Generazione di un vaccino multivalente con vescicole della membrana esterna

Prendiamo i poliplessi di trasfezione contenenti plasmidi bersaglio legati a un polimero. I plasmidi codificano un antigene virale fuso con un tag peptidico e un tag di affinità.

Incubare i poliplessi con cellule di mammifero, che internalizzano i poliplessi all'interno degli endosomi.

Il polimero induce la rottura delle vescicole. I plasmidi rilasciati esprimono l'antigene virale, che viene secreto extracellulare.

Raccogliere il surnatante contenente l'antigene e i contaminanti. Aggiungere un agente concorrente a bassa concentrazione.

Caricarlo su una colonna per cromatografia di affinità.

I tag di affinità si legano alla resina della colonna, immobilizzando l'antigene, mentre l'agente concorrente diminuisce il legame non specifico.

Far fluire l'agente concorrente a bassa concentrazione, rimuovendo i contaminanti debolmente legati.

Lavare con concentrazioni crescenti di agenti concorrenti per spostare gli antigeni fortemente legati, eluendoli.

Introdurre vescicole batteriche della membrana esterna, o OMV, con una proteina catturante legata alla superficie e incubare.

I tag dei peptidi antigenici si legano alle proteine catturanti, formando un vaccino OMV con un display di antigene multivalente.

Esegui la purificazione OMV SpyCatcher. Iniziare con la centrifugazione della soluzione batterica. Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi concentrarlo utilizzando una colonna a fibre cave. Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi centrifugarlo a 150.000 volte g a 4 gradi Celsius per due ore utilizzando un'ultracentrifuga e scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere le precipitazioni con PBS e conservarle a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire la trasfezione RBD-SpyTag, iniziare con la selezione di un sistema di espressione eucariotico appropriato e coltivare le cellule durante la notte a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius dopo il recupero. Aggiungere 20 microlitri HEK293F di soluzione cellulare nel contatore automatico di cellule. Registra il numero di celle. Regolare la concentrazione a 1 volta 10 al sesto di cellule per millilitro, quindi coltivare le cellule a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per 4 ore.

Filtrare il plasmide RBD-SpyTag attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri e aggiungere 300 microgrammi di plasmidi nel terreno di coltura cellulare fino a raggiungere il volume finale di 10 millilitri. Agitare per 10 secondi. Riscalda il PEI a 65 gradi Celsius a bagnomaria. Mescolare 0,7 millilitri di PEI con 9,3 millilitri di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 secondi.

Aggiungere la soluzione plasmidica alla soluzione PEI. Agitare la miscela a intermittenza per 10 secondi e incubarla a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere la miscela a 280 millilitri di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per 5 giorni.

Quindi, eseguire la purificazione RBD-SpyTag. Iniziare con la centrifugazione delle celle a 6.000 volte g a 25 gradi Celsius per 20 minuti. e utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante. Costruire la colonna con 2 millilitri di agarosio nichel-NTA e lavarla tre volte con PBS.

Aggiungere l'imidazolo nel surnatante cellulare per ottenere la concentrazione finale di 20 millimolari e caricare il surnatante cellulare. Aggiungere 3 volumi di colonna di PBS contenenti 20 millimolari di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio. Eluire in gradiente con tre volumi di colonna di PBS contenenti concentrazioni da basse ad alte di imidazolo. Eluire due volte per ogni concentrazione.

Per determinare la concentrazione proteica con il metodo BCA, diluire in serie la soluzione proteica standard di BSA da 2 a 0,0625 milligrammi per millilitro. Diluire 10 volte OMV SpyCatcher e RBD-SpyTag purificati. Quindi, mescolare le soluzioni di lavoro BCA A e B con un rapporto di 50 a 1. Aggiungere la soluzione proteica diluita e mescolare con la soluzione di lavoro BCA. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Misurare l'assorbanza a 562 nanometri di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard.

Per eseguire la bioconiugazione di OMV SpyCatcher e RBD-SpyTag, mescolare OMV SpyCatcher in RBD-SpyTag in PBS con un rapporto di 40 a 1. Ruotare verticalmente per frullare la miscela durante la notte a 15 rotazioni al minuto a 4 gradi Celsius. Eseguire la purificazione di OMV RBD utilizzando la soluzione PBS utilizzando una procedura simile alla purificazione OMV SpyCatcher.