Name: Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Scopri il confronto tra tre metodi di proliferazione cellulare nelle linee MCF-7 di cancro al seno. Questo protocollo dettagliato aiuta i ricercatori a scegliere l'assay più appropriato per i loro studi.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Hamish Campbell e il Prof. Antony Braithwaite per il loro aiuto nello sviluppo delle linee cellulari trasdotte MCF-7-LeGO. Vorremmo riconoscere il nostro sostegno finanziario da parte della Bloomfield Group Foundation attraverso l'Hunter Medical Research Institute. BCM è supportato da una borsa di studio APA attraverso l'Università di Newcastle e dalla borsa di studio MM Sawyer attraverso l'Hunter Medical Research Institute.

1. Le cellule Preparazione per la proliferazione Assays Nota: Preparare due linee cellulari nello stesso modo e sementi nello stesso formato per ciascun metodo da analizzare. <ol><li> Grow MCF-7-Lego e MCF-7-Δ40p53 7 celle al 75-80% di confluenza nel T 75 cm 2 di tessuto fiasche di coltura usando fenolo-rosso libero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 200 mM L-glutammina, 2 ug / ml di insulina e 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% di CO 2. Maneggiare le celle di una sicurezza biologica sterile armadietto di classe II. Nota: La quantità di tempo necessario per crescere le cellule a confluenza varia a seconda della diluizione semina. In preparazione per la placcatura le cellule per i saggi di proliferazione, seminare le cellule a una diluizione 1: 3 integrato DMEM e mantenere in condizioni di crescita normali per 3 giorni fino a 75-80% di confluenza. </li><li> Per rimuovere le cellule dal pallone, versare fuori i media inun contenitore per rifiuti. Lavare immediatamente lo strato di cellule con 2 ml di tripsina 2x pre-riscaldato. Aspirare tripsina. Aggiungere altri 2 ml di tripsina preriscaldata al livello cellulare e posto in un incubatore per 5 min a 37 ° C con 5% di CO 2. <ol><li> Una volta che le cellule si staccano, lavare le cellule con 10 ml riscaldato fresco integrati DMEM. Trasferire la sospensione cellulare ad una sterile tubo 15 ml e centrifugare a 491 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Con attenzione aspirare e smaltire il surnatante. </li></ol></li><li> Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di fresco INTEGRAZIONI DMEM. Eseguire un numero di celle per determinare la densità giusta per seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti. <ol><li> Diluire 100 ml di sospensione di cellule in 900 ml di 1x Dulbecco tampone fosfato (DPBS). Posizionare un nuovo sensore 60 micron sul bancone delle cellule automatizzato. Tenere premuto il pistone e immergere il sensore nella sospensione cellulare diluita. Rilasciare lentamente lo stantuffo sul bancone cellulare. Rimuovere il sensore dalla cella di counter una volta completato. Nota: Il numero di celle viene visualizzato sul contatore delle cellule in cellule / ml. </li></ol></li><li> Cellule seme in un volume finale di 100 microlitri (in DMEM) in una piastra a 96 pozzetti a ~ 20% di confluenza di consentire camera per la crescita cellulare e la misurazione della proliferazione in 3-5 giorni (vedi Tabella 1). Seed tutte le linee cellulari in triplice copia. Nota: Per questo esperimento, tre diverse densità di cellule sono state valutate per determinare la densità cellulare ottimale. I numeri di cellule necessarie sono riassunti nella Tabella 1. Le cellule Seed ad una densità inferiore se è richiesta la misurazione di crescita più lungo termine. <ol><li> Per l&#39;emocitometro e saggi luminescenza-based, preparare un piatto per ogni punto di tempo (vale a dire 4 piastre per test). Per il saggio imager cellule, solo preparare una piastra per la durata dell&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. </li></ol> 2. Determinazione conte delle cellule USing un emocitometro <ol><li> Pre-calda sia medio e tripsina a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare, forno o bagnomaria. supporti Aspirare da cellule in un contenitore per rifiuti, lavare una volta con 30 ml di tripsina 2x, e aspirare la tripsina. </li><li> Lavare le cellule di nuovo con 30 ml di tripsina 2x, e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Battere