checkpoint in cellule umane aderenti. Tuttavia, il flusso di lavoro qui presentata può essere applicato all&#39;analisi dei dati da altri mezzi perturbatori cellulare (per esempio, schermi composti) e altre forme di marcatori cellulari fluorescenza base e quindi dovrebbe essere utile per una vasta gamma di laboratori.

Presentato è un flusso di lavoro flessibile, l&#39;informatica che consente l&#39;analisi di immagini basata multiplex di cellule fluorescente. Il flusso di lavoro quantifica marcatori nucleari e citoplasmatici e calcola marcatore traslocazione tra questi compartimenti. Le procedure sono previste per la perturbazione di cellule utilizzando siRNA e metodologia affidabile per il rilevamento marcatore mediante immunofluorescenza indiretta in formati da 96 pozzetti.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare oggettivamente le risposte delle singole cellule quantificando specifiche intensità di marcatori fluorescenti dalle immagini del microscopio. Ciò si ottiene sottoponendo prima una cellula di coltura tissutale aderente al knockdown genico mediato da irna. Nella seconda fase, le cellule vengono colorate in modo fluorescente e quindi sottoposte a imaging per diversi marcatori di interesse.Nella fase finale, l'espressione dei marcatori all'interno di specifiche regioni subcellulari è definita algoritmicamente, sono singole cellule. In definitiva, le risposte cellulari ai segnali biologici da knockdown genico possono essere analizzate misurando i livelli di espressione fluorescente dei marcatori di interesse e la loro traslocazione subcellulare. Sebbene questa procedura fornisca informazioni sulla regolazione del transito del ciclo cellulare G one in risposta ai siRNA.Può anche essere applicato a studi che generano immagini cellulari fluorescenti, studiando il trasporto nucleare e l'omeostasi delle proteine. A dimostrare la procedura saranno Daniel Wek e Car K HO, colleghi postdoc del mio laboratorio. Iniziare dispensando 70 microlitri di irna 200 nanomolari, diluito un tampone irna nei pozzetti appropriati di una piastra sterile da 96 pozzetti in una cappa sterile per coltura tissutale. Quindi aggiungere 105 microlitri di lipide di trasfezione diluito in 40 volumi di terreno DMEM libero dal siero in ciascun pozzetto di sir e mescolare la piastra mediante una leggera vibrazione della temperatura ambiente, quindi dopo 10 minuti, suddividere i 175 microlitri risultanti in tre repliche da 50 microlitri per bersaglio in una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale opaca con una base trasparente.Successivamente, erogare 8.000 cellule per pozzetto in 150 microlitri di DMEM con il 10% di siero direttamente sui complessi lipidici di irna da 50 microlitri senza mescolare. Quindi sigillare la piastra con una membrana traspirante adesiva sterile e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo, aspirare il fluido dalle piastre.Quindi fissare le cellule in 100 microlitri di formaldeide tampone al 4% in una cappa aspirante a temperatura ambiente Dopo 10 minuti, aspirare il fissativo ed eseguire tre lavaggi da 100 microlitri con PBS dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il PBS e perforare le cellule con tre cicli di incubazione della soluzione di permeazione da 100 microlitri di 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente senza agitare. Dopo l'ultima incubazione, rimuovere la soluzione di permeazione e quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione in blocco per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi aspirare la soluzione a blocchi e sondare le cellule con 50 microlitri dell'anticorpo primario di interesse entro due settimane dalla marcatura del microscopio confocale uc con un obiettivo 20 x per acquisire immagini TIFF separate in scala di grigi a 16 bit in tre canali corrispondenti al colorante DNA GFP e alla colorazione immunologica. I Flora fours catturano molti set di immagini o fotogrammi non sovrapposti per visualizzare circa 1000-2000 cellule per pozzetto. Denominazione sistematica del file immagine con le informazioni sui metadati in modo che ogni nome di file sia una combinazione univoca di nome dell'esperimento, indirizzo del pozzo, numero di frame e identificatore del canale.Quindi aprire il software del profilatore di celle e fare clic su file e importare la pipeline. Successivamente, in da file, selezionare il file file CP pipe della pipeline a tre canali, che contiene le istruzioni necessarie per il software per interpretare i metadati del file immagine dal nome file salvato Convention Cell Profiler può ora essere utilizzato per correlare le immagini, estrarre il DNA nucleare e le intensità degli anticorpi dai file e utilizzare il canale GFP per calcolare il rapporto tra l'intensità nucleare e quella del citoplasma. Per ogni cella rilevata, fare clic sul pulsante Visualizza impostazioni di output, quindi fare clic sulle cartelle di input e output predefinite.Selezionando rispettivamente la posizione dei file immagine per l'analisi e la destinazione dei dati estratti. Quindi, nella finestra dei moduli di analisi, fare clic sulle icone a forma di occhio appropriate per osservare le finestre di identificazione degli oggetti primari e degli oggetti terziari durante l'analisi e fare clic su analizza immagini al termine dell'analisi. Fare clic su OK nella finestra di messaggio e passare alla cartella di output predefinita Percorso in cui tutti i file di dati vengono salvati come file con valori separati da virgole.Per eseguire l'estrazione dei dati, trovare il nuovo file CSV dei nuclei incluso nell'output del profilatore cellulare, che contiene i dati delle singole cellule per l'intensità degli anticorpi nucleari fluorescenti, l'intensità del DNA nucleare e i valori del rapporto reporter a due percentuali GFP CDK. Copiare il file di script del polso fornito nel classificatore dell'andatura PL nella stessa cartella del file di dati CSV dei nuclei. Quindi fare doppio clic sull'icona di Pearl Script.Quando richiesto, digitare il nome completo del file di dati seguito da un nome di file CSV DOT per il file in cui le cellule devono essere controllate e i valori di gate per la fluorescenza dell'anticorpo e i dati del reporter G FP CDK two. Verificare che il file appena creato combini i valori grezzi del saggio delle singole cellule dal profilo cellulare originale dei dati con le etichette delle sottopopolazioni che mostrano le prestazioni di ciascuna cella di ciascun pozzetto rispetto a entrambi i cancelli. Ora apri il software R Studio per tracciare i dati per ogni condizione sperimentale utilizzando le etichette delle singole sottopopolazioni cellulari facendo clic su File e Apri file, quindi selezionando il file dot r di analisi fornito.Digitare l'indirizzo del computer della cartella contenente i dati gestiti, inclusa la lettera dell'unità e il nome del file stesso. Quindi evidenzia le righe da uno a 17 nella finestra in alto a sinistra del nostro studio e fai clic sul pulsante Esegui per inserire i valori di soglia dei dati sperimentali e i dettagli sulla posizione del pozzo. Infine, evidenzia i singoli blocchi del codice rimanente sotto la riga 17 e fai clic sul pulsante Esegui per creare i grafici corrispondenti.Osserva i grafici nella finestra nell'angolo in basso a destra del nostro studio, quindi fai clic sul pulsante di esportazione per salvarli in una varietà di formati. Il flusso di lavoro qui descritto analizza le immagini del microscopio a fluorescenza per produrre dati grezzi sotto forma di un elenco dettagliato di ciascuna cellula identificata e dei relativi valori di analisi. Esistono molte opzioni per l'analisi di questi dati.Ad esempio, in questi grafici a istogramma, i valori del saggio per le cellule trattate con RNA di controllo consentono l'identificazione delle porte appropriate per la soglia di ciascun test. Le soglie di gating vengono quindi applicate utilizzando uno script a impulsi per etichettare ogni cellula nei dati grezzi in base al risultato del saggio. Questo approccio di etichettatura aiuta la valutazione visiva preliminare e automatizzata delle relazioni tra i trattamenti e la distribuzione della sottopopolazione di insiemi anche molto grandi di dati di singole cellule.Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, le condizioni di knockdown di tre irna hanno portato a distribuzioni contrastanti delle cellule rispetto ai gate dei due saggi. I grafici R utilizzano le etichette per calcolare le distribuzioni percentuali delle celle in ciascun quadrante. Le etichette consentono inoltre di incrociare ulteriori misurazioni fluorescenti con i dati del saggio.In questo esperimento, le sottopopolazioni di cellule trattate con SI CDK 6 sono state raggruppate in base alle rispettive etichette di saggio e tracciate come istogrammi di colorazione del DNA nucleare. L'uso delle etichette dei dati cellulari rivela la relazione tra i due saggi cellulari e il contenuto di DNA nelle cellule. Quando si esegue questa procedura, è sempre importante ricordare di testare e regolare i parametri di segmentazione dell'immagine quando si utilizza il profilatore di celle.Ciò è particolarmente importante quando si utilizzano per la prima volta file immagine nuovi o non testati. Ok.

