Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

L'obiettivo generale di questa dimostrazione è confrontare tre diversi saggi di proliferazione cellulare e presentare i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro, come l'uso del metodo di proliferazione cellulare più appropriato. La preparazione di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi dell'imager cellulare sono difficili da imparare.

Richiedono di concentrarsi sulle cellule prima di applicare la maschera di conteggio delle cellule appropriata. Per iniziare questa procedura, coltivare due linee cellulari MCF-7 per tre giorni fino alla confluenza dal 75 all'80% nelle fiasche di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati utilizzando DMEM privo di rosso fenolo. Dopo tre giorni, rimuovere le cellule dai palloni versando il terreno in un contenitore per rifiuti.

Quindi, lavare immediatamente lo strato cellulare con due millilitri di tripsina preriscaldata due volte. Aspirare la tripsina e aggiungere altri due millilitri di tripsina preriscaldata allo strato cellulare prima di metterla in un'incubatrice. Una volta che le cellule si sono staccate, lavatele con 10 millilitri di DMEM fresco riscaldato integrato.

Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, aspirare con cura e smaltire il surnatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di DMEM fresco integrato.

Per eseguire una conta cellulare, diluire 100 microlitri di sospensione cellulare in 900 microlitri di una volta per DPBS. Quindi, posizionare un nuovo sensore da 60 micrometri sul contatore automatico di cellule. Tenere premuto lo stantuffo e immergere il sensore nella sospensione a celle diluite.

Rilasciare lentamente lo stantuffo sul contacelle. Quindi, al termine, rimuovere il sensore dal contatore di celle. Seminare le cellule in un volume finale di 100 microlitri in una piastra a 96 pozzetti a circa il 20% di confluenza per lasciare spazio per la crescita cellulare e la misurazione della proliferazione nell'arco di tre-cinque giorni.

Per determinare la conta cellulare utilizzando un emocitometro, preriscaldare sia il terreno che la tripsina a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari, in un forno o in un bagnomaria. Quindi, aspirare il terreno dalle cellule in un contenitore per rifiuti. Quindi, lavarli una volta con 30 microlitri di tripsina due volte e aspirare nuovamente il terreno nel contenitore dei rifiuti.

Successivamente, lavare nuovamente le cellule con 30 microlitri di tripsina due volte e incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Picchiettare delicatamente il bordo della piastra per rimuovere le cellule. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di DMEM integrato e mescolare le cellule mediante pipettaggio fino a formare una sospensione a singola cellula.

Posizionare il vetrino di copertura sulle camere di conteggio e fissarlo fino a quando gli anelli di rifrazione di Newton non sono visibili tra i bordi del vetrino e l'elocitometro. Quindi, pipettare delicatamente 20 microlitri di sospensione cellulare sotto il vetrino coprioggetto e lasciare che la camera di conteggio venga riempita con movimento capillare. Successivamente, visualizza le camere di conteggio nel layout a griglia con un ingrandimento di 10x.

In questa procedura, scongelare il reagente di luminescenza in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 30 minuti. Capovolgere delicatamente la bottiglia per ottenere un impasto omogeneo. Quindi, equilibrare una piastra di cellule seminate a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di reagente di luminescenza a ciascun pozzetto. Mescolare il contenuto su uno shaker orbitale per due minuti. Quindi, lasciare incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.

Per impostare un esperimento di luminescenza utilizzando il software del lettore di piastre multimodale, accendere il lettore di piastre multimodale e aprire il software. In Gestione attività selezionare Esperimenti e Crea nuovo. Quindi, seleziona File dalla barra degli strumenti laterale e, nella scheda Protocollo, seleziona Procedura.

Quindi, seleziona Greiner 96 a fondo piatto come tipo di piastra e seleziona la casella Usa coperchio. Selezionare l'azione Leggi nella casella Metodo di lettura. Quindi, selezionare Luminescenza come metodo di rilevamento e fare clic OK.In casella Leggi passo, selezionare i pozzetti da scansionare nella scheda Piastra piena e selezionare i pozzetti che fungono da pozzetti vuoti.

Impostare il set di filtri su Filtro vuoto. Impostare il guadagno su 135, con un tempo di integrazione di 5 secondi per pozzetto e un'altezza di lettura di 6,5 millimetri. Fare clic su OK per salvare le impostazioni per la lettura della luminescenza.

Per eseguire una lettura della luminescenza, espellere il portatarga selezionando la scheda Instrument Control (Controllo strumento) e fare clic su Plate out (Uscita piastra). Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra, assicurandosi che il coperchio sia inserito. Chiudere il portatarga facendo clic su Plate In (Piastra di ingresso) nella scheda Instrument Control (Controllo strumento).