delicatamente bordo della piastra per rimuovere le cellule dalla piastra. Aggiungere 50 ml di DMEM integrato e mescolare le cellule pipettando fino a quando le cellule formano una sospensione singola cella. </li><li> Preparare emocitometro per metri quadrati e copertura in vetro di pulizia con il 70% di etanolo. </li><li> Posizionare il vetro di copertura antiscivolo su camere di conteggio e apporre fino a quando può essere visto &#39;anelli di rifrazione di Newton&#39; tra i bordi di copertura antiscivolo e l&#39;emocitometro. Nota: Queste indicano che la copertura antiscivolo ha correttamente aderito alla emocitometro. </li><li> pipetta delicatamente 20 ml di sospensione cellulare sotto la copertura antiscivolo, riempiendo la camera di conteggio dal movimento capillare.Mettere emocitometro a 10 ingrandimenti di un microscopio e visualizzare le camere di conteggio nel layout a griglia. </li><li> Contare le celle nelle 4 caselle esterne del layout della griglia. Per migliorare la precisione, ripetere i conteggi delle piazze esterne aggiuntivo, se necessario, o fino a quando il conteggio ha raggiunto 70 - 100 cellule 14,15. <ol><li> Calcolare la concentrazione delle cellule per ml come segue: numero medio di cellule per il fattore di diluizione quadrato x (se utilizzato) x 10 4 </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,8 ogni 24 ore per 96 ore post-semina. </li></ol> 3. Determinare la proliferazione delle cellule usando un test a base di luminescenza Nota: Questa è una misura endpoint. Una volta che il reagente viene aggiunto alle cellule, la piastra può essere quantificato solo una volta. <ol><li> Scongelare reagente luminescenza a bagnomaria C 22 ° per 30 min. </li><li> Mescolare delicatamente il reagente capovolgendo il flacone per ottenere un impasto omogeneo. </li><li> Equilibrare un piatto di cellule seminate (dal punto1.5) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di reagente di luminescenza per ogni pozzetto. Mescolare il contenuto su un agitatore orbitale per 2 minuti. Lasciare piastra per incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Impostazione di un esperimento di luminescenza utilizzando il software lettore di piastre multi-mode. <ol><li> Accendere lettore di piastre multi-mode e aprire il software. Nel &#39;task manager&#39;, selezionare &#39;esperimenti&#39; e &#39;creare new&#39;.Select&#39; file &#39;dalla barra degli strumenti laterale, e sotto&#39; protocollo &#39;scheda, selezionare&#39; procedura &#39;. </li><li> Seleziona &#39;Grenier 96 fondo piatto&#39; del tipo a piastre, e selezionare la casella &#39;uso del coperchio&#39;. Selezionare l&#39;azione &#39;leggere&#39; in scatola &#39;metodo di lettura&#39;. Seleziona metodo di rilevazione &#39;luminescenza&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Nella casella fase di lettura, selezionare i pozzi da sottoporre a scansione nella scheda &#39;piatto pieno&#39;, e selezionare i pozzi di agire come pozzi vuoti. </li><li> Impostare il filtro impostato filtro vuoto (ad esempio, la spina, Em: il foro, specchio: nessuno). Impostare il guadagno135, con un tempo di integrazione di 0,5 sec per pozzetto e un&#39;altezza lettura di 6,5 mm. Fare clic su &#39;OK&#39; per salvare le impostazioni per la lettura luminescenza. </li></ol></li><li> Esecuzione di un luminescenti Leggi <ol><li> Espellere portatarga selezionando scheda &#39;il controllo dello strumento&#39; e cliccare su &#39;piatto out&#39;.Place piastra a 96 pozzetti sul portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Chiudere il portatarga cliccando su &#39;piatto in&#39; scheda sotto &#39;controllo dello strumento&#39;. Clicca su &#39;leggere la società&#39; dalla barra degli strumenti per eseguire la lettura luminescenti. </li><li> Esportare le misure relative unità luminescente (RLU) per ogni bene ad un foglio di calcolo per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,6 per registrare la proliferazione ogni 24 ore fino a 96 ore dopo la semina cellule. </li></ol> 4. Determinazione Cell Count Utilizzando un cellulare Imager <ol><li> Impostazione di un esperimento di imaging cellulare utilizzando il software imager celle multi-mode <ol><li> Accendere imager cella