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per studiare la dinamica della popolazione eterologica in risposta alle perturbazioni. Questo manoscritto descrive una piattaforma basata sull'immagine che produce set di dati quantitativi per la caratterizzazione simultanea di molteplici fenotipi cellulari di popolazioni eterellulari in modo robusto.

Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

Qui descriviamo un protocollo per la segmentazione automatica dei tessuti fluorescente contrassegnati su diapositive utilizzando un sistema di analisi ad alto contenuto di widefield (WHCAS). Questo protocollo ha vaste applicazioni in qualsiasi campo che coinvolge la quantificazione di marcatori fluorescenti in tessuti biologici, tra cui le scienze biologiche, ingegneria medica e scienze della salute.

Scansione automatizzata Slide e segmentazione nei tessuti fluorescente-identificati utilizzando un sistema di analisi di Widefield ad alto contenuto

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

Questo articolo descrive i metodi passo dopo passo per automatizzare la quantificazione dei nuclei basata su immagini utilizzando un programma eseguibile open source convalidato in una gamma di densità cellulari. Questo programma fornisce un'alternativa che affronta le barriere relative ai costi, all'accessibilità per gli utenti con competenze tecnologiche limitate e alla convalida specifica dell'applicazione che può limitare l'utilità delle tecnologie esistenti.

Utilizzo delle librerie di visione artificiale per semplificare la quantificazione dei nuclei

Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Scopri un flusso di lavoro informatico per l'analisi di immagini multiplex di cellule fluorescenti. Utilizza Cell Profiler e R Studio per quantificare marcatori nucleari e citoplasmatici e analizzare la loro traslocazione subcellulare.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software (Video) | JoVE Journal

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Esplora altri video