Quindi, fai clic su Leggi ora nella barra degli strumenti per eseguire una lettura luminescente. Successivamente, esporta le misurazioni RLU per ciascun pozzetto in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Per impostare un esperimento di imaging cellulare, accendere l'imager cellulare multimodale e aprire il software.

In Task Manager, seleziona la scheda Esperimenti e Crea nuovo. Sulla barra degli strumenti File, fare clic sulla scheda Protocollo, quindi sulla scheda Procedura. Selezionare l'azione Imposta temperatura.

Impostare l'incubatrice su On e impostare la temperatura su 37 gradi Celsius. Selezionare Preriscaldamento, quindi fare clic su OK per salvare le impostazioni. Quindi, seleziona l'azione Leggi.

Fare clic su Immagine come metodo di rilevamento. Quindi, selezionare il tipo di lettura Endpoint/Cinetica e il tipo di ottica Filtri, quindi fare clic su OK. Successivamente, fare clic sulla scheda Piastra completa e selezionare i pozzetti sulla piastra da riprendere. Fare clic su OK per salvare le impostazioni.

Ora seleziona l'obiettivo 2,5 volte dall'opzione Obiettivi a discesa. Nella scheda Canali, selezionare GFP 469.525 e Campo chiaro. Controllare l'esposizione automatica per entrambi i canali e selezionare l'area dell'esposizione automatica.

Per determinare le impostazioni di messa a fuoco automatica, fare clic su Opzioni. Per le opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare il metodo Scansione e quindi la messa a fuoco automatica. Fare clic su OK per salvare le impostazioni.

Successivamente, impostare l'offset orizzontale e verticale dal centro del pozzo su zero. Selezionare questa opzione per eseguire la scansione di più immagini per pozzetto in un montaggio tre per due. Quindi, fare clic su OK per salvare le impostazioni della procedura.

Per leggere l'esperimento sulla piastra selezionata, fare clic sulla scheda Controllo strumento e selezionare la funzione Plate Out. Posizionare una piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra, assicurandosi che il coperchio sia inserito. Nella scheda Controllo strumento, selezionare la funzione Plate In.

Quindi, seleziona Leggi ora dalla scheda della piastra e ripeti la lettura ogni 24 ore, fino a 96 ore dopo la semina. Per analizzare un'immagine, fare clic sulla scheda Dati sulla lastra impartita e selezionare Immagine GFP 469, 525 più Campo chiaro. Quindi, fai doppio clic sul pozzetto dell'immagine.

Ora, fai clic su un'immagine caricata. Selezionare Analizza, quindi selezionare la singola immagine del montaggio da analizzare. Quindi, fai clic su OK. Successivamente, controllare solo il canale GFP e impostare i parametri come descritto nella Tabella 3.

Successivamente, fai clic su Avvia per applicare i parametri alle celle visualizzate. Osservare la maschera di conteggio delle cellule posizionata sopra le celle visualizzate, che viene utilizzata per determinare il conteggio delle cellule per immagine. Fare clic su Applica modifiche e mantenere queste impostazioni per ogni lastra di cui viene creata l'immagine durante l'esperimento.

In questa figura, è stata eseguita un'analisi di regressione lineare per confrontare le relazioni correlate tra i diversi metodi esaminati per misurare la proliferazione cellulare nelle cellule MCF-7-LeGO e nelle cellule MCF-7-delta 40p53. È stato calcolato un coefficiente di correlazione di Pearson e la significatività è stata determinata tra i diversi metodi di misurazione della proliferazione cellulare. La correlazione più forte è stata osservata tra il confronto del test basato sulla luminescenza e l'imager cellulare.

Qui sono mostrate le immagini rappresentative delle cellule di carcinoma mammario MCF-7-LeGO e MCF-7-delta 40p53 GFP positive catturate utilizzando l'imager cellulare ogni 24 ore fino a quando le cellule raggiungono quasi il 100% di confluenza. Questo metodo fornisce informazioni cellulari utili, tra cui la possibilità di monitorare visivamente la crescita cellulare per più giorni e confrontare le dimensioni e la morfologia cellulare tra diverse linee cellulari. Qui viene mostrato un riepilogo dei vantaggi e degli svantaggi di ciascun metodo testato, che dimostra la versatilità di ciascuno dei metodi e aiuterà i lettori a scegliere il metodo più appropriato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di tre diversi saggi di proliferazione cellulare e dovresti essere in grado di determinare quale si adatta meglio al tuo progetto sperimentale.