multi-mode e aperto esimoe software. </li><li> Nel &#39;task manager&#39;, selezionare la scheda &#39;esperimenti&#39; e &#39;creare new&#39;.On il&#39; &#39;barra degli strumenti, fare clic su&#39; file &#39;scheda e aperto&#39; protocollo procedura di set &#39;tab.Select&#39; temperatura azione &#39;. Impostare incubatore per &#39;on&#39; e impostare la temperatura a 37 ° C e verificare &#39;preriscaldamento&#39; prima di continuare con scatola passo successivo &#39;. Fare clic su &#39;OK&#39; per salvare le impostazioni. </li><li> Selezionare l&#39;azione &#39;leggere&#39;. Clicca sul metodo di rilevazione &#39;immagine&#39;, selezionare &#39;endpoint / cinetica&#39; di leggere il tipo e il tipo di ottica &#39;filtri&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39;.Click sulla&#39; scheda piatto pieno &#39;e selezionare pozzetti sulla piastra di essere ripreso. Fare clic su &#39;OK&#39; per salvare le impostazioni. </li><li> Selezionare l&#39;obiettivo 2.5X dal menu a tendina opzioni &#39;obiettivi&#39;. Nella scheda &#39;canali&#39;, selezionare due canali: GFP 469, 525 e campo luminoso. Controllare l&#39;esposizione &#39;auto&#39; per entrambi i canali e selezionare bene l&#39;auto-esposizione. </li><li> Per determinare auto le impostazioni di messa a fuoco, selezionare &#39;auto-focus&#39; e cliccare su &#39;opzioni&#39;. Per le opzioni di auto-focus, selezionare il metodo di &#39;eseguire la scansione e poi messa a fuoco automatica&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39; per salvare le impostazioni. </li><li> Impostare l&#39;orizzontale e l&#39;offset dal centro di benessere (micron) verticale per 0.Select per acquisire più immagini per bene in un montaggio 3 x 2, con spaziatura orizzontale (micron) = 2.881 e spaziatura verticale (micron) = 2.127. Fare clic su &#39;OK&#39; per salvare le impostazioni della procedura. Nota: Vedere la Tabella 2 per i parametri di lettura. </li></ol></li><li> Esecuzione Leggi Esperimento sulla piastra selezionati <ol><li> Fare clic sulla scheda &#39;controllo dello strumento&#39; e selezionare il &#39;piatto fuori&#39; function.Place piastra da 96 pozzetti in portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Nella scheda &#39;controllo dello strumento&#39;, selezionare il &#39;piatto in&#39; funzione. Seleziona &#39;di leggere la società&#39; dalla scheda piatto. Ripetere leggere ogni 24 ore fino a 96 ore post-semina. </li></ol></li><li> Analisi del conte cella utilizzando ilCellulare Imager Software. <ol><li> Per analizzare un&#39;immagine, fare clic sulla scheda &#39;&#39; i dati sulla lastra esposta, &#39;immagine [GFP 469, 525 + Campo chiaro]&#39; selezionare. Fare doppio clic su una ripreso bene. </li><li> Clicca su un&#39;immagine caricata. Seleziona &#39;analizzare&#39; per selezionare una singola immagine del montaggio da analizzare. Fare clic su &#39;OK&#39;.Check il&#39; GFP &#39;solo canale, e dei parametri impostati come indicato nella tabella 3. Fai clic su&#39; Start &#39;per applicare i parametri alle cellule imaged. </li><li> Osservare la maschera conteggio delle cellule posta sopra le celle imaged, che viene utilizzato per determinare il numero di cellule per immagine. Fare clic su &#39;applicare le modifiche&#39; e mantenere queste impostazioni per ogni lastra esposta per tutto l&#39;esperimento. </li><li> Una volta tornati in lastra esposta, cliccare sul menù a &#39;dati&#39; menu a tendina e selezionare &#39;conta delle cellule&#39;. Questo genera il numero totale di cellule per pozzetto. </li><li> Esportare tutti i dati in un foglio di calcolo, fare clic sulla scheda &#39;esportazione&#39; per ulteriori analisi of i conteggi delle cellule per pozzetto. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo protocollo sono state esaminate tre diversi metodi di misurazione proliferazione delle cellule in cellule in coltura. Ogni metodo era capace di misurazioni riproducibili e precise di proliferazione cellulare su 96 ore, ei risultati erano confrontabili tra ciascuno dei metodi testati (Figura 2 e 3). Sia il test di luminescenza-based e metodo di imaging cellulare prodotto i risultati più robusti, mostrando incremento lineare nella proliferazione cellulare dopo 96 ore (Figura 2b,...

Il gene soppressore del tumore, p53, è un regolatore essenziale di un certo numero di processi cellulari, tra cui l&#39;arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza 1. E &#39;responsabile del mantenimento della stabilità genomica, ed è quindi fondamentale per mantenere l&#39;equilibrio di morte cellulare e la crescita delle cellule. Le mutazioni nel p53 sono comuni nel cancro e sono la principale causa di p53 l&#39;inattivazione porta al cancro incontrollata proliferazione cellulare 2. È interessante notare che mutazioni in p53 rappresentano solo circa il 25% dei tumori al seno 3, suggerendo che altri meccanismi sono responsabili per la perdita della funzione di p53. Le isoforme p53 recentemente scoperte hanno dimostrato di essere sovraespresso in un certo numero di tumori umani, e possono modulare la funzione p53 4,5. Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;isoforma p53, Δ40p53, è l&#39;isoforma più altamente espresso nel cancro al seno, ed è significativamente upregulated in cellule del cancro al seno, rispetto al normale tiss adiacenteue 6. A seguito di questo, abbiamo stabilmente trasdotto linea di cellule di cancro al seno umano MCF-7 per iperespressione Δ40p53 con il Lego-IG2-puro + vettore (GFP +) 7. Queste cellule sono stati usati per indagare se elevata espressione Δ40p53 aumenta i tassi di proliferazione cellulare in cellule di cancro al seno. Ci sono molti metodi diretti e indiretti di misurazione proliferazione cellulare di cellule coltivate in vitro 8,9. Questi possono essere eseguite sia come misurazioni in continuo nel tempo, o saggi come endpoint 10. I metodi convenzionali sono ancora utili, come ad esempio il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Questo test è un basso costo e la misura diretta del numero di cellulare, ma non si basano su grandi conta delle cellule e la formazione altamente qualificata per ridurre al minimo errore e di grandi dimensioni standard di scostamenti dalle conta. La necessità di effettuare misurazioni compatibili con formati ad elevata capacità ha portato allo sviluppo di saggi multipozzetto-piastra. Questi test di luminescenza a base di misure il numero di cellule in base a un segnale di luminescenza che è proporzionale all&#39;attività metabolica delle cellule 11,12. Più recentemente, l&#39;introduzione di piattaforme di imaging ad alto contenuto ha consentito di nuovi strumenti che controllano la proliferazione cellulare, fornendo raccolta dati fenotipica quantitativa e qualitativa, e comprende una varietà di sistemi 13. Tutti questi metodi forniscono vie per misurare la crescita delle cellule, mediante saggi di misura o endpoint continue, e ciascuno possiedono una serie di vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la sensibilità, throughput numero di campioni, e informazioni di cellule, ciascuno dei quali può essere pesato conseguenza seconda sulla domanda di ricerca. Questo protocollo descrive tre metodi diversi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, con ogni metodo utilizzando diverse gamme di sensibilità, riproducibilità e formati lastra multi-pozzetto. Questo protocollo prova a confrontare l&#39;uso di un cha conteggio emocitometromber, un saggio luminescenza basato vitalità cellulare, e imager cellulare, nella misurazione della proliferazione cellulare su un corso di tempo 96 ore. Per fare questo, la crescita delle cellule trasdotte vettori (MCF-7-Lego) è stato confrontato con cellule trasdotte la sovraespressione Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizzando tre diverse densità di cellule. La proliferazione cellulare è stata misurata ogni 24 ore per un massimo di 96 ore. Ogni metodo ha dimostrato di avere i propri vantaggi e svantaggi, e in funzione dello scopo dell&#39;esperimento, ognuno ancora è un metodo utile per fornire informazioni sul tasso di proliferazione.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Integrato con il 10% di FBS, 200 mM di L-glutammina, 2 & micro; g/ml di insulina e 1 &micro; g/ml di puromicina</td></tr><tr><td>L-glutammina soluzione (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% soluzione di tripsina-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Diluire a 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale, 75 cm2 area di crescita</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Contatore cellulare automatizzato</td></tr> piastra <tr><td>multipozzetto a 96 pozzetti, </td><td></td><td></td> Emocitometro Neubauer migliorato Nunc 167008 <td></td></tr><tr><td></td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Saggio basato sulla luminescenza</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate Reader per luminescenza, fluorescenza e imaging cellulare in campo chiaro</td></tr><tr><td>Software di analisi dati Gen5</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in breast cancer linee cellulari

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

La misurazione della proliferazione cellulare può essere eseguita con una serie di metodi diversi, ciascuno con diversi livelli di sensibilità, riproducibilità e compatibilità con la formattazione ad alto rendimento. Questo protocollo descrive l'uso di tre diversi metodi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, tra cui la camera di conteggio dell'emocitometro convenzionale, un test basato sulla luminescenza che utilizza la variazione dell'attività metabolica di cellule vitali come misura del numero relativo di cellule e un imager cellulare multimodale che misura il numero di cellule utilizzando un algoritmo di conteggio. Ogni metodo presenta i propri vantaggi e svantaggi per la misurazione della proliferazione cellulare, tra cui tempo, costi e compatibilità ad alto rendimento. Questo protocollo dimostra che ogni metodo è in grado di misurare con precisione la proliferazione cellulare nel tempo ed è sensibile nel rilevare la crescita a diverse densità cellulari. Inoltre, la misurazione della proliferazione cellulare utilizzando un imager cellulare è stata in grado di fornire ulteriori informazioni come la morfologia, la confluenza e ha consentito un monitoraggio continuo della proliferazione cellulare nel tempo. In conclusione, ogni metodo è in grado di misurare la proliferazione cellulare, ma il metodo scelto dipende dall'utente.

Per studiare diversi metodi di misura della proliferazione delle cellule in coltura, la proliferazione delle cellule di MCF-7-Δ40p53 cellule trasdotte stata confrontata alla non trasdotte MCF-7-Lego linea cellulare di tumore al seno. I tre metodi che sono stati confrontati - il metodo di imaging emocitometro convenzionale, test di luminescenza vitalità cellulare, e la cella analisi-sono illustrate nel diagramma schematico (figura 1). Ogni metodo presenta vantaggi e svant...

Questo protocollo descrive l'uso di tre diversi metodi per analizzare la proliferazione cellulare nelle linee cellulari di cancro al seno. Ciò include l'uso del conteggio cellulare convenzionale, la vitalità cellulare basata sulla luminescenza e il conteggio cellulare attraverso l'uso di un imager cellulare. Ognuno di essi offre vantaggi per la misurazione riproducibile della proliferazione cellulare.

Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

L'obiettivo generale di questa dimostrazione è confrontare tre diversi saggi di proliferazione cellulare e presentare i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, come ad esempio l'utilizzo del metodo di proliferazione cellulare più appropriato. La preparazione di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi che coinvolgono l'imager cellulare sono difficili da apprendere.È necessario concentrarsi sulle cellule prima di applicare la maschera appropriata per il conteggio cellulare. Per iniziare questa procedura, coltivare due linee cellulari MCF-7 per tre giorni fino a una confluenza del 75-80% nei flaconi per colture cellulari di 75 cm² utilizzando DMEM privo di rosso fenolo. Dopo tre giorni, rimuovere le cellule dai flaconi versando il mezzo in un contenitore per rifiuti.Quindi, lavare immediatamente lo strato cellulare con due millilitri di tripsina pre-riscaldata al doppio. Aspirare la tripsina e aggiungere altri due millilitri di tripsina pre-riscaldata allo strato cellulare prima di posizionarlo in un incubatore. Una volta che le cellule si sono staccate, lavarle con 10 millilitri di DMEM fresco addizionato e riscaldato.Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, aspirare con attenzione e smaltire il soprannatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di DMEM fresco supplementato.Per eseguire un conteggio cellulare, diluire 100 microlitri della sospensione cellulare in 900 microlitri di DPBS 1x. Successivamente, posizionare un nuovo sensore da 60 micrometri sul contatore cellulare automatico. Premere e tenere premuto il pistone ed immergere il sensore nella sospensione cellulare diluita.Rilasciare lentamente la leva del contatore cellulare. Successivamente, rimuovere il sensore dal contatore cellulare al termine dell'operazione. Seminare le cellule in un volume finale di 100 microlitri in una piastra a 96 pozzetti a una confluente di circa il 20% per lasciare spazio alla crescita cellulare e alla misurazione della proliferazione nell'arco di tre-cinque giorni.Per determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro, preriscaldare sia il mezzo che la tripsina a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari, in un forno o in un bagno termico. Successivamente, aspirare il mezzo dalle cellule e trasferirlo in un contenitore per rifiuti. Quindi, lavare una volta con 30 microlitri di tripsina due volte e aspirare nuovamente il mezzo nel contenitore per rifiuti.Successivamente, lavare nuovamente le cellule con 30 microlitri di tripsina doppia, e incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Toccare delicatamente il bordo della piastra per staccare le cellule. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di DMEM integrato e mescolare le cellule mediante pipettaggio fino a ottenere una sospensione di cellule singole.Posizionare il vetrino coprioggetto sulle camere di conteggio e fissarlo fino a quando si osservano gli anelli di rifrazione di Newton tra i bordi del vetrino e l'elocitometro. Successivamente, pipettare delicatamente 20 microlitri della sospensione cellulare sotto il vetrino coprioggetto e lasciare che la camera di conteggio si riempia per azione capillare. Infine, osservare le camere di conteggio disposte in configurazione a griglia con un ingrandimento di 10x.In questa procedura, scongelare il reagente luminescente in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 30 minuti. Invertire delicatamente il flacone più volte per ottenere una miscela omogenea. Successivamente, equilibrare una piastra di cellule seminate a temperatura ambiente per 30 minuti.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di reagente chemiluminescente a ciascun pozzetto. Mescolare il contenuto su un agitatore orbitale per due minuti. Quindi, lasciare incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.Per impostare un esperimento di luminescenza utilizzando il software del lettore di piastre multimodale, accendere il lettore di piastre multimodale e aprire il software. Nel Task Manager, selezionare Esperimenti e Crea Nuovo. Quindi, selezionare File dalla barra laterale e, nella scheda Protocollo, selezionare Procedura.Successivamente, selezionare "Greiner 96 a fondo piatto" come tipo di piastra e selezionare la casella Usa coperchio. Selezionare l'azione Lettura nella casella Metodo di lettura, quindi selezionare Luminescenza come metodo di rilevamento e fare clic su OK. Nella casella Passaggio di lettura, selezionare le pozzette da scansionare nella scheda Piastra intera e selezionare le pozzette da utilizzare come pozzette di bianco.Impostare il set di filtri su Filtro vuoto. Impostare il guadagno a 135, con un tempo di integrazione di 5 secondi per pozzetto e un'altezza di lettura di 6,5 millimetri. Fare clic su OK per salvare le impostazioni per la lettura della luminescenza.Per eseguire una lettura di luminescenza, espellere il supporto per piastre selezionando la scheda Controllo Strumento e fare clic su Piastra Fuori. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto, assicurandosi che il coperchio sia al suo posto. Chiudere il supporto per piastre facendo clic su Piastra Dentro nella scheda Controllo Strumento.Quindi, fare clic su Leggi ora nella barra degli strumenti per eseguire una lettura luminiscente. Successivamente, esportare le misurazioni RLU per ciascun pozzetto in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Per configurare un esperimento di imaging cellulare, accendere l'imager cellulare multimodale e aprire il software.Nel Task Manager, selezionare la scheda Esperimenti e quindi Crea Nuovo. Sulla barra degli strumenti File, fare clic sulla scheda Protocollo e successivamente sulla scheda Procedura. Selezionare l'azione Imposta Temperatura.Impostare l'incubatore su Acceso e la temperatura a 37 gradi Celsius. Selezionare Riscaldamento preliminare, quindi fare clic su OK per salvare le impostazioni. Successivamente, selezionare l'azione Lettura.Fare clic su Immagine come metodo di rilevamento. Quindi, selezionare il tipo di lettura Endpoint/Kinetica e il tipo ottico Filtro, e fare clic su OK. Successivamente, fare clic sulla scheda Piastra Completa e selezionare le pozzette della piastra da acquisire. Fare clic su OK per salvare le impostazioni.Ora, selezionare l'obiettivo 2,5x dall'opzione a discesa Obiettivi. Nella scheda Canali, selezionare GFP 469,525 e Campo chiaro. Abilitare l'Esposizione automatica per entrambi i canali e selezionare la pozzetta per l'esposizione automatica.Per determinare le impostazioni dell'autofocus, fare clic su Opzioni. Per le opzioni di autofocus, selezionare il metodo Scansione e quindi autofocus. Fare clic su OK per salvare le impostazioni.Successivamente, impostare su zero l'offset orizzontale e verticale rispetto al centro del pozzetto. Selezionare la scansione di più immagini per pozzetto in un montaggio tre per due. Quindi, fare clic su OK per salvare le impostazioni della procedura.Per leggere l'esperimento sulla piastra selezionata, fare clic sulla scheda Controllo strumento e selezionare la funzione Estrazione piastra. Posizionare una piastra a 96 pozzetti sul supporto per piastre, assicurandosi che il coperchio sia chiuso. Nella scheda Controllo strumento, selezionare la funzione Inserimento piastra.Successivamente, selezionare Leggi ora dalla scheda della piastra e ripetere la lettura ogni 24 ore, fino a 96 ore dopo la semina. Per analizzare un'immagine, fare clic sulla scheda Dati della piastra immaginata e selezionare Immagine GFP 469, 525 più Campo chiaro. Quindi, fare doppio clic sul pozzetto immaginato.Ora, fare clic su un'immagine caricata. Selezionare Analizza, quindi selezionare l'immagine singola del montaggio da analizzare. Successivamente, fare clic su OK. In seguito, verificare esclusivamente il canale GFP e impostare i parametri come indicato nella Tabella 3.In seguito, fare clic su Avvia per applicare i parametri alle cellule immaginate. Osservare la maschera di conteggio cellulare posizionata sulle cellule immaginate, che viene utilizzata per determinare il numero di cellule per immagine. Fare clic su Applica modifiche e mantenere queste impostazioni per ogni piastra immaginata nell'intero esperimento.In questa figura, &egrave; stata eseguita un'analisi di regressione lineare per confrontare le relazioni correlative tra i diversi metodi esaminati per la misurazione della proliferazione cellulare nelle cellule MCF-7-LeGO e nelle cellule MCF-7-delta 40p53. &Egrave; stato calcolato un coefficiente di correlazione di Pearson e &egrave; stata determinata la significativit&agrave; tra i diversi metodi di misurazione della proliferazione cellulare. La correlazione pi&ugrave; forte &egrave; stata osservata nel confronto tra il saggio basato sulla luminescenza e l'imager cellulare.Qui sono mostrate le immagini rappresentative di cellule tumorali del seno MCF-7-LeGO e MCF-7-delta 40p53 positive per GFP, acquisite mediante l'imager cellulare ogni 24 ore fino a quando le cellule raggiungono una confluenza prossima al 100%. Questo metodo fornisce informazioni cellulari utili, tra cui la possibilità di monitorare visivamente la crescita cellulare per diversi giorni e confrontare dimensioni cellulari e morfologia tra diverse linee cellulari. Di seguito è riportata una sintesi dei vantaggi e degli svantaggi di ciascun metodo testato, che dimostra la versatilità di ciascun approccio e aiuterà i lettori a scegliere il metodo più appropriato.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di tre diversi saggi di proliferazione cellulare e dovresti essere in grado di determinare quale si adatta meglio al tuo disegno sperimentale.

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Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Il successo delle tinture di tracciamento cellulari per monitorare la funzione immunitaria e la proliferazione cellulare coinvolge diversi passaggi critici. Si descrivono metodi per: 1) ottenendo luminoso, uniforme, riproducibile etichetta-re con coloranti membrana; 2) selezionando fluorocromi e condizioni di acquisizione dati, e 3) la scelta di un modello per quantificare la proliferazione cellulare basata sulla diluizione colorante.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

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Co-coltura di cellule BC: coltura di cellule di cancro al seno con frammenti ossei per studiare la proliferazione delle cellule tumorali

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